人类肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析

该方法有助于解答病理学和免疫组织化学领域中的关键问题。此技术的主要优势在于速度足够快，且能够生成高质量的数字图像。首先，在室温下将一块3×3厘米的组织样本用4%多聚甲醛固定24小时。

第二天，在室温下用梯度乙醇进行脱水处理，随后用100%二甲苯浸洗三次，每次处理20分钟。最后一次二甲苯处理后，将组织置于63°C的石蜡中孵育30分钟，接着在新鲜的63°C石蜡中再次浸入45分钟，然后更换石蜡一次，进行最后1小时的孵育。待石蜡冷却后，使用旋转式切片机对石蜡包埋的组织样本切取5微米厚的切片，并将切片收集到涂有20微克/毫升多聚-L-赖氨酸的载玻片上。

脱蜡步骤：将切片置于65摄氏度的烘箱中孵育2小时，随后浸入二甲苯中15分钟，再在100%二甲苯中浸泡15分钟，然后通过梯度乙醇溶液进行脱水处理。抗原修复步骤：将切片放入抗原修复盒中，并向盒内加入300毫升柠檬酸修复液。将修复盒放入微波炉中，先高火加热2分钟，随后调至低火持续煮沸6分钟。

当载玻片冷却至室温后，在室温下于旋转摇床上用0.01摩尔PBS溶液洗涤组织样本，每次5分钟，共洗涤三次。为消除内源性过氧化物酶活性，将载玻片置于湿盒中，室温下用3%过氧化氢的双蒸水溶液孵育30分钟。孵育结束后，按前述方法洗涤载玻片，然后在每个组织切片上加100微升10%山羊血清，于37摄氏度封闭非特异性结合位点，孵育39分钟。

接下来，每张切片加入 100 微升抗 ZWINT 抗体，在 4 摄氏度下孵育过夜，随后用 0.01 摩尔 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，将切片在 37 摄氏度下与适当的二抗孵育 30 分钟，再用 0.01 摩尔 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，向切片加入 300 微升新鲜 DAB 溶液，孵育 10 分钟，随后用室温自来水冲洗 10 秒。

将组织在室温下用苏木精染色液染色2分钟，随后用自来水冲洗15分钟，然后依次通过梯度乙醇进行脱水，再在室温下用二甲苯浸洗两次，每次15分钟。最后一次100%乙醇处理后，取15微升含5%二甲苯的中性树胶溶液封片，并用盖玻片覆盖每个组织样本。如需对切片进行全自动全片扫描，需先将载玻片在室温下干燥12小时，以充分干燥组织样本。

接下来，在全自动玻片扫描仪中手动选择明场模式，并进入手动扫描界面。修改玻片名称，并为图像选择存储路径。设置扫描区域，并使用“用户设定阈值”选项选择待扫描样本。

阈值约为50，扫描区域扩展值为200微米。设置扫描焦距值，选择自动对焦和单层模式，然后将载玻片加载到工作站上并开始自动扫描。当所有载玻片扫描完成后，保存图像以供后续分析。

为了分析肺组织切片的图像，打开组织病理学图像分析软件，并选择本地计算机以载入包含扫描数据的文件。选择合适的缩放级别，使用“切换颜色调整”功能将颜色设置为最佳对比度，然后在每张图像上圈出并命名感兴趣的区域。接下来，在插件菜单中选择质量控制（QC），场景构建器将弹出。

选择密度定量（Density Quant）并调整检测条。调节评分等级，直至圈选区域的染色强度与原始图像相似，然后将模型存储并命名为新文件，再将该模型应用于其他切片，并选择“选定注释”（Selected Annotation），以使软件自动计算每张图像中感兴趣区域的 APE 评分。对非小细胞肺癌标本的肿瘤组织及相邻非肿瘤肺组织切片进行全切片数字扫描，可获得高质量的数字图像。

从这些类型的肺癌样本计算出的 APE 评分通常显著高于相邻非癌组织的评分。此外，鳞状细胞癌组织切片中的 ZWINT 表达水平通常也显著高于腺癌组织样本中的表达水平。在进行该操作时，务必注意在制备病理扫描切片时，应确保肿瘤或肿瘤区域具有高质量。

采用此方法后，可进一步实施其他显微镜技术以回答更多科学问题。该技术既不涉及其他病理扫描方法，也为病理扫描领域的研究人员探索数字诊断用于科研目的铺平了道路。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时应始终采取防护措施，例如佩戴口罩。