Name: 人肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习人肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析方法，通过全切片扫描和图像分析技术获取高质量数字图像。该方法为癌症病理学研究提供可靠工具，有助于深入理解ZWINT在肺癌发生发展中的作用机制。

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本项目得到国家自然科学基金（编号：81500151、81400121、81270607、81541027 和 81501352）以及湖北省自然科学基金（中国）（编号：2017CFB631）的支持。作者感谢武汉谷歌生物科技有限公司郭琴、常敏、李辉及其同事提供的技术支持。同时感谢 Muhammad Jamal 在语言润色方面的帮助。

本文所描述的所有方法均经武汉大学中南医院和武汉大学人民医院伦理委员会批准。
1. 免疫组化切片的制备
<ol>
	<li>将人肺组织碎片（约3 x 3 cm）浸入含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定24小时。</li>
	<li>将组织在80%、95%和100%乙醇中分别于室温下脱水15分钟、20分钟和20分钟。最后，将组织在100%二甲苯中浸泡3次，每次20分钟，室温下进行。</li>
	<li>包埋时，将组织浸入石蜡（63 °C）中30分钟。更换石蜡，再次将组织浸入45分钟。最后，再次更换石蜡，将组织继续浸入1小时。</li>
	<li>使用旋转式切片机将组织切成5 µm厚的切片，并置于经20 µg/mL多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。</li>
	<li>脱蜡时，将切片置于65 °C烘箱中2 h，然后将切片浸入二甲苯中15 min，再在100%二甲苯中浸泡15 min。</li>
	<li>将带有组织切片的载玻片先后浸入100%乙醇中水化2次，每次5分钟；随后依次在95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中梯度水化，每次处理5分钟。</li>
	<li>进行抗原修复。
	<ol>
		<li>将柠檬酸修复液（20倍浓缩）用双蒸水稀释至1倍浓度2O (ddH₂O)2O</li>
		<li>将载有组织切片的玻片与1x柠檬酸修复液（300 mL）放入抗原修复盒中，先在微波炉中高火加热2分钟，随后调至低火持续沸腾6分钟。</li>
		<li>让切片自然冷却至室温。</li>
		<li>将柠檬酸修复液替换为0.01 M PBS，于室温在旋转摇床上洗涤切片3次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消除内源性过氧化物酶。
	<ol>
		<li>稀释30%的H2O2 至3% ddH₂O2将样品加入载玻片中（确保覆盖所有组织），并在湿盒中室温孵育30分钟。 
		注意：湿盒是一个10 cm × 15 cm的塑料盒，可盛装水。</li>
		<li>在室温下，用0.01 M PBS在旋转摇床上孵育切片，每次5分钟，共洗涤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭非特异性抗原。
	<ol>
		<li>用含0.1% Tween 20的PBS（PBST）将浓缩的正常山羊血清稀释至10%山羊血清。</li>
		<li>加入10%的山羊血清至载玻片上，于湿盒中37 °C孵育30分钟。 
		注意：羊血清应覆盖载玻片上的所有组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组织进行染色。
	<ol>
		<li>将切片与兔抗人抗-ZWINT 抗体（1:50）在 4 °C 下孵育过夜。</li>
		<li>在室温下，用0.01 M PBST（1,000 mL PBS中含1 mL 0.1% Tween 20）在旋转摇床上洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>将切片与二抗（抗兔检测系统，1:200）在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>在旋转摇床上用 0.01 M PBST 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为观察免疫染色结果，将切片加入300 µL新鲜的3,3-二氨基联苯胺中，然后在室温下用自来水洗涤切片。 
	注意：染色程度需在显微镜下观察（放大倍数 10X - 40X）。</li>
	<li>对组织进行复染。将切片在室温下用苏木精染色液染色2分钟，然后用自来水冲洗15分钟。 
	注意：在显微镜下（放大倍数10X - 40X），细胞核呈蓝色。若蓝色染色过深，可使用盐酸酒精分化3 - 5秒，随后用自来水冲洗组织约15分钟，直至组织恢复蓝色，以促进组织染色的清晰呈现。</li>
	<li>将切片在室温下依次置于50%乙醇中脱水5分钟，70%乙醇中5分钟，80%乙醇中两次、每次5分钟，95%乙醇中5分钟，最后在100%乙醇中两次、每次5分钟。</li>
	<li>为保证透明效果，将组织切片浸入盛有100%二甲苯的容器中，室温下孵育15分钟，然后转移至另一盛有100%二甲苯的容器中，继续室温孵育15分钟。</li>
	<li>封片时，取50–100 μL中性树胶，加入5%二甲苯混合（避免产生气泡）。取15 μL上述混合液滴加至肺组织切片上，盖上盖玻片封片，并轻轻压出气泡。</li>
</ol>
2. 免疫组化切片的全自动全片扫描
<ol>
	<li>将密封的玻片在室温下干燥 12 小时，以使其充分脱水。</li>
	<li>选择手动明场选项，并进入手动扫描界面。</li>
	<li>修改玻片名称，并为图像选择存储路径。</li>
	<li>设置扫描区域，并选择使用用户设定阈值扫描样本选项。阈值约为 50，扫描区域扩展值为 200 μm。</li>
	<li>设置扫描对焦值，选择自动对焦（范围为 1050 至 2650），最后选择单层模式。</li>
	<li>将免疫组化（IHC）玻片加载到工作站上，并启动自动扫描。 
	注意：确保玻片无破损。保持玻片清洁、透明，避免灰尘、纸屑和过量封片剂残留物附着在玻片上。载玻片和盖玻片应无划痕。请勿使用二甲苯清洁玻片。玻片尺寸见表 1。</li>
	<li>以 20X、40X 或 100X 放大倍数自动扫描玻片上的整个组织切片。</li>
	<li>在全玻片扫描结束后，收集并存储图像。</li>
</ol>
3. 使用成像软件分析载玻片
<ol>
	<li>启动组织病理学图像分析软件并选择 本地计算机.</li>
	<li>打开存储扫描数据的文件。</li>
	<li>从2X到40X的范围内选择合适的放大倍数。</li>
	<li>调整颜色以设置最佳对比度 通过 切换颜色调整.</li>
	<li>手动圈出并命名每张图像中的感兴趣区域。 
	注意：例如，你可以圈出一个区域并将其命名为 肿瘤区域.</li>
	<li>选择 插件 和 质量控制此时， 情景构建器 弹出。</li>
	<li>选择 密度定量 并调整 检测 巴 
	注意：此步骤应谨慎操作。该金属条 蓝光耐受性 用于调整细胞核的颜色。该标尺 棕色耐受性 用于调整图像中填充颜色的饱和度。调整后的图像结果应与原始图像保持一致。</li>
	<li>调节 评分等级 使圈出区域的染色强度与原始图像相似。 
	注：深棕色表示强阳性，黄褐色表示中等阳性，浅黄色表示弱阳性，白色表示阴性。</li>
	<li>将模型存储并命名为文件。将该模型应用于其他切片并选择 精选注释”.</li>
	<li>让软件自动计算图像中圈出区域的H评分。</li>
</ol>
4. 使用H评分系统对评分进行定量分析9,10
<ol>
	<li>计算免疫染色的阳性细胞百分比及染色强度（0：阴性，1+：弱阳性，2+：中等强度，3+：强阳性）。</li>
	<li>采用评分系统（H-score）计算肿瘤组织及邻近非肿瘤组织的病理学评分。 
	注：H-score =（弱强度染色细胞百分比 × 1）+（中等强度染色细胞百分比 × 2）+（强强度染色细胞百分比 × 3）。因此，若所有细胞均呈强强度染色，则H-score最高为300。</li>
</ol>

<ol><li>Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terf%2FTRIM17+stimulates+degradation+of+kinetochore+protein+ZWINT+and+regulates+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation.</a> The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).</li>
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<li>Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hec1+sequentially+recruits+Zwint-1+and+ZW10+to+kinetochores+for+faithful+chromosome+segregation+and+spindle+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control.</a> Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).</li>
<li>Ying, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Zwint+predicts+poor+prognosis+and+promotes+the+proliferation+of+hepatocellular+carcinoma+by+regulating+cell-cycle-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+prognostic+value+of+ZW10+interacting+protein+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).</li>
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<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
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<li>Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+fully+digital+pathology+slide+archive+by+high-volume+tissue+slide+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning.</a> Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).</li>
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<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+tissue+as+a+control+for+histochemical+and+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining.</a> Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).</li>
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<li>Potts, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+drug+discovery+and+development%3A+multisite+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration.</a> Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).</li>
<li>Tabata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+at+primary+pathological+diagnosis%3A+Validation+of+whole-slide+imaging-based+primary+pathological+diagnosis+at+twelve+Japanese+academic+institutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes.</a> Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).</li>
<li>Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Whole-Slide+Imaging+in+Education%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology%22%5BJournal%5D)">Current Status of Whole-Slide Imaging in Education.</a> Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).</li>
<li>Griffin, J., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+clinical+use%3A+where+are+we+now+and+what+is+holding+us+back%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back?</a> Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

全片扫描因其能够稳健地扫描并生成高质量图像，正成为临床和研究领域的热点话题11,12,13。载玻片扫描显微镜可在数分钟内生成图像11,12,13。通过应用该方法，我们获得了ZWINT免疫组化（IHC）切片的高质量图像，并比较了肿瘤组织与非肿瘤组织之间的H评分。在本方案中，最关键的步骤包括高质量IHC切片的制备、图像采集，以及在病理评分前对肿瘤区域和非肿瘤区域进行准确界定13,14,15,16。
<p cla...

ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）是动粒复合体的必要组分，参与有丝分裂纺锤体检查点1,2,3。已有研究报道，ZWINT 的缺失会导致染色体异常的过早分离1,2,3。近期研究表明，ZWINT 通过促进肿瘤细胞增殖参与多种肿瘤的发生发展4,5。我们先前报道了 ZWINT 在肺癌中的过表达5。目前普遍认为，病理学家使用传统光学显微镜（CLM）分析切片费时且缺乏定量性6,7,8。 此外，储存的玻璃切片可能因老化而损坏，导致先前制作的切片无法重新获取。基于计算机的数字全切片成像（WSI）技术作为一种新兴方法，有望克服这些局限性6,7,8。
为此，我们描述了一种对人肺癌组织中 ZWINT 进行免疫组织化学染色的方法，并结合全切片数字扫描和基于软件的图像分析。该方法的主要优势在于其结果与 CLM 具有良好的一致性。该技术可广泛应用于苏木精-伊红染色（H&amp;#38;E）以及免疫组化、荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）、组织微阵列（TMA）以及药物发现与开发。

<table><tbody><tr><td>全景 MIDI</td><td>3D HISTECH</td><td>Cat: PMIDI-040709</td><td>一款具有卓越功能集的全自动数字切片扫描仪：支持12张切片容量、荧光扫描，以及更多功能。</td></tr><tr><td>QuantCenter</td><td>3D HISTECH</td><td>从公司官方网站下载</td><td>3DHISTECH 图像分析应用的框架平台。</td></tr><tr><td>LEICA RM2235</td><td>Leica Microsystems</td><td>Cat: 14050038604</td><td>新型附件具有更高精度，可方便组织块与刀具的接近操作以及样本定位。</td></tr><tr><td>兔抗人 Anti-ZWINT 抗体</td><td>Abcam</td><td>Cat: ab197794</td><td>用于人肺组织中 ZWINT 的免疫组化分析。</td></tr><tr><td>抗兔二抗</td><td>武汉谷歌生物科技</td><td>Cat:GB23303-1</td><td>用于免疫组化染色的二抗。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>武汉谷歌生物科技</td><td>Cat:G0002</td><td>含有磷酸盐缓冲体系的溶液。</td></tr><tr><td>OLYMPUS CX23</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat:6M87620</td><td>用于检测 H&amp;E 或免疫组化切片的显微镜。</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>上海凌峰化学试剂</td><td>Cat:1330-20-7</td><td>一种无色、易燃液体，用作组织切片制备过程中的溶剂和透明剂。</td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>武汉赛维尔生物科技</td><td>Cat:G1039</td><td>常用于组织学研究，通常使细胞核染成蓝色。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Baitg</td><td>Cat:2005-64-5</td><td>一种山梨醇聚氧乙烯酯类非离子型表面活性剂，由山梨醇经乙氧基化后再与月桂酸结合而成，常用于药理学应用中的去污剂和乳化剂。</td></tr><tr><td>柠檬酸修复液</td><td>武汉赛维尔生物科技</td><td>Cat:G1202</td><td>用于免疫组化过程中固定后抗原的修复。</td></tr><tr><td>LEICA ASP200s</td><td>Leica</td><td>Cat: 14048043626</td><td>专为常规及研究性组织病理学设计，最多可处理200个组织盒。</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia H</td><td>Leica</td><td>Cat: 14039354103</td><td>一种加热式石蜡包埋台，操作简便，控制精确，有助于提高包埋质量、优化工作流程并增强可靠性。</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia C</td><td>Leica</td><td>Cat: 14039354102</td><td>冷台设备，其大工作面可容纳超过60/65个组织盒，配备环境自适应控制模块，确保操作温度始终稳定在-6&amp;deg;C。</td></tr><tr><td>CaseViewer 软件</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人类肺组织中zw10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

本研究的目的是介绍一种对人肺组织进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描与图像分析。数字扫描是一种快速扫描大量玻片并生成高质量数字图像的方法，其结果可与病理学家通过传统光学显微镜（CLM）观察的结果具有一致性。此外，数字图像的可获取性使得同一张切片能够被多人同时观察。同时，玻片的数字图像可存储于数据库中，从而避免了玻璃切片长期保存过程中的退化问题。该技术的局限性如下：第一，需要高质量制备的组织样本，以及无任何损伤或过量封片剂残留的原始免疫组织化学（IHC）切片；第二，在使用软件进行分析前，应由经验丰富的病理学家明确标定肿瘤或非肿瘤区域，以避免在评分过程中对肿瘤与非肿瘤区域产生混淆；第三，操作人员需在整个切片成像的数字化过程中控制色彩还原的一致性。

我们通过免疫组化法（IHC）检测了28对非小细胞肺癌（NSCLC）组织样本（肿瘤组织及相邻非肿瘤组织）中ZWINT的表达水平，其中包括14例鳞状细胞癌（SCC）和14例腺癌（ADC）。全切片数字化扫描提供了高质量的数字图像（图1A）。结果显示，肺癌组织的H评分显著高于相邻非癌组织（P &lt; 0.0001，双尾t检验）（图1A和1B）。此外，我们发现ZWINT在鳞状细胞癌中的表达水平显著高于腺癌（图1C）。
<img alt="肿瘤与非肿瘤组织在10X、40X下的组织学比较；包含数据分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58551/58551fig1....

ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）参与有丝分裂纺锤体检查点及癌症的发病机制。本文介绍一种对人肺癌组织中 ZWINT 进行免疫染色的方法，随后进行全切片数字扫描和图像分析。该方法可提供高质量的数字图像和可靠的结果。

人类肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析

本研究旨在介绍一种人类肺组织免疫染色的方法学，随后进行全切片数字扫描和图像分析……

该方法有助于解答病理学和免疫组织化学领域中的关键问题。此技术的主要优势在于速度足够快，且能够生成高质量的数字图像。首先，在室温下将一块3×3厘米的组织样本用4%多聚甲醛固定24小时。第二天，在室温下用梯度乙醇进行脱水处理，随后用100%二甲苯浸洗三次，每次处理20分钟。最后一次二甲苯处理后，将组织置于63°C的石蜡中孵育30分钟，接着在新鲜的63°C石蜡中再次浸入45分钟，然后更换石蜡一次，进行最后1小时的孵育。待石蜡冷却后，使用旋转式切片机对石蜡包埋的组织样本切取5微米厚的切片，并将切片收集到涂有20微克/毫升多聚-L-赖氨酸的载玻片上。脱蜡步骤：将切片置于65摄氏度的烘箱中孵育2小时，随后浸入二甲苯中15分钟，再在100%二甲苯中浸泡15分钟，然后通过梯度乙醇溶液进行脱水处理。抗原修复步骤：将切片放入抗原修复盒中，并向盒内加入300毫升柠檬酸修复液。将修复盒放入微波炉中，先高火加热2分钟，随后调至低火持续煮沸6分钟。当载玻片冷却至室温后，在室温下于旋转摇床上用0.01摩尔PBS溶液洗涤组织样本，每次5分钟，共洗涤三次。为消除内源性过氧化物酶活性，将载玻片置于湿盒中，室温下用3%过氧化氢的双蒸水溶液孵育30分钟。孵育结束后，按前述方法洗涤载玻片，然后在每个组织切片上加100微升10%山羊血清，于37摄氏度封闭非特异性结合位点，孵育39分钟。接下来，每张切片加入 100 微升抗 ZWINT 抗体，在 4 摄氏度下孵育过夜，随后用 0.01 摩尔 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，将切片在 37 摄氏度下与适当的二抗孵育 30 分钟，再用 0.01 摩尔 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，向切片加入 300 微升新鲜 DAB 溶液，孵育 10 分钟，随后用室温自来水冲洗 10 秒。将组织在室温下用苏木精染色液染色2分钟，随后用自来水冲洗15分钟，然后依次通过梯度乙醇进行脱水，再在室温下用二甲苯浸洗两次，每次15分钟。最后一次100%乙醇处理后，取15微升含5%二甲苯的中性树胶溶液封片，并用盖玻片覆盖每个组织样本。如需对切片进行全自动全片扫描，需先将载玻片在室温下干燥12小时，以充分干燥组织样本。接下来，在全自动玻片扫描仪中手动选择明场模式，并进入手动扫描界面。修改玻片名称，并为图像选择存储路径。设置扫描区域，并使用“用户设定阈值”选项选择待扫描样本。阈值约为50，扫描区域扩展值为200微米。设置扫描焦距值，选择自动对焦和单层模式，然后将载玻片加载到工作站上并开始自动扫描。当所有载玻片扫描完成后，保存图像以供后续分析。为了分析肺组织切片的图像，打开组织病理学图像分析软件，并选择本地计算机以载入包含扫描数据的文件。选择合适的缩放级别，使用“切换颜色调整”功能将颜色设置为最佳对比度，然后在每张图像上圈出并命名感兴趣的区域。接下来，在插件菜单中选择质量控制（QC），场景构建器将弹出。选择密度定量（Density Quant）并调整检测条。调节评分等级，直至圈选区域的染色强度与原始图像相似，然后将模型存储并命名为新文件，再将该模型应用于其他切片，并选择“选定注释”（Selected Annotation），以使软件自动计算每张图像中感兴趣区域的 APE 评分。对非小细胞肺癌标本的肿瘤组织及相邻非肿瘤肺组织切片进行全切片数字扫描，可获得高质量的数字图像。从这些类型的肺癌样本计算出的 APE 评分通常显著高于相邻非癌组织的评分。此外，鳞状细胞癌组织切片中的 ZWINT 表达水平通常也显著高于腺癌组织样本中的表达水平。在进行该操作时，务必注意在制备病理扫描切片时，应确保肿瘤或肿瘤区域具有高质量。采用此方法后，可进一步实施其他显微镜技术以回答更多科学问题。该技术既不涉及其他病理扫描方法，也为病理扫描领域的研究人员探索数字诊断用于科研目的铺平了道路。请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时应始终采取防护措施，例如佩戴口罩。

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