用于分析重组膜蛋白质子周转速率的微型琼脂盐桥电极

该方法有助于研究膜蛋白（如转运蛋白和通道蛋白），可用于分析在不同生理和病理条件下，蛋白质活性与特异性变化所导致的底物转化速率下降情况。该技术的主要优势在于能够最大限度地减少潜在的漂移变异，并可在无氯离子缓冲体系中进行。

并且由于膜电位测量更加精确，显著提高了周转率测定的准确性。准备初始步骤所需的器材，包括两个微毛细移液管尖端、一把锋利的刀片和一个游标卡尺。

准备银丝电极时，需备好砂纸和三摩尔的氯化钾溶液。此外，还需乙醇和水用于清洁，以及直流电源。操作时使用两个微量移液器吸头开始进行。

首先取一个装有缓冲液的吸头，将第二个吸头放置在第一个吸头旁边。移动第二个吸头，使其插入时，其狭窄部分至少深入第一个吸头狭窄部分内五毫米。

标记第一个含缓冲液的尖端将要连接的位置。然后使用卡尺测量微琼脂盐桥电极的长度。使用刀片将尖端切割至适当长度。

用乙醇清洁切割表面，随后用水冲洗。接下来，取一段长约八厘米的银丝作为电极。用擦拭纸蘸乙醇清洁银丝，随后再用水擦拭。

清洁后，使用砂纸打磨一端约一厘米长度的表面，使其光滑。此带有光滑端的导线即可用于电化学镀层。将光滑端浸入氯化钾溶液中，另一端连接直流电源，以进行镀层处理。

包被完成后，断开电极并用水清洗。干燥后，确定电极可插入微毛细管尖端的最深长度，并从无包被一侧将电极剪至适当长度。

接下来，准备含有琼脂糖的盐溶液。在装有水的烧瓶中溶解氯化钾，并使用磁力搅拌器辅助混匀。取出搅拌器后，将琼脂糖加入烧瓶中。

将烧瓶放入微波炉中加热，使琼脂糖在约 100 摄氏度下完全融化。取出后目视检查琼脂糖是否完全溶解。待琼脂糖完全溶解后，缓慢吸取 10 µL 加入微毛细管中，避免产生气泡。

必须小心地将琼脂盐溶液移入微毛细管尖端，尤其是在高浓度琼脂溶液中。若操作不当，尖端内容易产生气泡，从而阻断电流。从移液器上取下尖端后，立即将电极插入其中。

确保电极浸入盐溶液中。当电极处于室温时，将其插入放大器的参比电极接口。固定参比电极，使其可放入盛有1 mL缓冲液的塑料容器中。

接下来，将盐桥电极浸入溶液中。施加电压并检查是否有电流响应，然后继续操作。如果测试成功，则断开电极连接。

如有需要，可将盐桥电极浸入3 mol/L的氯化钾溶液中保存。接下来，准备含有塑料尖端的缓冲液。取一个微量毛细管尖端，找到距离其狭窄部分2厘米的位置。

在此位置使用加热的金属丝将管子弯曲成90度。用锋利的刀具从弯曲处起五毫米处切断管子。先用乙醇、再用水清洗切断的区域。

继续操作前，使用带刻度的光学显微镜测量尖端小孔的直径。接着，将移液器移至溶剂容器和缓冲液容器附近。吸取并排出3 µL溶剂，重复三次。

接下来，用三微升缓冲液填充测量尖端。现在，从氯化钾溶液中取出盐桥。将装有缓冲液的测量尖端插在盐桥电极上。

将盐桥电极和参比电极连接至放大器。此时，将盐桥电极与参比电极一同悬置于缓冲溶液中。本实验配置的示意图如下所示。

实验过程中，膜将在含有缓冲液的移液管末端形成。通过施加三角波交变电压信号以产生矩形交变电流响应，采集数据以测定膜电容。

接下来，找出电流为零时的电导和电压。自动施加一个从负50至50毫伏的电压斜坡，并记录电流。对数据拟合线性函数。

斜率代表电导，x轴截距为零电流时的电压。测量完成后，将测量尖端从盐桥中取出。用缓冲液填充新的测量尖端，并调节至不同的pH值，以在膜两侧建立质子梯度。

更换新的测量探头和电极，重新建立实验装置，以重复测量。以下是存在 pH 梯度时的代表性电流-电压记录，以及在不存在 pH 梯度时的记录。

图中线条表示对数据的线性拟合。不同 pH 值下 x 轴交点的变化可由能斯特方程预测。这些数据代表了标准氯化银电极（白色）和微型琼脂盐桥电极（黑色）的膜电位随时间的变化。

琼脂盐桥电极在300秒的测量过程中更为稳定，最大偏移小于5毫伏。在此电位偏移随pH梯度变化的图中，随着pH梯度的增加，两种电极表现出显著不同的行为。可分别计算并比较两种电极的质子转换速率。

以下是通过盐桥电极与标准电极测得的线粒体解偶联蛋白1（UCP1）的质子周转数。同时提供了类似制备条件下获得的UCP3的数据。使用琼脂盐桥电极测得的速率似乎更为精确。

进行此操作时，需注意确保电极插入琼脂盐溶液中。盐桥也必须浸入缓冲液中。最后，确保琼脂盐溶液中不含气泡。