Name: 小龙虾心脏的连续无创测量与行为活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学习使用近红外光学传感器和视频追踪模块对小龙虾进行无创连续心脏与行为活动监测的方法。该技术适用于神经科学、生态毒理学和生理学领域的长期生理状态评估研究。

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本研究由捷克共和国教育、青年和体育部项目“CENAKVA”（编号：CZ.1.05/2.1.00/01.0024）和“CENAKVA II”（编号：LO1205，国家可持续发展计划I项下）、捷克布杰约维采南波希米亚大学资助机构（项目编号：012/2016/Z）以及捷克科学基金会（编号：16-06498S）资助。

1. 螯虾的选择
<ol>
	<li>为了成功将本方法应用于小龙虾，应选择具有足够头胸甲尺寸（即头胸甲长度至少为30 mm）的成年个体用于传感器安装，目视检查其无疾病症状，并确认在触碰时能同时举起双螯。上述参数表明小龙虾处于适宜的健康状态。 
	注意：若试验中需使用多只小龙虾并使其暴露于相同条件下，实验组的组建应基于以下多个参数：(i) 相近的体重和体长；(ii) 相近的心率；(iii) 明显的夜间活动性；(iv) 正常的摄食行为；(v) 处于蜕皮间期17。有时仅通过心率测量、视觉或触觉检查难以判断小龙虾是否接近蜕皮期；因此，分析其血淋巴总蛋白含量可能具有帮助。预计当小龙虾接近蜕皮期时，其血淋巴蛋白含量高于蜕皮间期18。</li>
</ol>
2. 螯虾心脏活动与行为的记录
<ol>
	<li>为了无创测量小龙虾的心率，需预先为此实验步骤准备传感器。在此之前，将一只小龙虾放入盛有水的水箱中，使其适应环境数天，以作为传感器准备的前置步骤。19 也需要几天时间。
	<ol>
		<li>将红外发光二极管（LED）与光电晶体管进行同轴耦合。将光学传感器电路安装在电路板上，其需要5 V电源供电。连接LED时，在红外传感器电路板上放置一个200 Ω电阻；连接光电晶体管时，在电路板上放置一个220 Ω电阻。</li>
		<li>当传感器连接到小龙虾时，其输出信号会受到小龙虾心肌中血淋巴充盈量的调制，并散射来自LED的入射光。为避免LED发出的红外光与光敏三极管接收到的小龙虾心脏反射红外光之间产生相互干扰，请在LED与光敏三极管之间放置一块黑色防静电塑料小隔板（尺寸为0.5 × 1.5 × 4 mm，厚度 × 高度 × 宽度）。</li>
		<li>将LED置于防水封装中，并在传感器靠近背甲一侧的表面覆盖防水介电凝胶，以保护电子元件免受潜在损伤图1将凝胶干燥3天，以获得最佳保护性能。</li>
		<li>对于模拟信号，将细长的柔性电缆（约3米长）连接至传感器，并接入模数转换器（ADC）；随后，数字化信号将通过USB接口传输至个人计算机，在此通过专用软件实时保存并分析有关螯虾心脏活动的信息（参见 材料表，并储存以供进一步详细分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传感器制备完成后，立即将其连接到螯虾。为此，打开计算机并运行软件。确定需连接传感器并记录心率的螯虾数量，以及需保存至数据文件的信息。</li>
	<li>将小龙虾从水中取出，用纸巾擦拭其背甲侧面。用纸巾包裹小龙虾的螯足和腹部，以避免手部对其造成损伤，并减少因人手温度较高而给小龙虾带来的额外应激。 
	注意： 不要在传感器安装前使用冰块或冷冻机对小龙虾进行预先冷却以使其固定。温度差异会导致小龙虾背部表面渗出液体，进而导致传感器固定不可靠以及粘合剂迅速从虾壳上脱落。</li>
	<li>准备一个表面（例如取一小块平整的塑料片，或撕下一段胶带并固定在桌面上）以及一根用于混合胶水的搅拌棒。从装有环氧胶的A管和B管中各挤出一小滴（直径约0.5 cm），迅速将两滴胶液混合。</li>
	<li>将传感器固定在螯虾的背甲上，寻找心脏信号振幅最大的位置。用一只手握住带传感器的螯虾，另一只空闲的手在传感器的四根辅助导线上各滴一滴混合胶水（在步骤2.1.1至2.1.4之间完成固定）。胶水固化前至少5分钟内不得移动传感器（胶水固化时间取决于环境温度和湿度）。 
	注意： 将传感器固定在螯虾头胸甲上时，应从头胸甲侧面仔细检查整个心脏区域，以确定心脏信号振幅最佳（最大）的部位。这有助于软件提供更精确的心率计算结果。</li>
	<li>用空着的手触碰胶水，若不粘手，则将已去包装且附有传感器的小龙虾放入图2) 放入无水的盒子中继续放置几分钟，直至胶水完全干燥。 
	注意： 小龙虾和胶水操作的最佳温度范围为18至22 °C。在此温度范围内，胶水在5至7分钟内硬化，并在8至10分钟内完全干燥。在较低温度下，小龙虾的应激反应较轻；然而，胶水硬化所需时间更长，在15 °C和10 °C时分别需要约15分钟和20分钟。在较高温度下，尤其是超过25 °C时，胶水可在3分钟内硬化，但小龙虾的应激显著增加；因此，应尽量减少甲壳类动物在无水条件下暴露于极端环境的情况。</li>
	<li>在将螯虾移回水箱之前，将其头胸部多次浸入水中，每次间隔数秒，以排出鳃中积聚的空气， 将小龙虾置于水中约1小时，以去除任何过量的化学物质。此过程完成后，将小龙虾放入水中，并在实验条件下让其适应环境一至两周，具体时间根据观察到的生理指标而定。在适应期间，建议每隔一天进行一次最佳的水体更换。 
	注意： 已适应且处于健康状态的小龙虾特征包括明显的昼夜节律性心脏活动和运动行为、规律摄食，以及在白天大部分时间停留于特定庇护所中（若提供）。</li>
</ol>
3. 相机和软件设置
<ol>
	<li>启动软件，视频摄像头将自动开启。</li>
	<li>选择运动检测选项，仔细检测屏幕上每个水箱的区域&#160;，软件将开始追踪行为并将其与心脏活动记录关联起来。 
	注意： 小龙虾运动检测模块由一个从水箱下方追踪小龙虾行为的视频摄像头和一个将行为与心脏活动结合的软件组成。该模块的数据用于通过排除小龙虾表现出强烈运动活动的时段，从而促进更精确的心脏活动数据处理。小龙虾的突然运动（例如逃避反应或开始摄食）可能导致心脏信号出现波动或短暂的尖峰，从而降低心脏间期计算的精确性。</li>
</ol>

<ol><li>Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+apomorphine%2C+a+dopamine+agonist%2C+on+Daphnia+magna%3A+Imaging+of+swimming+track+density+as+a+novel+tool+in+the+assessment+of+swimming+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity.</a> Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有广泛观点认为，测量某些生理参数（如心率、呼吸频率或二者同时测量）是记录小龙虾反应的一种比评估行为反应更可靠的方法，因为行为反应并不总是立即出现11。然而，显然在评估小龙虾对环境变化的真实反应时，最有效的方法是将心脏活动与行为记录相结合，因为这种方法能够揭示小龙虾心跳变化的原因，以及这些变化究竟是由于周围环境中的化学变化引起，还是由于运动启动所致。在进行水质监测时，必须消除所有外部因素对小龙虾生理指标变化的影响，包括那些会显著影响心率但并不对生物监测系统构成警报的突然运动。
另一种有助于实现更精确、更详尽的心跳评估的方法是分析螯虾心脏活动的变时性和变力性参数，这些参数主要与螯虾心脏信号中的特定波形相关19。此类分析证实，即使心跳每分钟仅变化几个节拍，某些次要参数仍可反映出螯虾心脏活动的显著变化19。
尽管使用上述方法具有诸多优势，但围绕小龙虾监测的研究正朝着最大限度减少对小龙虾触觉操...

水生生物的应用研究，无论是作为各种实验室研究的模式生物1,2，还是作为监测工业及自然/环境水质的工具3,4，均已得到广泛研究。然而，无论人们是否属于科学界或其他职业领域，这一主题对人类而言仍具有显著的重要性。尽管目前已存在多种先进的方法用于监测某些特定参数（即所谓的&#34;生物标志物&#34;）5,6,7,8，但选择指示生物时最重要的要求仍包括三个简单因素：(i) 简便性，(ii) 可靠性，以及 (iii) 普遍可获得性。
小龙虾作为淡水动物的重要代表，因其在全球范围内广泛分布，且在大多数情况下9具有足够大而坚硬的头胸甲，便于操作，因而具有显著特点。这种甲壳类动物属于高等无脊椎动物，其重要的生理系统和相应器官已得到充分发育，同时仍保持相对简单的结构10。
基于科学文献中所述的小龙虾生物学和/或行为学参数范围的评估方法，已显著推动了生物监测及小龙虾研究的整体发展。目前可用的大多数侵入性小龙虾心率测量方法均依赖于心电图记录，此类方法需要复杂且精密的外科手术操作11,12,13；这些操作可能对小龙虾造成显著应激，并需要其进行较长时间的适应。此外，尚不清楚小龙虾能够携带此类电极多长时间，以及在携带此类装置的情况下是否能够顺利完成蜕皮。已有描述的非侵入性方法则基于体积描记法记录，但该方法受限于硬件的复杂性，需要配备用于信号滤波的调理电路14，以及放大装置或精密且昂贵的光学组件15,16。
本研究介绍了一种方法，该方法不仅补充了现有研究成果，还为改进当前的小龙虾心率测量流程提供了新的替代方案。其优势包括：（i）快速且无创的传感器安装方式，无需长时间的生理适应；（ii）小龙虾可在一次蜕皮到下一次蜕皮期间（数月内）持续携带传感器；（iii）配套软件能够实时监测小龙虾的心脏活动和行为表现，并可同步分析多只小龙虾的实验数据；（iv）制造成本低且结构简单。本文所描述的生物监测系统，能够基于小龙虾的生态生理特征变化，实现对其心脏活动和运动行为的无创、连续监测。该系统不仅可广泛应用于实验室中对小龙虾心脏生理学和/或行为学的研究，也可用于工业领域，例如在水处理及供水设施中用于水质监控。

<table><tbody><tr><td>红外LED二极管</td><td>KINGBRIGHT ELECTRONIC</td><td>KP-3216F3C</td><td></td></tr><tr><td>光电晶体管</td><td>EVERLIGHT</td><td>ELPT15-21C</td><td></td></tr><tr><td>电阻器</td><td>ROYAL OHM</td><td>0805S8J0201T5E</td><td></td></tr><tr><td>电阻器</td><td>ROYAL OHM</td><td>0805S8F2200T5E</td><td></td></tr><tr><td>电容器</td><td>KEMET</td><td>C0805C334K5RACTU</td><td></td></tr><tr><td>电缆</td><td>TECHNOKABEL</td><td>FTP KAT.5E 4X2X0,14C</td><td></td></tr><tr><td>连接器</td><td>HARTING</td><td>21348100380005</td><td></td></tr><tr><td>连接器</td><td>HARTING</td><td>21348000380005</td><td></td></tr><tr><td>介电凝胶</td><td>KRAYDEN</td><td>Sylgard 535</td><td></td></tr><tr><td>模数转换器</td><td>TEDIA</td><td>UDAQ-1416CA</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>KUPSITO.SK</td><td>7338723044</td><td></td></tr><tr><td>Kinect视频摄像头</td><td>ABCSTORE.CZ</td><td>GT3-00002</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>捷克布杰约维采南波希米亚大学 渔业与水体保护学院 复杂系统研究所</td><td></td><td>软件链接：www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring&lt;br/&gt; 用户名：frov&lt;br/&gt; 密码：CF2018</td></tr></tbody></table>

连续无创测量小龙虾心脏及行为活动

Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities

小龙虾是一种重要的水生生物，既可作为无脊椎动物行为学和生理学研究的实用生物学模型，也可作为水质状况的有效生物指示剂。尽管小龙虾无法直接指明导致水质恶化的具体物质，但它们能够通过心脏活动和行为活动的急性变化，在数秒内迅速向人类发出水质恶化的预警。
本研究介绍了一种非侵入性方法，由于该方法将简便性与可靠性集于一个模型之中，因此足够简单，可在各种条件下实施。
这种将生物体引入环境评估过程的方法，能够对周围环境中突发的水质恶化提供可靠且及时的预警，从而防止水质急剧下降。因此，本研究探讨了一种基于小龙虾生理学和行为学参数记录的无创系统，用于检测水生环境的变化。该系统目前已应用于一家本地啤酒厂，用于控制&#160;饮料生产用水的质量，但也可用于任何水处理和供水设施，实现水质的连续实时评估，以及开展小龙虾心脏生理和行为的常规实验室研究。

因此，我们获得了小龙虾心脏活动与行为活动的组合数据，并以 txt 格式文件记录和保存（图3）。该文件除包含实验小龙虾的数量、日期和采样率外，还包括三列数据：（1）以 hh:mm:ss 格式表示的连续时间；（2）自动计算得出的心率，单位为每分钟心跳次数（beats per minute）；（3）运动状态，以无运动（0）或有运动（1）表示。当小龙虾无活动时，对应运动的单元格记为零；当其发生移动时，相应单元格则显示为1。在连续记录过程中，数据文件每天在00:00（即午夜12:00 AM）自动生成。将运动信息纳入分析至关重要，因为运动可能引起心率的变化（图4）。在第10秒时，通过蠕动泵将食物气味（研磨、过滤并稀释的摇蚊幼虫）送入盛有小龙虾的水箱中。在第14秒，小龙虾识别到刺激，由于所谓的朝向反应（orienting response），其心率略有下降。在第20秒时，心率开始上升，导致心跳间期缩短。在第26秒，小龙虾向刺激源移动，食物气味引起的生理兴奋以及运动的启...

本文介绍了一种用于持续记录和分析小龙虾心脏活动与运动活动的无创生物监测系统。该系统由近红外光学传感器、视频追踪模块以及用于评估反映小龙虾生理状态并在心率波动期间表征其行为的心跳分析软件组成。

小龙虾是一种重要的水生生物，既可作为无脊椎动物行为学与生理学研究的实用生物学模型，又可作为……

该方法有助于解答环境与生态毒理学领域的关键问题，涉及在各种急性及长期应激条件下心脏活动与运动行为之间的关系。该技术的主要优势在于，小龙虾无需复杂的预处理或长时间适应，且可在数月内持续携带传感器。该技术的应用范围广泛，涵盖病因学、生理学、生态毒理学以及工业应用领域，因为借助小龙虾的无创生物监测可应用于实验室、水处理及供水设施中。尽管该方法可深入研究小龙虾的心脏生理、行为及水质控制，但也可能适用于其他大型淡水和海洋甲壳类动物。通过视觉演示该方法，对于理解基于近红外光的无创传感器在小龙虾心脏检测中的应用，以及基于图像处理的心跳与运动检测模块之间的关联至关重要。在开始实验前数天，应选择甲壳长度至少为30毫米的成年个体标本。检查每个标本是否无疾病，并观察其在受到触碰时是否会抬起两只螯足。然后将健康的小龙虾放入盛有静置自来水的水箱中适应环境，直至手术当天。传感器准备就绪后，立即在计算机上打开传感器软件，输入将要连接传感器并在屏幕上显示的小龙虾数量。设置要显示的小龙虾心率数量。用纸巾擦干第一只动物的背甲。用纸巾包裹小龙虾的螯和腹部，以避免损伤并减少对动物的额外应激。将传感器固定在背甲上，位置应有利于获得最大幅度的心电信号。一手握住龙虾并持住传感器，另一手将一滴新配制的环氧树脂胶滴加到传感器上四个辅助导线上，然后保持传感器不动，让胶水干燥至少五分钟。当胶水触摸起来不再发黏时，将未包裹的螯虾和传感器放入无水的盒子中再放置几分钟，直至胶水完全干燥。在将螯虾移回水箱之前，将头胸部多次浸入水箱水中数秒钟，以排出在鳃中积聚的空气。然后将螯虾留在暂养水箱中约一小时，以清除任何多余的化学物质。然后，将小龙虾放入实验水箱中，在适当的实验条件下适应1至2周，具体条件取决于所观察的生理指标。小龙虾一放入实验水箱，立即启动软件，视频摄像头将自动开启。然后选择运动检测选项，并在屏幕上定位每个水箱，以开始追踪螯虾的行为，并将行为与心脏活动记录相关联。所记录的螯虾心脏活动和行为数据可保存为 TXT 格式文件。在分析中必须包含螯虾的运动情况，因为该活动可能引起心率的变化。例如，在本实验中，实验开始10秒后，通过蠕动泵将食物气味注入水箱。第14秒时，小龙虾识别到刺激，其心率因所谓的定向反应而轻微下降。20秒后，心率上升，导致心脏间期缩短。在26秒时，小龙虾向刺激源移动，食物气味引起的生理兴奋以及运动的启动均导致心率显著上升。在37秒时，观察到小龙虾出现突然的动作，这可能在很大程度上促成了对刺激反应期间心率的升高。事实上，受干扰的小龙虾通常表现出心率增加，且常伴随偶尔的运动行为。然而，即使不动的小龙虾也可能表现出较高的心率，这同样表明其处于明显的应激状态。未受干扰的小龙虾心率特征表现为心跳曲线的振幅单调，且每次心跳峰值之间的心动周期大致相等。在进行该操作时，需注意快速而彻底地安装传感器可减少实验动物的应激反应，从而获得准确的生理特征数据。更先进的监测方法包括完全非接触式小龙虾监测，该方法仅需结合近红外传感器和高灵敏度相机即可测定其心跳频率。该技术问世后，为研究人员在行为学、生理学、繁殖以及无限制小龙虾和其他大型水生无脊椎动物的雌雄同体等领域探索环境及人为因素对生物指示物种的影响开辟了道路。这种无创生物监测方法在捷克共和国已具有非常实际的应用价值，可作为实时水质早期预警监测系统在当地推广应用。尽管水体状态的稳定性持续受到小龙虾生态生理特征动态变化的影响。

continuous-noninvasive-measuring-crayfish-cardiac-behavioral

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

小龙虾心脏的连续无创测量与行为活动

通过将神经生理记录与高速视频技术相结合，可获得自由活动动物神经活动模式的非侵入性测量结果。...

自由活动动物神经环路激活的记录

无脊椎动物表现出一种类似于脊椎动物的自主性交感样反应。通过心血管系统与呼吸系统的协调，可以测量出用于评估生物体内部状态的生物学指标。...

自由活动 crayfish 心率和通气率的测量方法

我们已开发出两种方法，用于在无触觉和化学线索的情况下研究视觉线索对行为的影响。其中一种方法涉及对小龙虾在水族箱中对反光墙壁的反应进行录像；另一种方法则考察由透明隔板后一只活体小龙虾所提供的视觉输入所产生的效应。...

记录小龙虾对镜像反射的行为反应

本实验为学生提供了一种简便的方法，以获得观察肌肉结构、突触反应以及离子梯度和通透性对膜电位影响的经验。此外，还展示了一个感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路，用于演示测试化合物对神经环路作用的方法。...

利用螯虾进行膜电位、突触反应、神经回路、神经调制及肌肉组织学的学生实验

本实验的主要目的是了解初级感觉神经元如何将关节运动和位置信息作为本体感觉信息传递给动物。本报告的另一个目的是通过解剖并在解剖显微镜下观察神经元，展示制备样本的解剖结构。...

小龙虾腹部的肌肉感受器器官：本体感觉教学实验

在本报告中，我们展示了可用于研究小龙虾后肠生物学的技术。我们演示了如何解剖小龙虾腹部，并研究其相关的解剖结构、生理特性以及活动的调控机制。通过使用力传感器来测量节律性蠕动活动及收缩强度。...

使用螯虾后肠进行生理学实验：一项学生实验室练习

我们介绍了一组技术，用于长时间研究自由游动的弱电鱼的自发行为，通过在特制的感官隔离室内的专用鱼缸中，同步且准确可靠地测量动物的电器官放电时间、身体位置和姿态。...

长期行为追踪自由游动的弱电鱼

螯虾感光细胞在光刺激下的脱敏与恢复

本文介绍了对一系列墨西哥洞穴鱼行为进行高通量研究以及对机械感觉系统进行活体染色的方法。这些方法采用免费软件和自制脚本，为行为学研究提供了实用且经济高效的技术方案。...

墨西哥洞穴鱼的行为追踪与神经丘成像

在热应激过程中测量心率，有助于了解生物体因急性环境变化而产生的生理反应。本实验方案以美洲龙虾（Homarus...

用于无脊椎动物晚期心率微创测量的阻抗呼吸描记法

我们描述了一种在模式脊椎动物毛细胞系统中监测传入神经元活动在运动指令期间变化的实验方案。...

斑马鱼游泳过程中后侧线传入神经元的活动

学习使用近红外光学传感器和视频追踪模块对小龙虾进行无创连续心脏与行为活动监测的方法。该技术适用于神经科学、生态毒理学和生理学领域的长期生理状态评估研究。

连续无创测量小龙虾心脏及行为活动

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