Name: 聚丙烯酸/纳米水的气管内灌注积液模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 32 s
Description: 了解利用气管内灌注技术在大鼠体内构建聚丙烯酸/纳米二氧化硅胸腔积液模型的方法。该技术可用于评估纳米材料的肺毒性及其对呼吸系统的影响。

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本研究及本文的制作由国家自然科学基金（项目编号 81773373、81172614 和 81441089）资助。&#160;我们感谢北京朝阳医院急诊科的 Jin Yan 博士&#160;和 Pan Yujie 博士&#160;，以及北京朝阳医院超声医学科的 Qu Peng 博士&#160;在视频制作过程中提供的帮助&#160;。&#160;

本研究遵循中国首都医科大学（北京，中国）关于实验动物护理和使用的指导原则。所有实验程序均经中国首都医科大学动物伦理委员会批准。
1. 实验准备
注意：在给药前，将雌性无特定病原体的Wistar大鼠（体重：200 ± 10 g）置于实验环境中适应一周（环境条件：光照/黑暗周期：12小时/12小时，温度22 ± 2 °C，湿度50 ± 10 %）。
<ol>
	<li>使用新鲜的 10 mL PA/NPSi 悬液（纳米二氧化硅 Ø：20 ± 5 nm，通过原位乳液聚合法制备），分别用生理盐水稀释至 3.125、6.25 和 12.5 mg/mL 的浓度10。给药前，将悬液超声处理 20–30 分钟，并涡旋 10 分钟，以防止纳米颗粒聚集。</li>
	<li>将总共 20 只大鼠平均分为四组：每组分别对应一种 PA/NPSi 浓度（0、3.125、6.25 和 12.5 mg/mL）。</li>
	<li>将大鼠置于含有 1.5 mL 乙醚（99.5%）或其他经 IACUC 批准方案的密闭容器中进行麻醉。麻醉 60–90 秒后，检查其足底反射是否消失，并确保大鼠正常呼吸。</li>
	<li>将麻醉后的大鼠仰卧固定于板上，并用灭菌的尼龙线将其门齿固定在板上。</li>
	<li>使用手术镊和前部透镜辅助打开其口腔，暴露声门裂。</li>
	<li>通过一根带灭菌钝针的细管，向每只大鼠的双侧支气管注入 0.5 mL PA/NPSi 悬液，总计 1 mL。&#160;</li>
	<li>将大鼠仰卧置于塑料板上，使其在 5–10 分钟内缓慢恢复。</li>
</ol>
2. 胸腔积液的超声检查
<ol>
	<li>使用线性阵列换能器（频率：8 MHz）的超声系统，在第1、3、7和14天对大鼠进行检查10。</li>
	<li>对大鼠进行麻醉（10%水合氯醛，0.35 mL/100 g，腹腔注射），并检查其足底反射是否消失。</li>
	<li>使用电动剃须刀去除大鼠胸部和上腹部的毛发，然后将大鼠仰卧位固定于安装板上。</li>
	<li>在皮肤上涂抹耦合剂凝胶，然后将换能器置于肋间间隙和肋下区域，以检测胸腔积液。 
	注意：为准确检测积液，应选择左侧和右侧侧位进行超声检查。</li>
	<li>超声检查后将大鼠仰卧于塑料板上，使其在10分钟内缓慢恢复。</li>
</ol>
3. 胸部CT扫描检测胸腔积液
<ol>
	<li>给药后第7天和第14天，使用10%水合氯醛（腹腔注射）麻醉大鼠。当大鼠对足底反射无反应时，表明麻醉深度已足够。 
	注意：给药后第7天是通过CT扫描观察胸腔积液的最合适时间点。</li>
	<li>将大鼠俯卧于塑料板上，使用64排CT扫描其胸部以检测胸腔积液。扫描参数设置如下：探测器配置为64 mm × 0.625 mm，管电压120 kV（峰值），管电流350 mAs。</li>
</ol>
4. 胸腔积液的采集及胸腔积液中纳米颗粒的分离
<ol>
	<li>大鼠经胸部 CT 扫描并以水合氯醛麻醉后，检查大鼠的足底反射，剃除从腹部至胸部的毛发，然后用碘伏对皮肤进行消毒。</li>
	<li>将大鼠转移至手术区域。</li>
	<li>在麻醉状态下，沿正中线迅速切开皮肤和腹肌 1–1.5 cm 至剑突处，保持膈肌完整。</li>
	<li>小心打开胸腔，在镊子辅助下检查双侧胸膜腔，尤其注意双侧肋膈角区域。使用 2 mL 无菌注射器采集 1–2 mL 淡黄色胸腔积液。</li>
	<li>操作完成后，按照 IACUC 批准的方案处死大鼠。</li>
	<li>将胸腔积液转移至 2 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 15 分钟，以分离纳米颗粒。</li>
	<li>取上层清亮液体一滴，于透射电子显微镜（TEM）下观察，加速电压设为 60–80 kV。</li>
</ol>

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<li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+caused+by+silica%3A+Mechanisms+of+injury+and+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development.</a> International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dosage-toxicity-efficacy+relationship+of+kansui+and+licorice+in+malignant+pleural+effusion+rats+based+on+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).</li>
<li>Ji, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-eight-day+inhalation+toxicity+study+of+silver+nanoparticles+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats.</a> Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于超声成像对胸腔内游离液体具有优异的敏感性，因此它是诊断肺部疾病最便捷的工具11。这是因为超声成像能够立即检测肺部气体与液体之间声阻抗的差异12。此外，与计算机断层扫描（CT）相比，超声成像在小型动物模型中更具灵活性。然而，肺内气体反射声波，阻碍了纳米颗粒滴注后对肺内变化的观察。因此，我们结合胸部CT扫描与肺部超声成像，以研究肺内变化及胸腔积液情况。
在分析影像学数据后，我们发现成像结果非常显著。首先，我们的模型表明，PA/NPSi确实引发了异常毒性，表现为大鼠模型早期即出现胸腔积液和心包积液。其次，该模型成功再现了人类多浆膜腔积液的发生与发展过程；与此同时，我们在临床患者中也观察到了类似现象，这些患者表现为胸腔和心包积液、肺纤维化以及肉芽肿形成8,9。因此，这些事实提示，浆膜（如胸膜或心包膜）是PA/NPSi的损伤靶点之一，其性质与石棉所致损伤相似。此外，多浆膜腔积液...

胸腔积液是多种肺部疾病的常见临床表现，其病因多样。建立一个有用的动物胸腔积液模型，对于研究这些肺部疾病、两层胸膜的作用、胸腔积液的发生机制及其治疗具有重要意义。然而，已报道的一些胸腔积液模型主要集中在恶性胸腔积液或生物因素方面，而非环境中的纳米颗粒1,2。本文介绍一种新型的胸腔积液模型，该模型操作简便、安全且有效。
随着纳米技术的发展和纳米产品的广泛使用，人们日益关注纳米材料对环境和人类健康可能造成的危害3,4。纳米材料引入了新的风险因素，可能在工作场所或通过环境污染导致新型危害。体外和体内研究表明，纳米材料可对肺、心脏、肝脏、肾脏以及神经系统，还有生殖系统和免疫系统造成多器官损伤s5,6。此外，一些研究报道，纳米材料的特异性毒性源于其独特的理化性质3,4,7。
我们曾报道，一组职业性暴露于纳米材料的工人在临床上表现出胸膜和心包积液、肺纤维化及肉芽肿8，9。在这些患者胸膜积液中分离出了二氧化硅纳米颗粒9。为了在动物模型中重现并验证吸入纳米颗粒在人体中诱发的胸膜积液，我们通过气管内滴注聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅（PA/NPSi）在大鼠中开展实验，该方法模拟了人类在真实环境中的呼吸过程。研究发现，PA/NPSi的气管内滴注可在大鼠中引起胸膜积液。本文介绍如何通过气管内滴注PA/NPSi在大鼠中制备胸膜积液模型，以及如何从胸膜积液中分离纳米颗粒。该模型可能对纳米毒理学及胸膜积液相关疾病的研究具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>西门子 S2000 彩色多普勒超声系统</td><td>Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅</td><td>复旦大学，中国上海</td><td></td><td>按订单制备，含纳米二氧化硅(20&amp;plusmn;5)nm</td></tr><tr><td>10% 水合氯醛</td><td>北京化工厂</td><td>302-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Light speed 16 层螺旋计算机断层扫描仪</td><td>GE Healthcare, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无特定病原体级 Wistar</td><td>联和利华动物中心（中国北京）</td><td></td><td>Wistar 大鼠</td></tr></tbody></table>

大鼠经气管滴注聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅诱导胸腔积液模型

A Pleural Effusion Model in Rats by Intratracheal Instillation of Polyacrylate/Nanosilica

胸腔积液是多种肺部疾病的常见临床表现。建立一个实用的动物胸腔积液模型对于研究这些肺部疾病具有重要意义。以往的胸腔积液模型更多关注生物因素，而较少关注环境中的纳米颗粒。本文介绍一种通过气管内滴注聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅在大鼠中诱导胸腔积液的模型，以及从胸腔积液中分离纳米颗粒的方法。以3.125、6.25和12.5 mg/kg∙mL浓度的聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅进行气管内滴注后，大鼠在第3天出现胸腔积液，在6.25和12.5 mg/kg∙mL组中于第7至10天达到高峰，随后逐渐减少，并在第14天消失。随着聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅浓度的增加，胸腔积液的产生量增多且出现更快。该胸腔积液可通过超声检查或胸部CT扫描检测，并通过大鼠解剖予以确认。透射电子显微镜在大鼠胸腔积液中观察到二氧化硅纳米颗粒。结果表明，暴露于聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅可诱导胸腔积液的形成，这与我们此前在人类中的研究报道一致。此外，该模型有助于进一步开展纳米毒理学及胸腔积液相关疾病的研究。

通过胸腔超声检查，我们发现所有组别在第1天均无胸腔积液。然而，在第3天，6.25 和 12.5 mg/kg∙mL 组出现胸腔积液，积液主要位于右侧肋膈角；心包积液仅出现在 12.5 mg/kg∙mL 组。此外，在第7天，6.25 mg/kg∙mL 组中检测到胸腔积液（视频 1）和心包积液（视频 2）（图 1）。胸腔积液在第7至10天缓慢增加至最显著程度，随后逐渐减少。到第14天，所有组别均不再发现胸腔积液，但可见胸膜粘连的征象。10
在第7天和第14天，3.125 和 6.25 mg/kg∙mL 剂量组均未见胸腔积液迹象10然而，在12.5 mg/kg∙mL组中，胸部CT扫描显示异常，后肋膈角变钝，提示存在少量胸腔积液（<stron...

本文介绍了一种通过气管内滴注聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅在大鼠体内构建胸腔积液模型的实验方案。

胸腔积液是多种肺部疾病的常见临床表现。建立一个有效的动物胸腔积液模型对于研究……具有重要意义。

该方法可用于评估纳米材料的毒性，并适用于肺部毒性的研究。本技术源于对聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅诱导胸腔积液效应的研究。在开始灌注前，将新鲜的10毫升聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅生理盐水悬浮液超声处理20至30分钟，随后涡旋震荡10分钟，再将悬浮液稀释至3.125、6.25和12.5毫克/毫升的浓度。接下来，确认麻醉大鼠对足趾夹捏无反应，用一根尼龙线将动物的门齿固定在板上。使用镊子和额部牵开器轻轻打开口腔，以观察声门裂，并将一根细管插入双侧支气管。然后通过导管向肺部注入0.5毫升聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅颗粒，并将大鼠置于仰卧位，持续监测直至完全恢复。在灌注后的第1、3、7和14天，使用电动剃须刀去除每只麻醉大鼠胸部和上腹部的毛发，并将大鼠仰卧位放置在配备线阵探头的超声系统固定板上。在暴露的皮肤上涂抹超声耦合剂，将探头置于肋间和肋下区域，以检测胸膜腔积液。为准确检测积液，应选择左右侧卧位进行超声检查。在第7天，6.25 毫克/千克/毫升灌注剂量组中同时检测到胸腔积液和心包积液。在第7天和第14天，12.5 毫克/千克/毫升灌注剂量组动物的胸部CT扫描显示钝性后肋膈角区域异常，提示存在少量胸腔积液。胸腔积液样本的透射电子显微镜观察显示，纳米二氧化硅颗粒以单个或团簇形式存在，其形态与制备悬浮液中观察到的纳米颗粒一致。最重要的是要记住要观察声门裂，并将细管插入双侧支气管。纳米颗粒也可通过吸入或静脉注射的方式给予，这两种方法在之前的研究中均已使用。该技术对于研究胸腔积液的发生具有重要意义。

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聚丙烯酸/纳米水的气管内灌注积液模型

经气管灌注可将溶质直接递送至肺部。该操作旨在将灌注液输送至肺的远端区域，因此常被用于肺泡相关研究。我们提供了一套详细的小鼠经气管灌注存活实验操作方案。...

直接向小鼠肺部气管内灌注溶质

本视频展示了在免疫功能健全的啮齿类动物模型中建立肺部感染的方法 通过...

在免疫功能健全的啮齿类动物模型中支气管内接种Streptococcus pneumoniae

在小鼠左侧肺进行选择性支气管内酸灌注，可导致单侧且自限性的急性肺损伤，该模型模拟了由胃酸误吸引起的人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。...

通过单侧支气管内注射酸建立自限性急性肺损伤模型

本文描述了一种体外支气管模型的细胞培养及暴露方法，可用于对颗粒物进行真实、重复的吸入暴露，以开展毒性测试。...

一种用于毒性测试中真实、重复吸入空气颗粒物暴露的气液界面支气管上皮模型

将药物直接注入新生啮齿类动物气管的技术，对于研究局部给药的药物或生物制剂对新生儿肺部疾病的影响具有重要意义。此外，该方法还可用于在动物模型中诱导肺损伤。...

一种用于治疗新生啮齿类动物肺部疾病的微创气管内给药方法

已采用博来霉素建立多种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型存在药物分布不均的问题。本文提出一种通过鼻腔雾化博来霉素诱导的均匀性肺纤维化模型。...

通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

本研究描述了一种通过全身暴露于吸入室中吸入二氧化硅来建立矽肺大鼠模型的技术。该矽肺大鼠模型能够以简便、经济且重复性好的方式， closely...

通过全身暴露于可吸入二氧化硅建立大鼠矽肺模型

本方案描述了一种通过反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立小鼠矽肺模型的方法 通过...

通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。...

小鼠肺纤维化模型中博来霉素的口咽部给药

在此，我们介绍一种通过气溶胶化博来霉素递送在小鼠中建立肺纤维化模型的实验方案 通过 气管。该优化方法能够在无需手术切口的情况下实现均匀、定量且精确的递送，从而提高博来霉素诱导纤维化的可重复性和可靠性。...

一种改进的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且微创的小鼠肺纤维化模型

了解利用气管内灌注技术在大鼠体内构建聚丙烯酸/纳米二氧化硅胸腔积液模型的方法。该技术可用于评估纳米材料的肺毒性及其对呼吸系统的影响。

大鼠经气管滴注聚丙烯酸酯/纳米二氧化硅诱导胸腔积液模型

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