Name: 龙苷受体 n 端域的晶体结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解小菜蛾龙苷受体N端域的X射线晶体结构解析方法，揭示通道门控机制，为基于结构的特异性杀虫剂设计提供重要模板。该方法涵盖蛋白质表达、纯化、结晶及结构解析等关键步骤。

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本研究由以下项目资助：国家重点研发计划（2017YFD0201400，2017YFD0201403）、国家自然科学基金（31320103922，31230061）以及国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2015CB856500，2015CB856504）。我们感谢上海同步辐射光源（SSRF）BL17U1线站工作人员的支持。

1. 基因克隆、蛋白表达与纯化
<ol>
	<li>PCR扩增目的蛋白对应的DNA（DBM RyR的1-205位氨基酸，Genbank登录号AFW97408），并通过无缝克隆（Ligation-Independent Cloning, LIC）技术将其克隆至pET-28a-HMT载体中25该载体在N端含有一个组氨酸标签、MBP标签和TEV蛋白酶切割位点15.
	<ol>
		<li>设计具有与LIC兼容的5’延伸的LIC引物，用于扩增目标基因： 
		正向LIC引物： 
		5’ TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3’ 
		反向LIC引物： 
		5’ TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3’</li>
		<li>将反应组分混合（总体积50 μL）：1 μL DNA模板（100 ng/μL）、1 μL上游引物（10 μM）、1 μL下游引物（10 μM）、0.5 μL DNA聚合酶（NEB）、5 μL 10×反应缓冲液、1 μL dNTP（25 mM）、40.5 μL无RNase的ddH₂O。2O.
		<ol>
			<li>将反应混合物放入PCR仪中，并运行以下程序。</li>
			<li>95 °C 孵育 3 分钟，然后进行 30 个循环（95 °C 30 秒，58 °C 15 秒，72 °C 1 分钟）。72 °C 孵育 5 分钟，随后置于 4 °C 保存。</li>
			<li>将全部反应混合物（50 μL）在2%琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶回收试剂盒进行回收。按照制造商的说明书操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>不依赖连接酶的克隆技术（LIC）
		<ol>
			<li>进行 SspI 酶切反应（60 μL）：20 μL 载体&#160;DNA（50 ng/μL）、6 μL 10x反应缓冲液、4 μL SspI 和 30 μL ddH₂O2O. 37 °C 下孵育 3 小时。将整个反应体系上样至 1% 琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）进行回收，具体操作按照生产商说明书进行。</li>
			<li>对载体和插入片段DNA进行T4 DNA聚合酶处理。混合以下组分：5 μL 载体或插入片段DNA（50 ng/μL），2 μL 10x T4 DNA聚合酶缓冲液，载体加1 μL dGTP（25 mM）或插入片段DNA加1 μL dCTP（25 mM），1 μL DTT（100 mM），0.4 μL T4 DNA聚合酶（LIC级），以及9.6 μL ddH₂O。2O. 将反应在室温下孵育40分钟。在75 °C下加热20分钟以灭活酶。 
			注意：LIC 载体和插入 DNA 必须在不同的反应中进行处理。</li>
			<li>进行LIC退火反应。混合以下组分：2 μL经T4处理的插入DNA，2 μL经T4处理的LIC载体DNA。室温孵育反应10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化BL21 (DE3) E. coli 含有该重组质粒的细胞。
	<ol>
		<li>将感受态细胞（50 μL，置于微量离心管中）冰上融化。</li>
		<li>加入约1 μL（50 ng）质粒至离心管中。轻轻弹击管壁2–3次，使细胞与DNA充分混匀。将离心管置于冰上孵育20分钟。</li>
		<li>42 °C 热激 40 秒。将离心管再次置于冰上 2 分钟。向离心管中加入 1 mL 室温 LB 培养基。</li>
		<li>将混合物管置于37 °C、250 rpm摇床中振荡45分钟。取150–200 µL混合物涂布于选择性平板上。倒置平板，于37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>挑取单菌落，加入含50 µg/mL卡那霉素的100 mL 2YT培养基中，于37 °C过夜培养。次日，取10 mL过夜培养物接种至1 L含50 µg/mL卡那霉素的2YT培养基中，于37 °C摇床培养箱中250 rpm振荡培养。&#160;直到OD600 达到约0.6。随后加入IPTG诱导培养物至终浓度0.4 mM，并在30 °C下继续培养5小时。</li>
	<li>通过在 8,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C下孵育10分钟，收集细胞，每10 g细胞加入40 mL裂解缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4，250 mM KCl，10 mM β-巯基乙醇，25 μg/mL溶菌酶，25 μg/mL DNase，1 mM PMSF）重悬。
	<ol>
		<li>以65%的超声功率进行超声处理8分钟，工作1秒，间歇1秒，以破碎细胞。随后在40,000 x g条件下离心，去除细胞碎片。 g 4 °C下孵育30分钟。将上清液通过0.22 μm滤膜过滤，然后加载至样品环中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化融合蛋白，切除标签并重新纯化目标蛋白。
	<ol>
		<li>使用 Ni-NTA 纯化融合蛋白&#160;柱层析（结合缓冲液：10 mM HEPES pH 7.4，250 mM KCl；洗脱缓冲液：10 mM HEPES pH 7.4，250 mM KCl，500 mM 咪唑），使用纯化系统以20–250 mM 咪唑的线性梯度进行纯化。</li>
		<li>在4 °C下，按1:50的比例加入TEV蛋白酶，过夜切割洗脱的目标蛋白。</li>
		<li>使用 amylose 树脂柱纯化切割反应混合物（结合缓冲液：10 mM HEPES pH 7.4，250 mM KCl；洗脱缓冲液：10 mM HEPES pH 7.4，250 mM KCl，10 mM 麦芽糖）并结合 Ni-NTA&#160;通过层析柱去除标签和TEV蛋白酶，目标蛋白将存在于这两个柱子的穿流组分中。</li>
		<li>透析样品&#160;用透析缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.8，50 mM KCl，10 mM β-巯基乙醇）进行透析以降低盐浓度。在阴离子交换柱上纯化样品&#160;柱层析（结合缓冲液：10 mM Tris-HCl pH 8.8，10 mM β-巯基乙醇；洗脱缓冲液：10 mM Tris-HCl pH 8.8，1 M KCl，10 mM β-巯基乙醇），采用洗脱缓冲液中含20–500 mM KCl的线性梯度进行洗脱。</li>
		<li>作为纯化过程的最后一步，使用离心浓缩器（10 kDa 截留分子量）浓缩蛋白质，然后上样至 Superdex 200 26/600 凝胶过滤柱以检测其均一性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过15% SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。 
	注意： 所有层析柱均在蛋白纯化系统上运行，结合时流速为 2 mL/min，洗脱时流速为 4 mL/min，凝胶过滤层析除外，其流速为 1 mL/min。</li>
</ol>
2. 蛋白质制备与结晶
<ol>
	<li>使用离心浓缩器（10 kDa 截留分子量）将纯化的蛋白质样品浓缩至 10 mg/mL，并置换为结晶缓冲液，然后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>采用坐滴气相扩散法，在 295 K 条件下，使用多种结晶试剂盒和自动化液体处理机器人系统，在 96 孔板中以 1:1 比例（200 nL 蛋白质溶液与 200 nL 储液缓冲液）进行结晶筛选。 
	注意：我们使用了 Molecular Dimensions 和 Hampton Research 的试剂盒，以及 Gryphon 自动化液体处理系统。</li>
	<li>密封 96 孔结晶板以防止蒸发，并使蛋白质液滴与储液缓冲液达到平衡，随后将板置于 18 °C 的结晶培养箱中。</li>
	<li>定期使用光学显微镜检查 96 孔板，以监测晶体的形成和生长情况。</li>
	<li>为区分蛋白质晶体与盐晶体，可使用蛋白质染料。向目标液滴中加入 1 µL 染料，等待约 1 小时后在显微镜下观察，蛋白质晶体将呈现蓝色。</li>
	<li>利用已确定的有利结晶条件（1.5 M 硫酸铵，0.1 M Tris，pH 8.0），在 24 孔板中采用悬滴气相扩散法进一步优化晶体生长。
	<ol>
		<li>逐步优化 pH 值，范围为 7.0 至 8.5，每步间隔 0.5 个 pH 单位；逐步优化硫酸铵浓度，范围为 1.2 M 至 1.7 M，每步间隔 0.1 M。（在本实验中，产生较大片状晶体的最佳条件为 0.1 M HEPES，pH 7.0，以及 1.6 M 硫酸铵）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 晶体安装、X射线数据收集与结构测定
<ol>
	<li>将晶体装载到冷冻环中，并使用含有20%甘油的储液作为冷冻保护剂，在液氮中快速冷冻。将晶体放入UniPuck中用于储存和运输。</li>
	<li>使用Rigaku公司生产的实验室X射线衍射仪对蛋白质晶体进行预筛选。选择分辨率最高的晶体在同步辐射设施上进行数据收集（我们的数据集来自上海同步辐射装置的&#160;BL17U1线站）。
	<ol>
		<li>使用线站控制软件BluIce26，通过自动或手动居中功能装载并居中晶体。进行测试曝光，以确定数据收集策略，包括起始角度、曝光时间、探测器距离、每帧振荡角度和帧数。</li>
		<li>根据策略收集数据（我们共收集了180帧，每帧曝光1秒，振荡宽度1°，探测器距离为350 mm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用HKL2000软件包27对数据集进行指标化、积分和缩放。首先执行峰值搜索功能以识别衍射点，然后对衍射点进行指标化并确定正确的空间群。完成峰值积分后，采用适当的误差模型对数据集进行缩放，并保存输出的.sca文件。</li>
	<li>在PHENIX29中使用Phaser28通过分子置换法解决相位问题。
	<ol>
		<li>使用Xtriage30计算非对称单元中蛋白质分子的可能拷贝数。</li>
		<li>利用文献中已知的结构或通过结构预测服务器（如Phyre231）生成的模型，寻找与目标蛋白具有高序列一致性和结构相似性的合适结构模板（我们使用了兔源RyR1的NTD结构作为搜索模型，PDB ID: 2XOA）。</li>
		<li>运行Phaser程序，输入衍射数据文件、模板结构文件和目标蛋白的序列文件，以寻找解决方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PHENIX29中运行AutoBuild32，利用Phaser输出的文件和目标蛋白的序列文件生成初始模型。</li>
	<li>使用Coot33在修正后的实验电子密度图中手动构建结构，并通过phenix.refine34进行迭代循环的精修。</li>
	<li>使用&#160;PHENIX18中的验证工具对最终模型进行验证。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们描述了重组表达、纯化、结晶并解析DBM RyR NTD结构的实验流程。在结晶过程中，获得高溶解度、高纯度和高均一性的蛋白质是关键要求。在本方案中，我们选用pET-28a-HMT载体，因其含有六组氨酸标签和MBP标签，二者均可用于纯化，从而获得更高纯度的蛋白产物。此外，MBP标签有助于提高目标蛋白的溶解度。我们通过五个连续步骤对蛋白进行纯化，最终获得高纯度且适用于结晶的蛋白样品。结晶初筛采用自动化液体处理系统完成。与传统人工点板方法相比，自动化系统所需样品体积更小，节省时间与人力，并因液体操作精度更高而显著提升实验可重复性。晶体初筛在本实验室进行衍射测试，数据收集则在同步辐射光源处完成，因其提供的X射线具有更高强度和更小发散度，可获得高质量的衍射数据。分子置换法为首选相位确定方法，因数据库中已有相似结构模板可供参考。替代方法为实验相位法，包括MAD、SAD和MIR。 等等。
在解析DBM RyR NTD结构的过程中，Xtriage30计算得到的Matthews系数表明，非对称单位（ASU）最可能包含四个单体...

兰诺定受体（RyRs）是一类特异性的离子通道，介导钙离子（Ca2+）穿过肌肉细胞肌质网（SR）膜的通透过程，因此在兴奋-收缩耦联过程中发挥重要作用。在功能状态下，RyR以同源四聚体形式组装，分子质量&#62;2 MDa，每个亚基包含约5000个氨基酸残基。在哺乳动物中存在三种同工型：RyR1—骨骼肌型，RyR2—心肌型，以及RyR3—在不同组织中广泛表达1。
在昆虫中仅存在一种雷诺丁受体（RyR），其在肌肉和神经组织中均有表达2。昆虫RyR与哺乳动物RyR2更为相似，序列同源性约为47%3。针对鳞翅目和鞘翅目昆虫RyR的双酰胺类杀虫剂已由拜耳（氟苯虫酰胺）、杜邦（氯虫苯甲酰胺）和先正达（氰虫酰胺）等主要公司研发并投入市场。自其相对较近的上市以来，双酰胺类杀虫剂已成为增长最快的杀虫剂类别之一。目前，这三种杀虫剂的年销售额已超过20亿美元，自2009年以来增长率超过50%（Agranova）。
近期研究报道，昆虫在使用这些杀虫剂数代后已产生抗性4,5,6,7,8。小菜蛾（DBM）Plutella xylostella 的鱼尼丁受体（RyRs）跨膜区中存在抗性突变（G4946E、I4790M），以及番茄潜叶蛾 Tuta absoluta 中对应位点的突变（G4903E、I4746M），表明该区域可能参与双酰胺类杀虫剂的结合，因为该区域已知对通道的门控功能至关重要4,8,9。尽管该领域已有大量研究，双酰胺类杀虫剂的确切分子作用机制仍不明确。此外，尚不清楚这些抗性突变是直接影响还是变构影响其与双酰胺类化合物的相互作用。
早期研究已通过X射线晶体学和冷冻电子显微镜分别报道了多种哺乳动物RyR结构域以及全长哺乳动物RyR1和RyR2的结构10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。但迄今为止，尚未有关于昆虫RyR结构的报道，这限制了我们对受体功能的分子机制、杀虫剂作用机理以及杀虫剂抗性发展机制的理解。
本文中，我们提出了一种针对小菜蛾（一种危害全球十字花科作物的毁灭性害虫）兰尼碱受体N端β-三叶草结构域进行结构表征的通用实验方案22。该表达质粒的设计依据已发表的兔RyR1 N端结构域的晶体结构23,24以及冷冻电镜结构模型16,17,18,19,20,21。这是首次报道的昆虫RyR高分辨率结构，揭示了通道门控的机制，并为基于结构的药物设计开发物种特异性杀虫剂提供了重要的模板。在结构解析方面，我们采用了X射线晶体学方法，该方法被公认为在接近原子分辨率下测定蛋白质结构的“金标准”。尽管结晶过程具有不可预测性和高劳动强度，但本逐步操作方案将有助于研究人员表达、纯化并表征昆虫RyR的其他结构域或任何其他蛋白质。

<table><tbody><tr><td>pET-28a-HMT 载体</td><td></td><td></td><td>该修饰型 pET 载体在 N 端含有六组氨酸标签、MBP 融合蛋白以及 TEV 蛋白酶切割位点（Lobo 和 Van Petegem，2009）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 (DE3) 菌株</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapHP 柱（5 mL）</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>淀粉糖树脂柱</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose 高性能柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 浓缩器（10 kDa MWCO）</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 凝胶过滤柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>自动化液体处理机器人系统&amp;nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 CrystalQuick 板</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>安装式 CryoLoop - 20 微米</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>载晶盘杜瓦瓶装载工具</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>晶体培养箱</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>X 射线衍射仪</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI 限制性内切酶</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>蛋白纯化系统</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Pure</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>IzIt 晶体染料</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Index 晶体筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Structure 晶体筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>ProPlex 晶体筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT premier 晶体筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus 晶体筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

雷诺丁受体n端结构域的晶体结构 plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

靶向昆虫鱼尼丁受体（RyR）的高效杀虫剂的研发在农业害虫防治领域备受关注。迄今为止，已有多种靶向害虫RyR的双酰胺类杀虫剂实现商品化，年销售额达20亿美元。然而，由于缺乏关于昆虫RyR的结构信息，目前对靶向RyR杀虫剂作用机制的理解仍十分有限，这也限制了人们对害虫杀虫剂抗性发展机制的认识。小菜蛾（DBM）是一种严重危害全球十字花科作物的害虫，已被报道对双酰胺类杀虫剂产生抗性。因此，研发靶向小菜蛾RyR的新型杀虫剂具有重要的实际意义，特别是作用于传统双酰胺结合位点以外区域的杀虫剂。本文提供了一种用于结构表征小菜蛾RyR N端结构域的实验方案。该蛋白的X射线晶体结构通过分子置换法在2.84 Å分辨率下解析，显示其具有β-三叶折叠模体及一个侧翼α螺旋。本方案可推广应用于其他结构域或蛋白质的表达、纯化及结构表征。

纯化
DBM RyR 的 N 端结构域以融合蛋白形式表达，包含六聚组氨酸标签、MBP 标签和 TEV 蛋白酶切割位点。我们采用五步纯化策略，获得高纯度蛋白，适用于结晶。首先，通过 Ni-NTA 柱（HisTrap HP）从细胞裂解液的可溶性组分中纯化该融合蛋白。接着，用 TEV 蛋白酶进行切割，并通过 amylose 树脂柱和 Ni-NTA 柱去除六聚组氨酸-MBP 片段。随后，蛋白经阴离子交换柱（Q Sepharose HP）进一步纯化，最后通过凝胶过滤柱（Superdex 200 26/600）完成纯化。使用 2YT 培养基，每升细菌培养物最终获得的纯化蛋白产量约为 4 mg。纯化后的蛋白在 SDS-PAGE 上显示为单一的约 21 kDa 条带（图 1）。凝胶过滤柱的洗脱体积表明，纯化的 RyR N 端结构域为单体（图 1）。...

本文中，我们描述了N端结构域的蛋白质表达、纯化、结晶及结构解析的实验方案&#160;小菜蛾兰诺定受体Plutella xylostella).

雷诺丁受体N端结构域的晶体结构 Plutella xylostella

靶向昆虫兰尼碱受体（RyRs）的高效杀虫剂的研发在农业害虫防治领域备受关注。

解析鱼尼丁受体结构域的结构有助于我们理解该蛋白质功能的分子机制、杀虫剂的作用方式以及杀虫剂抗性的发展。该研究采用X射线晶体学方法进行结构解析，此方法被认为是近原子分辨率下蛋白质结构测定的金标准。该昆虫鱼尼丁受体结构域的高分辨率结构揭示了通道门控的机制，并为基于结构的药物设计方法开发物种特异性杀虫剂提供了重要的模板。通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为有志于从事蛋白质晶体学研究的人员必须熟练掌握生物化学、生物物理学、计算机科学和数学。首先通过聚合酶链式反应扩增与目标蛋白质对应的DNA。反应结束后，将全部50微升反应混合物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并根据标准操作流程使用凝胶回收试剂盒回收DNA。接下来，通过将20微升载体DNA与6微升10X反应缓冲液、4微升SspI限制性内切酶在30微升双蒸水中混合，使LIC载体DNA线性化。将该反应体系在37摄氏度下孵育3小时。孵育结束后，将整个反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，随后根据制造商说明书，使用胶回收试剂盒提取线性化的载体DNA。接下来，根据标准操作流程，对5微升线性化载体DNA和PCR扩增的插入片段DNA分别进行T4 DNA聚合酶处理。在室温下孵育40分钟，随后在75摄氏度下加热20分钟以灭活酶活性。将2微升经T4处理的插入片段DNA与2微升经T4处理的LIC载体DNA混合，进行连接无关克隆退火反应，在室温下孵育10分钟。将重组质粒转化至BL21(DE3) E. Coli细胞时，将50微升感受态细胞置于冰上解冻，并向管中加入约1微升退火后的质粒。轻轻弹击管壁两到三次以混匀细胞与DNA，随后将管放回冰上静置20分钟。孵育结束后，将细胞在42摄氏度下热激40秒，随后放回冰上孵育2分钟。接下来，向离心管中加入1毫升室温的LB培养基，并将细胞置于37摄氏度、250 RPM摇床中振荡培养45分钟。振荡孵育结束后，取150至200微升该混合液涂布于筛选平板上，将平板倒置并在37摄氏度下过夜培养。第二天，在摇床培养箱中，将单个菌落接种于100毫升添加了卡那霉素的2-YT培养基中，37摄氏度过夜培养。次日早晨，取10毫升过夜培养物接种至1升含卡那霉素的2-YT培养基中，37摄氏度振荡培养，直至OD600读数达到约0.6。随后，加入IPTG至终浓度为0.4毫摩尔，诱导培养，并在30摄氏度继续培养细胞5小时。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中，使浓度达到每40毫升缓冲液含10克细菌。采用超声处理破坏细胞壁，设置参数为65%的振幅，工作1秒、间歇1秒，持续8分钟。通过离心去除细胞碎片。然后，将上清液通过一个22微米的滤器过滤，并将滤液加载到样品环中。为纯化融合蛋白，将样品环中的滤过上清液注入纯化系统中的5毫升镍-次氮基三乙酸柱，采用20至250毫摩尔咪唑的线性梯度进行洗脱。以1:50的比例在4摄氏度下用烟草蚀刻病毒蛋白酶对洗脱的目标蛋白进行过夜酶切，随后将酶切反应混合物先后通过直链淀粉树脂柱和镍-次氮基三乙酸柱进行纯化，以去除标签蛋白和烟草蚀刻病毒蛋白酶。将镍-次氮基三乙酸柱的穿流液用透析缓冲液透析，以降低盐浓度，然后在阴离子交换柱上使用洗脱缓冲液中20至500毫摩尔氯化钾的线性梯度对样品进行纯化。接着，使用离心浓缩器浓缩蛋白质。将浓缩后的蛋白质注入Superdex 200 26/600凝胶过滤柱以检测其均一性，并通过15% SDS-PAGE评估蛋白质的纯度。为进行蛋白质结晶，将纯化的蛋白质样品在离心浓缩装置中浓缩至10毫克/毫升，并置换为结晶缓冲液，然后于80摄氏度保存。进行结晶筛选时，采用悬滴气相扩散法，在295开尔文条件下，使用多种结晶试剂盒及自动化液体处理系统，在96孔板中进行。滴定完成后，密封96孔结晶板，以防止蒸发，并使蛋白质液滴与储液池中的缓冲液达到平衡。将培养皿置于18摄氏度的晶体培养箱中。定期在光学显微镜下检查培养皿，以监测晶体的形成和生长情况。为区分蛋白质晶体与盐晶体，向目标液滴中加入一微升蛋白质晶体染料，一小时后在显微镜下观察晶体。蛋白质晶体将呈现蓝色。为进一步优化晶体，可使用已确定的阳性结晶条件，在24孔板中采用悬滴气相扩散法，并在18摄氏度的晶体培养箱中孵育。为测定蛋白质结构，需在体视显微镜下将晶体装载至冷冻环上，随后在液氮中进行快速冷冻，并将晶体置于uni-buck容器中用于储存和运输。使用实验室内的X射线衍射仪对晶体进行初步筛选，通过手动中心定位功能安装并居中定位晶体。然后，使用X射线衍射软件收集数据。为对数据集进行指标化、积分和缩放处理，使用HKL-2000软件包，首先选择探测器并加载数据集。然后，执行峰搜索功能以找出衍射斑点。对斑点进行指标化，选择合适的空间群，并进行峰积分。接下来，对数据集进行缩放。调整误差模型并再次进行缩放。保存输出的 sca 文件。为了使用 Phenix 软件套件确定结构，需创建一个新项目。首先，使用 sca 文件运行 Extriage，以计算不对称单元中蛋白质分子的可能拷贝数。接着，为了通过分子置换法解决相位问题，运行 Phaser，输入衍射数据文件、与目标蛋白质具有高序列一致性和结构相似性的模板结构文件，以及蛋白质序列文件，以寻找解决方案。然后，在 Phenix 中进行自动建模，利用 Phaser 的输出文件和目标蛋白质的序列文件生成初始模型。使用 COOT 将结构手动构建到经修饰的实验电子密度中，并通过 Phenix refine 进行迭代循环精修。利用 Phenix 中的验证工具对最终模型进行验证。在此代表性实验中，如所示，对小菜蛾兰尼碱受体蛋白的末端结构域进行纯化后，SDS-PAGE 分析显示在约 21 千道尔顿处出现单一条带。凝胶过滤柱的洗脱体积证实，纯化的兰诺定受体末端结构域为单体。在结晶过程中，形成高质量片状晶体的最优条件为：pH 7 的 1 摩尔 HEPES 缓冲液和 1.6 摩尔硫酸铵。利用所示软件对衍射数据集进行蛋白结构解析，揭示了小菜蛾兰诺定受体末端结构域包含第 1 至 205 位氨基酸残基。具有较大无序区域、柔性区域或弱亲和力的蛋白质在结晶上具有挑战性。在这些情况下，可采用蛋白质工程策略，如表面熵减、环区截短和交联，以提高获得优质蛋白质晶体的可能性。除了揭示高分辨率的蛋白质结构外，X射线晶体学还可用于研究蛋白质与农药之间的相互作用，从而有助于基于结构的农药设计。

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雷诺丁受体N端结构域的晶体结构 Plutella xylostella

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