Name: 在体外陶氏蛋白聚集与药物筛选研究方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用高纯度重组Tau蛋白建立可靠的体外聚集实验方法，通过荧光强度监测Tau蛋白错误折叠与聚集动力学过程。该实验为阿尔茨海默病及其他Tau蛋白病的药物筛选和病理机制研究提供了高度可重复的技术平台。

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作者感谢 Hector Quirante 在 huTau441 的表达与纯化方面提供的帮助，感谢 Hanna Inganäs 和 Margot van Winsen 提供出色的技术支持，感谢 Martin Koldijk 进行数据分析。

1. 试剂准备
<ol>
	<li>反应缓冲液
	<ol>
		<li>配制反应缓冲液：将TCEP干粉（分子量= 286.65 g/mol）溶解于pH 7.4的PBS储存液中，制备含0.5 mM TCEP、pH 6.7的PBS缓冲液。 
		注：使用TCEP的原因在于此前利用含有半胱氨酸的野生型tau蛋白进行桥联聚集研究。在本方案中，TCEP仅用于将PBS的pH从7.4调节至6.7，不参与任何氧化还原反应的调控。</li>
		<li>充分混匀，并通过无菌的0.22 μm孔径PES膜滤器过滤溶液。</li>
		<li>分装后于-80 ˚C保存。</li>
		<li>使用前在室温下解冻并平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>huTau441
	<ol>
		<li>从-80 ˚C冰箱中取出huTau441（蛋白表达与纯化方法参见Apetri et al.24）。</li>
		<li>在室面上解冻，并平衡至室温（RT）。</li>
		<li>将蛋白储存液离心管在20–25 ˚C下以12,000 × g离心5分钟，以消除气泡。</li>
		<li>使用摩尔消光系数0.31 mL mg-1cm-1，在280 nm波长处测定huTau441的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硫黄素T
	<ol>
		<li>将10 mg硫黄素T（ThT）干粉（分子量=318.86 g/mol）溶于35 mL反应缓冲液中，配制500 μM的ThT储存液。</li>
		<li>充分混匀，以最大速度涡旋振荡3次，每次20秒，并通过无菌的0.22 μm孔径PES膜滤器过滤溶液。</li>
		<li>使用摩尔消光系数22,000 M-1 cm-1，在411 nm波长处测定其浓度，并将ThT浓度调整至500 μM。避光保存于室温。每2个月新鲜配制一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝素
	<ol>
		<li>在室温下，将1 mg高分子量肝素（HMW heparin）干粉（分子量 = 17–19 kDa）溶于1 mL反应缓冲液中，新鲜配制55 μM肝素溶液。</li>
		<li>剧烈震荡，并涡旋振荡2次，每次5秒。</li>
		<li>通过无菌的0.20 μm孔径PES膜滤器（注射器式）过滤溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多功能微孔板读板仪上的连续模式硫磺素T聚集检测
注意：在反应体系中加入硫黄素T（ThT）染料，以连续模式（自动检测）监测人源Tau441蛋白的聚集动力学。尽管可以使用常规比色皿和普通荧光分光光度计来跟踪反应过程，但手动操作限制了测量频率，并影响所记录动力学曲线的准确性。因此，本实验采用自动多功能微孔板读板仪进行检测。
<ol>
	<li>仪器设置
	<ol>
		<li>打开计算机和多功能酶标仪，让设备稳定运行10分钟。</li>
		<li>启动软件并制定实验方案。
		<ol>
			<li>选择实验方案类型：标准方案（每个孔板的数据归约独立进行）。</li>
			<li>将温度设置为 37 ˚C，并在继续实验方案前选择预热。</li>
			<li>设置动力学实验：运行时间 50 h / 测量间隔：15 min。</li>
			<li>以425 cpm（3 mm）的转速持续进行轨道振荡。</li>
			<li>选择读取模式：荧光强度 - 终点法/动力学法 - 单色器波长：激发 440 nm（20 nm 带宽）/ 发射 485 nm（20 nm 带宽） - 光学位置：顶部 - 正常读取速度 - 读取高度：4.50 mm</li>
			<li>使用已创建的实验方案开始运行。命名实验，选择新生成文件的保存位置，并让仪器预平衡至所需温度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人源Tau441蛋白的自发转化
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中配制反应样品。每反应使用200 μL混合液，至少设置4个重复（4个重复的总反应体积为800 μL）。</li>
		<li>制备800 μL反应样品（共4个重复），其中包含15 μM huTau441、8 μM肝素和50 μM ThT。首先将蛋白质与反应缓冲液混合，然后加入肝素和ThT，上下吹打5次以充分混匀。请严格按照指定顺序添加试剂。</li>
		<li>在 12,000 × g 和 25 ˚C 条件下离心样品 5 分钟，以去除气泡。</li>
		<li>在96孔微孔板（96孔黑色固相微孔板，每孔体积360 μL，平底）中每孔加入200 μL反应样品。避免产生气泡。</li>
		<li>密封微孔板以防止蒸发。</li>
		<li>将微孔板放入多功能微孔板读数仪中并开始检测。</li>
		<li>实验结束后，从仪器中取出培养板，并将数据导出至数据处理软件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化质量检测、种子采集与保存
	<ol>
		<li>移除板上的封膜，将不同重复样本汇集至1.5 mL离心管中。收集前，通过上下吹打2次充分混匀孔中聚集的样品。聚集物容易沉积在孔底。</li>
		<li>在1.5 mL离心管中用移液器上下吹打5次充分混匀，取10–20 μL滴加至云母表面，用于AFM分析聚集体（更多细节参见Apetri） 等24).</li>
		<li>在 20,000 × g 和 4 ˚C 条件下离心 1.5 mL 离心管 1 小时，收集沉淀物。聚集体会形成沉淀。</li>
		<li>通过S-MALS分离并分析上清液，以确认样品中无单体tau蛋白，表明已成功转化为聚集体（更多细节参见Apetri） 等人24).</li>
		<li>标记含有剩余聚集体（沉淀）的1.5 mL离心管，注明初始huTau441蛋白浓度和样品体积。将聚集体速冻后于-80 ˚C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种反应
	<ol>
		<li>从 -80 ˚C 冰箱中取出 huTau441 聚集体。根据标签所示加入相应体积的反应缓冲液（初始样品体积），并将离心管置于室温下平衡。用移液器上下吹打 5 至 8 次，重悬聚集体。</li>
		<li>将聚集的样品进行超声处理。对于200 μL样品（15 μM huTau441），在冰上使用1/8英寸探头超声处理&#34; 使用250瓦超声波破碎仪，以30%的振幅，采用1秒脉冲、2秒间歇的模式，对样品（体积从100 μL至10 mL）进行总计15秒的超声处理。随后将样品重新平衡至室温。 
		注意：所采用的超声处理条件可产生长度为20-50 nm的均一Tau蛋白纤维群体24.</li>
		<li>在1.5 mL离心管中配制反应样品。每反应使用200 μL混合液，至少设置4个重复（4个重复的总反应体积为800 μL）。</li>
		<li>制备800 μL反应样品，其中包含15 μM huTau441、8 μM肝素和50 μM ThT。首先将蛋白质与反应缓冲液混合，然后加入肝素和ThT，上下吹打5次以充分混匀。请严格按照指定顺序添加试剂。</li>
		<li>在 12,000 × g 和 25 ˚C 条件下离心样品 5 分钟，以去除气泡。</li>
		<li>每孔加入200 μL反应样品至96孔板（96孔黑色实底微孔板，孔体积360 μL，平底）。避免产生气泡。</li>
		<li>通过反复吹打（5次）充分混匀预先形成的纤维样品，并向每孔加入对应于所需种子百分比的量。对于总体积为200 μL的孔，加入2 μL预先形成的种子即为1%（v/v）。加样至孔中时，通过上下吹打混合3次，避免产生气泡。</li>
		<li>密封微孔板以防止蒸发。</li>
		<li>将微孔板放入多功能微孔板读数仪中并开始检测。</li>
		<li>从设备中取出培养板，并将数据导出至电子表格。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease%3A+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li>
<li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li>
<li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li>
<li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A68%3A+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li>
<li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li>
<li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li>
<li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li>
<li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li>
<li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li>
<li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).</li>
<li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers%3A+Insight+from+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li>
<li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li>
<li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li>
<li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li>
<li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li>
<li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li>
<li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer%27s+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li>
<li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer%27s+disease+and+the+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537(2015).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein%3A+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li>
<li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy%2C+corticobasal+degeneration%2C+FTDP-17+and+Pick%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管已有大量研究，目前文献中报道的 tau 蛋白聚集动力学仍缺乏理想的可重复性，和/或缺少成核依赖性聚合的某些特征19,20,21,22,23,25这通常表现为缺乏滞后期、接种效率低下以及tau聚集体的非纤维状特性。造成这些不足的原因可能各不相同，包括tau蛋白质量不理想（片段化、存在聚集体、纯度低） 等等。）、蛋白质的选择、诱导试剂以及实验条件。另一个复杂因素是位于tau蛋白聚集界面附近的两个半胱氨酸残基，它们可能根据氧化还原环境形成分子内或分子间二硫键，从而影响tau蛋白聚集的效率。在大多数实验方法中，通常使用DTT或TCEP等还原剂以维持半胱氨酸残基的还原状态，进而提高实验的可重复性。25此外，tau蛋白的消光系数非常低，导致其蛋白浓度的准确测定存在困难。
我们特别关注了几个参数和质量属性，这些因素对于获得稳健、可重复且具有代表性的 Tau 蛋白聚集谱至关重要：消除分子内和分子间二硫键形成的可能，制备高纯度的 Tau 单体，并提高浓度测定的准确性。所有这些与试剂相关的问题都是我们认为在优化检测方法开发过程中必须重点关注的关键环节。为解决这些问题，我们表达了全长的人类 Tau441 蛋白，其中包含两个突变（C291A 和 C322A）以及 N 端和 C 端标签。半胱氨酸残基的突变对 Tau 蛋白本身影响极小，却能有效消除难以控制的二硫键交联。通过在蛋白的 N 端和 C 端引入相对较短的标签，我们得以采用两步亲和纯化方案，从而获得极高纯度、完整性和单体含量的蛋白。此外，我们引入了 F8W 突变，该突变提高了蛋白的消光系数，使得浓度测定更加准确24。
除了使用高质量的蛋白质试剂外，还优化了其他检测参数。确定的最佳 tau 与肝素的摩尔比（M/M）约为 0.5，这与先前已发表的研究结果一致26。此外，机械和光学仪器设置对于确保实验的可重复性至关重要，且最佳参数可能因制造商不同而存在一定程度的差异。
本实验所描述的tau蛋白聚集具有与阿尔茨海默病（AD）及相关tau蛋白病中tau病理发生相关的特征。该过程起始于一个初始滞后期，对应于高能成核结构的形成，随后进入快速生长期，对应于纤维的延伸生长。滞后期足够长，为深入研究涵盖广泛种子浓度范围的成核诱导过程提供了充足的时间窗口。图5）同时长度不宜过长，以避免蛋白质降解和/或非特异性聚集（图2）。当像huTau441这样的内在无序蛋白长时间暴露于生理条件时，尤其可能发生这些次级事件。所获得的tau蛋白聚集体呈现出从阿尔茨海默病（AD）患者脑组织中分离出的成对螺旋丝（PHFs）的形态，并能高效招募单体tau蛋白并将其转化为聚集体。 从头合成 生成的聚集体，这一过程称为接种。该检测方法具有高度可重复性，不同孔、不同实验批次以及不同蛋白批次之间的动力学曲线几乎完全一致。尽管目前的检测仅针对最长的tau亚型huTau441，但该方法可加以改进以研究其他tau亚型的转化（Ameijde 等，即将发表于《Acta Neuropathologica Communications》）此外，该方法可支持针对tau亚型之间相互作用的机制性研究，并可能揭示tau蛋白在阿尔茨海默病（AD）与皮克病（PICK's disease）或额颞叶痴呆（Frontotemporal dementia）中致病机制的差异：在AD中，成对螺旋纤维（PHFs）包含3R和4R两种tau亚型，而在皮克病和额颞叶痴呆中，tau病理分别主要由3R和4R tau亚型构成27.
该检测方法具有极高的可重复性，应能使读者在其特定的实验室条件下相对容易地实施。该检测模拟了被认为的 体内 tau蛋白的错误折叠与聚集，从而支持对tau蛋白致病机制的深入研究，并为筛选药物候选分子以及评估其对致病过程中各个阶段的干预作用提供了重要工具。

阿尔茨海默病是一种破坏性的神经退行性疾病，其组织病理学特征是细胞外聚集的β淀粉样蛋白老年斑1以及含有聚集性过度磷酸化tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结2。生理状态下的tau蛋白为单体形式，通过选择性剪接产生六种独特的亚型，包含0-2个N端插入片段和3或4个微管结合结构域3,4，平均发生2-3次磷酸化。目前认为，过度磷酸化、错误折叠以及自聚集形成纤维结构是tau蛋白致病过程中的关键环节，这一观点已在痴呆患者中得到病理学评估证实5,6。
聚集的神经纤维缠结是阿尔茨海默病（AD）以及其他tau蛋白病变（tauopathies）的标志性特征，这些疾病包括额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）、皮克病（Pick's disease）、进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy, PSP）、额颞叶痴呆（fronto-temporal dementia, FTD）以及原发性年龄相关性tau蛋白病变（primary age-related tauopathy, PART）2。从生物化学角度来看，理解tau蛋白错误折叠和聚集的机制，有助于揭示与AD及其他tau蛋白病变相关的病理过程。除了科学研究意义之外，可靠的体外（in vitro）聚集检测方法也是筛选潜在药物分子的重要工具7,8,9,10。目前认为，tau蛋白的聚集遵循一种依赖于成核的聚合过程（nucleation dependent polymerization, NDP）11,12,13,14。NDP动力学呈S形曲线，起始阶段为热力学不利的成核步骤，随后进入快速且热力学有利的聚集过程。
与其他淀粉样蛋白（包括朊病毒蛋白、淀粉样β蛋白和α-突触核蛋白）不同，tau蛋白在生理条件下不会自发聚集，甚至在极端pH值或高温下也难以发生聚集15。这很可能是因为tau蛋白聚集界面存在亲水相互作用。然而，当使用肝素16或其他多聚阴离子17,18等诱导剂时，tau蛋白可在生理浓度下高效聚集。
先前建立 体外 tau 聚集实验已揭示了 tau 蛋白错误折叠和聚集过程的一些细节，但尚不足以模拟被认为在体内发生的事件 体内 tau 聚集动力学。在大多数情况下，tau 聚集动力学缺乏与 tau 成核相关的初始滞后期。这可能是由于使用了过高的 tau 蛋白浓度、起始 tau 蛋白样品中存在预先形成的聚集体，和/或使用了比生理状态下全长 tau 蛋白更易聚集的 tau 片段所致。19,20,21,22,23此外，以往的研究未涉及tau蛋白聚集动力学的可重复性和稳健性问题。
在此，我们描述了一种稳健的方法 体外 tau 聚集检测模拟了成核依赖性聚合反应的主要特征，包括初始滞后期（对应于 tau 成核阶段）和随后的指数增长期。此外，所生成的重组 tau 聚集体具有纤维状结构，且表现出极强的种子活性。该检测方法在不同批次的 tau 蛋白之间也具有高度可重复性，是筛选聚集抑制剂的有力工具。

<table><tbody><tr><td>硫黄素 T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516-5G</td><td>干燥粉末（分子量 = 318.86 g/mol）</td></tr><tr><td>肝素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>干燥粉末（分子量 = 17–19 kDa）</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259-1G</td><td>干燥粉末（分子量 = 286.65 g/mol）</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>无菌，pH 7.4（1X）</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>PES 膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.20 &amp;mu;m 无菌注射器滤器</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>PES 膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96 孔微孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502867</td><td>黑色，平底</td></tr><tr><td>微孔板封板膜&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY992</td><td>粘性封条&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy Neo2 多功能微孔板读板仪&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td>Synergy Neo2</td><td>混合技术，Gen5 软件</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 120.086</td><td>1.5 ml 管</td></tr><tr><td>超声波破碎仪-Branson SFX250</td><td>Branson</td><td>101-063-966R</td><td>1/2&quot; 固体探头和 1/8&quot; 微型探头&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

体外 tau蛋白聚集研究及药物筛选实验

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Tau蛋白的聚集以及成对螺旋纤维的形成是阿尔茨海默病及其他tau蛋白病的标志性特征。与其他神经退行性疾病相关蛋白相比，已有报道的 体外 tau蛋白的聚集动力学表现不够一致，具有相对较高的变异性。本文描述了一种 体外 模拟tau蛋白错误折叠与聚集预期步骤的聚集实验 体内该检测使用最长的tau蛋白异构体（huTau441），其包含两个N端酸性插入片段以及四个微管结合结构域（MBD）。 体外 通过在96孔微孔板中加入肝素触发聚集，并持续使用硫黄素T荧光进行监测。该tau蛋白聚集实验在不同孔间、不同实验批次及蛋白批次之间均具有高度可重复性。所形成的聚集物呈现类似tau蛋白成对螺旋纤维（PHF）的形态，能够高效促进新聚集物的形成。 从头合成 纤维状结构。除了可用于研究tau蛋白错误折叠和聚集的机制外，本实验方法还是筛选能够干扰tau蛋白致病过程的药物的有力工具。

含有 C291A 和 C322A 突变以及 N 端 His 标签和 C 端 C 标签的重组 huTau441 的表达与纯化方法如前所述24. huTau441 批次在 SDS-PAGE 上显示高度纯化，经 S-MALS 测定几乎 100% 为单体形式图1）。聚集体的形成 15 µM 通过添加诱导表达huTau441 8 µM HMW 肝素，并使用多功能酶标仪通过 ThT 荧光连续监测反应过程。激发波长为 440 nm（带宽 20 nm），发射波长为 485 nm（带宽 20 nm）。该检测具有高度可重复性，10 个独立孔的结果几乎无法区分（图 2A). 通过原子力显微镜（AFM）在孵育50小时后评估ThT阳性huTau441聚集体的形态。聚集态的huTau441由不同长度的纤维结构组成，呈均一混合物，与已有报道相似。 离体 形态（图 2B）。此外，最终反应混合物中不含单体，S-MALS 测量结果表明单体已完全转化为聚集体（图 2C）。在独立的实验运行中，huTau441 聚集的动力学非常相似，表现为相似的S形曲线以及无法区分的滞后期和生长期（图3）。当使用不同批次的蛋白质时，仍能保持较高的可重复性（图 4）。此外，预先形成的 huTau441 聚集体在招募 tau 单体并诱导其形成聚集体方面效率非常高 从头合成 tau 聚集体。低至 0.0025% (v/v) 的预先形成的 tau 聚集体即可绕过成核过程，触发新聚集体的生成 从头合成 纤维（图5).
<img alt="蛋白质纯化结果；SDS-PAGE 凝胶和尺寸排阻色谱图；分子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：重组人 Tau441 为单体且高度纯净。 A) 在变性条件下通过 4-12% SDS-PAGE 凝胶评估纯度，包括分子量标准蛋白梯度（单位为 kDa）（第 1 泳道）；C-tag 亲和纯化最终步骤的穿流组分（第 2 泳道）；柱洗脱组分（第 3 泳道）；缓冲液置换前（第 4 泳道）和缓冲液置换后（第 5 泳道）洗脱的 huTau441 蛋白峰。B) huTau441 的 S-MALS 分析。该蛋白质显示为 > 99.9% 的单体，摩尔质量为 51 kDa，不含聚集体或片段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光动力学、淀粉样纤维和紫外色谱；图示、显微镜图像和曲线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：重组 huTau441 的聚集具有高度可重复性，并定量形成纤维状结构。 A) 通过 ThT 荧光法在 96 孔微孔板中连续监测肝素诱导的 huTau441 聚集动力学。huTau441 和肝素的浓度分别为 15 µM 和 8 µM。10 条独立曲线对应于同一微孔板中十个孔内同一批次蛋白的转化过程，其平均（±标准差）滞后期为 14.2 ± 0.38 小时，t50 为 18.8 ± 0.40 小时。动力学数据采用具有线性下降上渐近线的五参数逻辑曲线进行拟合。滞后期和 t50 通过线性回归预测值的插值法计算得出。滞后期基于 ThT 荧光信号增加 3% 计算。曲线拟合与汇总统计使用 IBM SPSS Statistics 版本 20.0.0.2 完成。B) 在反应 50 小时后通过原子力显微镜（AFM）成像显示 Tau 聚集体呈现类似成对螺旋纤维（PHF）的形态；C) 对单体 huTau441（t = 0 小时）及反应完成时反应混合物上清液（t = 50 小时）进行 S-MALS 分析。在 50 小时时间点，将反应混合物在 20,000 × g 和 4 °C 下离心 1 小时，取上清液注入 S-MALS 系统。单体峰的消失证实 Tau 已完全聚集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度图；运行1和运行2；时间与强度；蛋白质折叠分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：Tau蛋白聚集实验在不同独立实验运行之间表现出高度可重复性。 两个图中展示了两次独立实验中使用同一批huTau441蛋白所获得的四条自发性huTau441聚集的动力学曲线。huTau441和肝素的浓度分别为15 µM和8 µM。动力学特征表现为平均（标准差）滞后期为12.2 ± 0.18 h，t50为17.8 ± 0.8 h（运行1），以及11.6 ± 0.52 h和t50为17.8 ± 0.23 h（运行2）。动力学数据采用具有线性下降上渐近线的五参数逻辑曲线进行拟合。T50值通过线性回归预测值的插值法计算得出。滞后期根据ThT荧光信号增加3%的时间点计算。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的批次荧光强度图表，显示实验重复结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：Tau蛋白聚集实验在不同批次的huTau441蛋白之间表现出高度可重复性。 每个图示显示了对应于特定huTau441批次的四个重复实验。每个批次的聚集过程均在独立实验中进行监测。huTau441和肝素的浓度分别为15 µM和8 µM。四个独立tau蛋白批次的聚集动力学特征分别为：15.3 ± 0.38 h的平均（±标准差）滞后期和21.1 ± 0.46 h的t50（批次1）；12.5 ± 0.07 h的滞后期和19.8 ± 0.34 h的t50（批次2）；15.1 ± 0.34 h的滞后期和21.9 ± 0.86 h的t50（批次3）；以及11.5 ± 0.29 h的滞后期和17.8 ± 0.29 h的t50（批次4）。动力学数据采用具有上渐近线线性下降的五参数逻辑曲线进行拟合。滞后期和t50通过线性回归预测值之间的插值计算得出。滞后期基于ThT荧光信号增加3%时确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度随时间变化图；PCR扩增曲线；qPCR实验中的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：预先形成的hutau441聚集体具有较高的成核活性。 为启动成核过程，将超声处理的tau聚集体加入到单体hutau441中。从红色到蓝色，不同颜色的动力学曲线分别代表所加入种子的不同浓度：1.25%、0.63%、0.31%、0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0.005%和0.0025%（v/v）。自发转化的hutau441以黑色表示。所有条件均设置四次重复。特定种子浓度对应的四组动力学重复数据高度可重现，在大多数情况下几乎无法区分。hutau441和肝素的浓度分别为15 µM和8 µM。加入少量预先形成的超声处理纤维结构可消除自发转化中观察到的初始滞后期，且该效应与种子量成正比。从红色到蓝色，所观察到的t50差值（t50 自发转化 - t50 成核）分别为18.9、18.40、17.8、17.3、16.6、16.1、15.4、14.7、14.2和13.7小时。hutau441的自发转化其平均t50（标准差SD）为19.85 ± 0.54 h。动力学数据采用带有上线性下降渐近线的五参数逻辑斯蒂曲线进行拟合。t50值通过线性回归预测值之间的插值计算得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文所述的tau蛋白聚集检测方法模拟了预期的tau蛋白聚集特征 体内 tau蛋白错误折叠与聚集

体外 Tau蛋白聚集研究及药物筛选实验

Tau蛋白的聚集以及成对螺旋纤维的形成是阿尔茨海默病及其他tau蛋白病的标志性特征。与其他……相比

Tau蛋白在其自组装形成成对螺旋纤维过程中的错误折叠是阿尔茨海默病及其他Tau蛋白病的病理特征。本文介绍了一种可靠的Tau蛋白聚集检测方法，有助于阐明Tau蛋白致病过程。该转化过程遵循成核依赖性聚合反应的全部步骤，且具有高度可重复性，可实现更严格格式的药物筛选，迄今已达到OBSI水平。试剂的质量至关重要。重组Tau蛋白必须具有高纯度，且不含聚集体和片段。首先打开计算机和多功能酶标仪。待设备稳定后，启动软件并选择“标准方案”作为方案类型。将温度设置为37摄氏度，并在继续执行方案前选择预热。接下来，将动力学运行时间设置为50小时，测量间隔设置为15分钟。将轨道振荡设置为连续模式，每分钟425个循环。随后，选择读数方法为荧光强度终点动力学单色仪法。激发波长设为440纳米，发射波长设为485纳米，光路位置设为顶部，增益设为80。选择正常读取速度，并将读取高度设置为 4.50 毫米。然后验证并保存该方案。使用创建的方案开始运行。命名实验，选择新创建文件的保存位置，并让仪器预平衡至所需温度。对于自发性重组Tau蛋白转化实验，先在1.5毫升离心管中将蛋白质与反应缓冲液混合，制备总体积为1,000微升的反应样品，其中800微升用于硫黄素-T荧光检测，130微升用于SEC-MALS分析。然后加入肝素和硫黄素-T，通过上下吹打5次充分混匀。必须精确执行实验方案以确保高重复性，按相同顺序混合试剂，并严格控制操作时间。将样品在12,000 × g、25 °C条件下离心5分钟，以消除气泡。离心后，向96孔微孔板中每孔加入200 µL反应样品，注意避免产生气泡。然后密封微孔板以避免蒸发。将微孔板放入多功能微孔板读板机中。选择整板读取，或如果微孔板未装满，则选择需要读取的孔，然后开始测量。将数据导出至数据处理软件。然后从设备上取下微孔板。接着，从微孔板上移除封板膜。用移液器将各孔中的聚集样品上下吹打两次以混匀，并将不同的重复样品汇集至1.5毫升离心管中。每个样品再用移液器上下吹打五次，充分混匀后，取10至20微升滴加到云母表面，用于原子力显微镜分析聚集物。随后，将每个1.5毫升离心管中的聚集物在20,000 × g、4摄氏度条件下离心一小时，收集聚集物。通过SEC-MALS分析上清液，确认样品中无单体Tau蛋白，表明已成功转化为聚集体。接着，彻底去除所有残留上清液，并用记号笔标记含有剩余聚集体的1.5毫升离心管，注明初始重组Tau蛋白浓度及样品体积。迅速将聚集体冷冻，并于-80摄氏度保存。对于接种实验，从冷冻箱中取出重组Tau蛋白聚集体，加入标签上标明体积的反应缓冲液，并将离心管置于室温下平衡。然后通过移液器上下吹打5至8次使聚集体重新悬浮。将200微升的聚集样品置于冰上进行超声处理，使用1/8英寸微探头，总时长15秒，工作模式为开启1秒、关闭2秒，振幅30%。接下来，通过在1.5毫升离心管中将蛋白质与反应缓冲液混合，制备800微升的反应样品。然后加入肝素和硫黄素T，上下吹打5次以充分混匀。在25摄氏度、12,000 × g条件下离心5分钟，以去除气泡。离心后，将198微升反应样品分装至96孔微孔板的每个孔中，注意避免产生气泡。通过上下吹打三次，使预先形成的纤维样品均质化。向每孔中加入对应所需种子百分比的量，并通过上下吹打三次混匀。然后密封微孔板以防止蒸发。将微孔板放入多功能微孔板读数仪中并开始检测。实验完成后，从仪器中取出微孔板。然后将数据导出至电子表格。含有 C291A 和 C322A 突变以及 N 端 his 标签和 C 端 c 标签的重组 Tau 蛋白在 SDS-PAGE 上显示纯度很高，并通过 SEC-MALS 分析证实几乎 100% 为单体形式。通过硫黄素-T 荧光法检测肝素诱导的重组 Tau 聚集，激发波长为 440 纳米，发射波长为 485 纳米。该检测具有高度可重复性，10个独立孔的结果几乎无法区分。重组Tau蛋白聚集体为不同长度的纤维状结构的均一混合物，形态与已报道的离体外形态相似。最终反应混合物中不含单体，表明已完全转化为聚集体，SEC-MALS测量结果证实了这一点。在独立的实验运行中，重组Tau蛋白聚集的动力学相似，表现为相似的S形曲线以及无法区分的滞后期和生长期。使用不同批次的蛋白时，这种高度的可重复性仍然得以保持。预先形成的重组Tau聚集物能够有效招募Tau单体并诱导新的Tau聚集物的形成，且该过程的效率与种子百分比呈正比。低至0.0025%体积比的预先形成的Tau蛋白聚集体即可绕过重组Tau蛋白的成核过程，触发纤维的从头生成。本检测方法模拟了体内Tau蛋白错误折叠与聚集的过程，可用于机制研究，有助于阐明发病机制，同时也是药物筛选及研究候选药物对不同阶段过程干扰的有力工具。该检测具有高度可重复性，便于科研人员在实验室中轻松实施。尽管当前的检测仅针对最长的 Tau 亚型（人 Tau-441），但该应用可经调整用于研究不同的 Tau 变体。同时请勿忘记，选择合适的蛋白试剂并以高标准进行制备，对于建立稳健且高度可重复的检测至关重要。

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科研

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在体外陶氏蛋白聚集与药物筛选研究方法

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