Name: 基于 crispr-cas9 的基因组工程, 用于生成 hiv-1 感染与选定的证明病毒整合点的 jurkat 报告模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9基因组工程技术在Jurkat细胞中构建HIV-1感染体外模型，实现前病毒报告基因在选定整合位点的精准靶向插入，为研究HIV整合机制与基因表达调控提供可靠方法。

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感谢Britta Weseloh和Bettina Abel提供的技术协助。同时感谢Arne Düsedau和Jana Hennesen（流式细胞术技术平台，Heinrich Pette研究所）提供的技术支持。

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，在选定的前病毒整合位点构建HIV-1来源的Jurkat报告模型的实验方案。
在规划阶段需仔细注意该方案的几个要点。首先，应谨慎选择靶向位点，因为某些位点可能比其他位点更容易靶向（例如, 取决于该区域的染色质状态以及目标序列本身）。重复序列难以克隆到靶向载体中，且在基因组中通常不具有唯一性。抑制性染色质区域使用 CRISPR-Cas9 系统进行靶向的难度较大19,20.
其次，gRNA 的选择对于 CRISPR-Cas9 介导的靶向至关重要。为了构建具有代表性整合位点的 HIV 感染模型，应使 gRNA 尽可能靠近整合热点结合。然而，该位点可能并不适合 Cas9 的招募；因此，必须在 gRNA 序列与所选整合位点的接近程度和 gRNA 质量之间做出权衡。我们发现 E-CRISP 网络工具在预测功能性 gRNA 方面具有较高的可靠性。也...

感染后前病毒DNA整合到宿主基因组中是人类免疫缺陷病毒（HIV）生命周期中的关键步骤。整合完成后，HIV通过在长寿的CD4+ T细胞亚群（如记忆性CD4+ T细胞）中建立潜伏状态而持续存在。HIV的整合似乎并非随机事件1,2。多项研究通过对急性和慢性感染个体中整合位点进行测序，已检测到多个基因组热点区域，这些区域反复出现前病毒DNA的整合2,3,4,5,6,7,8。有趣的是，在某些整合位点，同一基因座在大量感染细胞中被检测到，这提示在重复位点的整合可能对克隆扩增具有促进作用1。
为了加深对重复整合位点重要性的理解，必须探究前病毒整合位点的选择机制。然而，若干技术因素限制了对HIV整合位点选择及其后果的研究。目前广泛使用的HIV潜伏细胞培养模型（如JLat细胞系）并不能反映临床上具有相关性的重复整合位点9。一方面，基于原代患者来源细胞的研究虽可通过测序手段描述整合位点图谱，却无法进行功能分析。据我们所知，目前尚无合适的实验模型可用于对选定的临床相关整合位点进行功能分析。
在此，我们介绍一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术构建新型HIV感染模型的详细工作流程。本方案可用于构建T细胞来源的报告细胞系，以模拟HIV感染过程，其基因组中在选定整合位点处稳定整合了前病毒报告元件。因此，这些细胞系可作为研究前病毒整合位点如何影响HIV生物学特性，以及前病毒对不同治疗策略（例如, 由潜伏期逆转剂诱导的表达性）。我们的方法利用了基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术优势，通过Cas9核酸酶在靶位点诱导产生双链断裂，从而促进报告基因序列通过同源重组整合到基因组中。整合靶位点的选择依据来自对HIV感染者研究中所描述的常见整合位点的邻近区域，以及是否存在适合Cas9介导基因组编辑的PAM序列基序。
在我们的示范性结果中，我们聚焦于 BACH2 基因位点，该基因编码 BTB 和 CNC 同源性转录调控因子 2。在接受抗逆转录病毒治疗的慢性 HIV 感染个体中，BACH2 是整合型 HIV-1 序列富集的位点之一3,6,7,8,10。我们选择了一种最小化的 HIV 来源报告系统，包含源自 HIV-1 的长末端重复序列（LTR）、tdTomato 编码序列以及牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化信号（PA），并将其靶向定位至 BACH2 基因第 5 内含子中的两个特定位点。本方案已针对 Jurkat 细胞（一种来源于人 CD4+ T 细胞的悬浮细胞系）进行了优化，但也可适用于其他细胞系，并相应调整实验流程。我们提供了一个详细的工作流程，涵盖靶位点的选择、带有同源臂的靶向载体构建、通过 CRISPR-Cas9 技术将报告系统插入选定基因组位点、克隆细胞系的建立与筛选，以及对新构建的靶向报告细胞系进行全面验证。

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>用于表达 SpCas9 和 gRNA 的载体</td></tr><tr><td>pMK</td><td>GeneArt</td><td></td><td>用于克隆的哺乳动物表达载体</td></tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>用于克隆的哺乳动物表达载体</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>R0539S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>E5520S</td><td>用于靶向载体构建的无缝克隆试剂盒</td></tr><tr><td>TaqPlus Precision PCR System</td><td>安捷伦科技（Agilent Technologies）</td><td>600210</td><td>具有校对活性的DNA聚合酶，用于扩增同源臂（步骤1.2.2.2）、验证整合位点和报告基因序列（步骤3.3.3和3.3.5）、生成Southern blot的基因组探针（步骤3.4.1.5）以及脱靶事件分析（步骤3.5.4）</td></tr><tr><td>96孔组织培养板（圆底）</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>用于稀释涂布的组织培养板</td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity DNA polymerase）</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>M0530 L</td><td>用于检测靶向事件（步骤2.4.2）和生成Southern blot用报告基因特异性探针（步骤3.4.1.4）的DNA聚合酶</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>D9170</td><td>作为PCR添加剂的二甲基亚砜</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）溶液</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>B9021S</td><td>作为PCR添加剂的MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;溶液</td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>N0447S</td><td>每种核苷酸浓度为10 mM的dNTP混合物，用于PCR反应</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>即用型PCR预混液，用于筛选PCR（步骤3.2.11）</td></tr><tr><td>QIAamp DNA血液微量试剂盒（QIAamp DNA blood mini kit）</td><td>凯杰（Qiagen）</td><td>51106</td><td>DNA提取与纯化试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit）</td><td>凯杰（Qiagen）</td><td>28106</td><td>PCR纯化试剂盒</td></tr><tr><td>不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（RPMI 1640 without glutamine）</td><td>龙沙（Lonza）</td><td>BE12-167F</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>南非胎牛血清批次（Fetal Bovine Serum South Africa Charge）</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（L-glutamine）</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 10,000 U/mL / 10,000 &amp;micro;g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM低血清培养基（Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media）</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）</td><td>31985062</td><td>经优化用于转染的低血清浓度细胞培养基</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2125</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>P8139-1MG</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>离子霉素（Ionomycin）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>I0634-1MG</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>注射器驱动式滤器单元，PES膜，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millex</td><td>SLGP033RB</td><td>用于无菌过滤的滤器单元</td></tr><tr><td>Heracell 150i 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）</td><td>51026280</td><td>组织培养用培养箱</td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1520B</td><td>带正电荷的尼龙膜，用于DNA和RNA印迹</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>紫外交联仪</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>罗氏（Roche）</td><td>11585592001</td><td>使用随机寡核苷酸作为引物，以放射性dCTP标记DNA的试剂盒</td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant G-50 微型纯化柱（illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns）</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>用于纯化标记DNA的层析离心柱</td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas9的基因组工程构建整合位点特异的hiv-1感染jurkat报告模型

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

人类免疫缺陷病毒（HIV）会将其前病毒DNA非随机地整合到宿主细胞基因组中的特定重复位点和基因组热点区域。本文介绍了一种利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，构建具有选定基因组整合位点的新型体外HIV感染模型的详细实验方案。通过该方法，可将选定的报告基因序列整合至特定的目标基因组位点，从而模拟临床上相关的整合位点。
本方案中描述了HIV来源的报告基因的设计、靶位点及gRNA序列的选择。构建带有同源臂的靶向载体，并将其转染至Jurkat T细胞中。在靶位点处，Cas9介导产生双链断裂，促进通过同源重组将报告基因序列靶向整合到选定的基因组位点。通过流式细胞术和PCR筛选单细胞克隆以检测靶向事件。挑选阳性克隆进行扩增，并通过PCR、测序和Southern印迹法验证正确的靶向整合。同时分析CRISPR-Cas9介导的基因组编辑可能产生的脱靶效应。
通过使用本方案，可建立模拟HIV感染临床相关整合位点的新型细胞培养系统。尽管单细胞克隆的建立以及报告基因序列正确整合的验证过程较为耗时，但所获得的克隆细胞系是功能上分析前病毒整合位点选择的有力工具。

在本代表性实验中，我们选择将一个最小化的HIV-1来源报告基因靶向至BACH2基因第5内含子的两个位点，该报告基因包含LTR、编码tdTomato的序列以及polyA信号序列17。靶位点的选择依据是：这些位点靠近既往在HIV感染者原代T细胞研究中报道的反复出现的整合位点2,4,5,6,7,8，并且含有Cas9介导双链断裂所必需的PAM基序NGG。靶向载体按照所述方案构建并转染。转染操作、检测靶向事件、单细胞克隆的建立以及克隆的筛选与挑选的整体流程如图1所示。
<p c...

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

人类免疫缺陷病毒（HIV）将其前病毒DNA非随机地整合到宿主细胞基因组中的重复位点和基因组热点区域。本文中……

该方法有助于解答HIV前病毒整合如何影响宿主基因表达，以及为何在近期感染HIV的细胞中会优先选择某些基因组整合位点。该技术的主要优势在于，可利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术，构建携带靶向特定整合位点前病毒报告系统的体外HIV感染模型。本实验操作将由本实验室的博士研究生Thomas Walther和博士后Julia Bialek进行演示。首先使用 UCSC 基因组浏览器对目标基因组位点的基因组序列进行计算机提取。为靶向选定的基因组位点，使用 E-CRISP 网络工具设计长度为 20 个核苷酸的向导 RNA。然后选择智人基因组参考联盟人类基因组：Build 38。以参考基因组作为目标生物体，输入2,000个碱基对的基因组序列，覆盖先前提取的目标基因组位点。使用中等应用设置启动向导RNA搜索，允许任何PAM序列、任何5'端碱基，容忍脱靶位点的错配，并排除内含子和CpG岛。从出现的可能的向导RNA设计列表中，选择一个特异性和效率评分较高且尽可能接近目标基因组位点的向导RNA。打开 NCBI Blast 浏览器，将选定的引导 RNA 序列与参考基因组进行比对。为了验证所选引导 RNA 结合位点的唯一性，首先选择人类基因组，然后将引导 RNA 序列作为查询序列输入。接着选择“高度相似序列”或“Mega Blast”作为比对程序，以确保该引导 RNA 序列具有唯一性。随后，从最初提取的基因组序列中，选择向导RNA序列上下游各1,000个碱基对的区域进行计算机模拟分析。将所选的上下游各1,000个碱基对分别用作靶向载体构建中的5'端和3'端同源臂，并连接待靶向的报告基因序列。在转染Jurkat T细胞前24小时，为单次靶向实验准备一整块完全培养的6孔板细胞。首先，每孔加入2.5毫升含补充成分但不含抗生素的RPMI 1640培养基，接种1,250,000个细胞。次日，在反应管中加入微克量的环状靶向载体和每孔2微克的Cas9与引导RNA表达质粒，溶于250微升专用于转染的商用RPMI培养基中，通过涡旋充分混匀。然后，缓慢加入12微升转染试剂至DNA-培养基混合液中，注意勿接触管壁。轻弹试管，室温孵育15分钟。将混合物逐滴加入一孔细胞中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。转染后72小时，收集转染的细胞，计数并准备进行FACS富集。在混合的靶向细胞群体中确认靶向事件后，开始制备单细胞克隆；提前制备Jurkat条件培养基，即从健康的未处理Jurkat T细胞中收集含抗生素的RPMI培养基。以300 G离心5分钟，用25毫升注射器通过0.22微米滤器将上清液过滤至新的50毫升锥形管中。在扩增后10至14天，对先前通过FACS富集的目标细胞进行计数，然后将其用含抗生素的RPMI培养基稀释至每毫升100,000个细胞的浓度。取100微升该细胞稀释液，加入9.9毫升培养基，使细胞浓度达到每毫升1,000个。再取1毫升上述稀释液，加入9毫升培养基，稀释至每毫升100个细胞的浓度。为使96孔板每孔含有一个细胞，先在无菌试剂槽中轻轻混合1毫升浓度为每毫升100个细胞的细胞悬液、5毫升条件培养基和4毫升新鲜培养基。然后，使用多通道移液器将相应的细胞稀释液每孔100微升加入新的96孔圆底板中，以获得每孔含一个或两个细胞的稀释度。将96孔板叠放，并用6孔板覆盖每一叠，6孔板每孔加入3毫升PBS。将培养板置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，37摄氏度孵育三周。孵育完成后，使用4倍放大倍率的光学显微镜观察确认菌落生长情况，并标记出有菌落生长的孔。用移液器轻柔地重悬一个已标记孔中的细胞。取100微升该细胞悬液，加入预先准备好的96孔圆底板的一个孔中，每孔加入含抗生素的RPMI 100微升，对所有标记的孔重复此操作，然后用移液器轻轻吹打混匀。为复制该板，取100微升该细胞悬液加入第二个空的96孔圆底板中，并对所有标记的孔重复此步骤。最后，在空白孔中加入含抗生素的RPMI 200微升。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。当复孔培养板孵育24至48小时后，通过向每个孔中加入含抗生素的100 µL RPMI培养基再次进行传代。使用多通道移液器轻轻混匀，并将100 µL转移至新的96孔圆底培养板的每个孔中。将这两块重复培养板中的一块放入培养箱中。另一块新的重复培养板用于流式细胞术检测，首先每孔加入5 µL PMA/离子霉素预混液，以刺激细胞。孵育24小时后，按照文中所述方法准备细胞进行流式细胞术分析。根据前向散射和侧向散射的大小对具有活力的单个细胞进行分选。通过流式细胞术分析荧光报告基因的表达。若需通过PCR筛选单细胞克隆，请根据所选报告基因序列设计用于PCR筛选的引物P5和P6，以扩增报告基因序列中500至800个碱基对的片段。作为阳性对照 PCR，设计引物 P7 和 P8，用于扩增 630 个碱基对的野生型非靶向基因组位点。另设计第三对引物，用于扩增 500 至 600 个碱基对的靶向载体骨架序列，以检测靶向载体骨架序列的非特异性整合。当第二块重复培养板中的克隆生长至足够数量时，将培养板在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，进行 PCR 筛查前的准备。小心吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用100微升PBS轻轻吹打洗涤细胞，然后在室温下以300 × g离心5分钟。弃去PBS，每孔加入200微升裂解缓冲液。轻轻吹打混匀，将悬液转移至新的PCR板中。用石蜡膜密封，于55摄氏度的PCR仪中孵育1小时。以最大转速离心10分钟去除细胞碎片后，将上清液转移至新的PCR板中。向每个含有110微升蒸馏H2O的96孔PCR板的孔中加入10微升该细胞裂解液。然后在热循环仪中于99摄氏度孵育10分钟，以灭活蛋白酶K。取2微升该细胞裂解液作为模板，使用商业化的PCR预混液进行筛选、对照和骨架PCR。在96孔板中进行38至40个PCR扩增循环。取5 µL PCR产物，在1.5%琼脂糖TAE凝胶上电泳，以分析并整合流式细胞术与PCR结果，确认单细胞克隆。在不同整合位点的情况下，经PMA/离子霉素诱导后，报告基因的表达可在4%至12%的细胞中通过流式细胞术和PCR共同验证。使用针对5'端和3'端整合位点的引物对基因组DNA进行PCR分析，可确认靶向整合事件已发生。通过流式细胞术对单细胞克隆进行正确靶向的筛选后，观察到具有高、低以及无荧光报告基因表达的克隆。还使用报告基因特异性引物和对照引物通过PCR对单细胞克隆进行了验证。在筛选PCR中确认为阳性的克隆被扩增，并进一步通过Southern印迹分析其靶向的正确性，所用探针包括报告基因特异性探针以及结合于报告基因外侧基因组区域的基因组探针。只有部分克隆在Southern印迹分析中显示出正确的条带大小，并且报告基因以杂合状态整合，这表明通过Southern印迹验证PCR结果非常重要。还对克隆进行了测序分析，以进一步确认阳性单细胞克隆。对报告基因未整合的靶位点：同源等位基因进行测序，发现了Cas9诱导的突变。一旦掌握，HIV 报告细胞系的构建可在两到三个月内完成。在进行靶向操作之前，应花费足够时间根据拟解决的研究问题选择合适的整合位点和报告基因。例如，可根据需要选择包含不同 HIV 调控元件的报告基因。通过该实验流程，例如，可利用细胞系来检测不同潜伏期激活剂对报告型LTR转录活性的影响，具体取决于其整合位点。观看本视频后，您应能够充分掌握如何生成整合位点特异性的HIV报告细胞系，以设计向导RNA和靶向载体，在Jurkat细胞中进行基于CRISPR/Cas9的基因组编辑，获得单细胞克隆，并通过FACS和PCR筛选鉴定正确靶向的克隆。请注意，如果您选择使用具有复制能力的HIV报告病毒，必须在BSL3安全条件下进行操作。

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