Name: 微胶质细胞抗体介导的陶氏清除研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解利用BV-2小鼠小胶质细胞系定量检测抗体介导的Tau蛋白聚集体内吞的实验方法。该方案通过流式细胞术和共聚焦显微镜揭示Fc受体依赖的清除机制，为阿尔茨海默病免疫治疗研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Alberto Carpinteiro Soares 提供宝贵的技术支持。

1. BV-2 细胞培养
注意：在生物安全二级防护条件下操作 BV-2 细胞。BV-2 细胞系可产生包膜型重组嗜鼠性逆转录病毒（仅能感染小鼠细胞）12；这类病毒以其 体外 转化能力及 体内 致瘤潜能
<ol>
	<li>以每毫升4 × 104个细胞的密度接种BV-2细胞，培养于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（以下简称培养基）中。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。 
	注意：细胞呈松散贴壁和悬浮生长状态。</li>
</ol>
2. 使用pH敏感型荧光染料标记重组Tau蛋白聚集体
注意：Tau 聚集体的制备方法如 Apetri 等人13所述，不同之处在于反应缓冲液中未添加硫黄素T（ThT）。将聚集后的样品收集至1.5 mL离心管中。通过将118 µL混合样品与12 µL的50 µM ThT溶液混合，检测最终荧光信号。将聚集反应混合物在4 °C条件下以20,000 × g离心1小时，以分离聚集体。上清液通过SEC-MALS分析，以确认所有单体Tau均已转化为聚集体。沉淀物（Tau聚集体）迅速冷冻后于-80 °C冰箱中保存。
<ol>
	<li>将 tau 聚集体重悬于 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液（NaHCO₃）中3在 pH 8.5 条件下配制浓度为 1 mg/mL（约 20 µM）的溶液。 
	注意：tau 聚集体的浓度基于初始单体浓度，通过在 280 nm 处测定 tau 单体的吸光度，并使用 0.31 mL·mg⁻¹·cm⁻¹ 的消光系数计算得出。-1厘米-1.</li>
	<li>将重悬的聚集体置于冰上，使用探头式超声仪进行超声处理，以避免过热。
	<ol>
		<li>使用65%的振幅（超声波破碎仪功率为250 W）。</li>
		<li>进行8次脉冲，每次3秒，脉冲间隔15秒，以避免过热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备8.9 mM的pH敏感型储备液&#160;染料（下文简称pH染料）溶于二甲基亚砜（DMSO），具体操作按制造商说明进行。 
	注意：务必 freshly 配制溶液，并仅在配制当天使用。</li>
	<li>每摩尔蛋白质加入10摩尔染料，使染料终浓度为0.2 mM。</li>
	<li>通过轻柔吹打混匀。</li>
	<li>将反应混合物在室温下避光孵育45–60分钟。</li>
	<li>同时，按照制造商的说明组装交联葡聚糖凝胶脱盐柱。</li>
	<li>用 25 mL 0.1 M NaHCO₃ 平衡色谱柱3&#160;缓冲液&#160;pH 8.5 含有&#160;3% DMSO。弃去流穿液。</li>
	<li>将tau聚集体标记反应的产物加入柱中，总体积为2.5 mL。如果样品体积不足2.5 mL，需添加缓冲液至总体积达到2.5 mL。</li>
	<li>让样品完全进入凝胶柱，弃去流出液。</li>
	<li>用3.5 mL的0.1 M NaHCO₃洗脱3 含3% DMSO的pH 8.5缓冲液&#160;并将洗脱液收集到4个2 mL离心管中，每管体积相等。</li>
	<li>采用双辛可宁酸（BCA）法测定4个组分的蛋白质浓度。</li>
	<li>将标记的蛋白质储存于 -20 °C 冰箱中。</li>
</ol>
3. 采用荧光激活细胞分选（FACS）检测的摄取实验
<ol>
	<li>第1天——接种细胞
	<ol>
		<li>用1×培养基洗涤BV-2细胞，先移除培养瓶中的培养液，再加入1×&#160;磷酸盐缓冲液（PBS） 
		注意：洗涤体积需根据所用细胞培养瓶的大小进行调整。例如，对于T175培养瓶，使用10 mL的1x PBS进行洗涤。</li>
		<li>从培养瓶中移除 PBS，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下用 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）孵育以消化细胞2 直到细胞从培养瓶脱落（约5分钟）。 
		注意：胰蛋白酶-EDTA 0.05% 的使用体积取决于所用细胞培养瓶的大小。例如，对于 T175 培养瓶，使用 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 0.05%。</li>
		<li>用移液器将细胞在培养基中上下吹打三至五次，重悬细胞。 
		注意：&#160;培养基的体积根据所用细胞培养瓶的大小以及瓶内细胞的总数而定。例如，对于T175培养瓶，使用8 mL培养基。</li>
		<li>计数细胞并制备细胞悬液&#160; 1 × 10 的终浓度5 细胞/mL，培养基中含200 μg/mL肝素。</li>
		<li>将250 µL细胞悬液（2.5 × 10⁵ 个细胞）接种于4 每孔96孔组织培养平底板中的细胞数。</li>
		<li>37 °C 下孵育平板过夜，并&#160;5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天——制备免疫复合物
	<ol>
		<li>在冰上解冻pH染料-tau。</li>
		<li>每种条件下，用无血清培养基（含高糖DMEM，补充100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和200 µg/mL肝素）配制65 μl、500 nM的pH染料-tau聚集体溶液。</li>
		<li>在65 µl SFM中配制抗体稀释液，浓度为最终浓度的两倍。在96孔圆底板中混合pH染料-tau聚集体与抗体。每种条件的终体积为130 µl，pH染料-tau聚集体浓度为250 nM。&#160;密封稀释板，于37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天——免疫复合物摄取
	<ol>
		<li>从 BV-2 细胞中移除培养基，用 100 µL 室温 1x PBS 洗涤细胞一次。</li>
		<li>使用多通道移液器将125 µL免疫复合物转移至细胞中。将细胞与免疫复合物共同孵育2小时。&#160;在 37 °C 下&#160;5% CO2.</li>
		<li>从细胞中移除培养液并弃去。用100 µL室温1x PBS洗涤细胞一次。</li>
		<li>吸除 1× PBS，加入 50 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 处理 20 min&#160;5% CO2. </li>
		<li>加入 200 µL 培养基，通过上下吹打充分重悬细胞以使细胞脱离。将细胞转移至 96 孔圆底培养板中。以 400 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>将培养板置于冰上，吸除培养基，用150 µL预冷的1x PBS重悬细胞沉淀，洗涤两次。于400 x g离心培养板 g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>将细胞置于冰上，弃去加入的1×PBS，用150 µL冷FACS缓冲液（1×PBS、0.5%牛血清白蛋白（BSA）、2 mM EDTA）重悬细胞沉淀进行洗涤。在400 × g条件下离心平板 g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>将细胞置于冰上，去除添加的FACS缓冲液，并重悬细胞&#160;在 200 µL 冷 FACS 缓冲液中。</li>
		<li>立即通过FACS分析样品，采集2 x 104 活细胞门控中的事件（参见步骤 4.1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FACS 分析
注意：参见图1了解设门策略。
<ol>
	<li>利用前向散射面积（FSC-A）与侧向散射面积（SSC-A）密度图，通过排除前向散射信号较低的事件，圈选活细胞即， 碎片和死亡细胞。</li>
	<li>在活细胞群体中，利用前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）区分单细胞，排除双联细胞和细胞聚集体。此为单细胞门控。</li>
	<li>利用单线态门控中的事件，生成pH染料的单参数直方图。</li>
	<li>测定平均荧光强度。通过排除仅使用 BV-2 的对照组所确定的阴性细胞，计算 pH 染料-tau 阳性细胞的百分比。</li>
</ol>
5. 免疫复合物摄取的显微镜检测
<ol>
	<li>第1天——接种细胞
	<ol>
		<li>按照步骤 3.1.1、3.1.2 和 3.1.3 中所述方法制备 BV-2 细胞。</li>
		<li>计数细胞并重悬&#160;在培养基中至终浓度为104 cells/mL</li>
		<li>加入150 µL细胞悬液（1.5）&#160;×103在经多聚-D-赖氨酸包被的96孔黑色平底透明板中，每孔加入一定量。</li>
		<li>孵育平板&#160;在 37 °C 下&#160;5% CO2 48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天——制备免疫复合物 
	注意：在与抗体孵育前，对标记的tau蛋白聚集体进行轻度超声处理，以改善显微镜观察结果。
	<ol>
		<li>将pH染料-tau置于冰上解冻，并在冰上使用探头式超声仪进行超声处理。超声仪振幅设为15%（功率250 W），每次超声2秒，共30次脉冲，脉冲间间隔20秒。</li>
		<li>每种条件下，用SFM配制65 μl浓度为500 nM的pH染料-tau聚集体溶液。</li>
		<li>在65 µl SFM中将抗体稀释至最终浓度的两倍。在96孔圆底板中混合pH染料-tau聚集体与抗体。每种条件的终体积为130 µl，pH染料-tau聚集体浓度为250 nM。密封稀释板后于37 °C孵育过夜。</li>
		<li>从细胞培养板中移除培养基，更换为150 µL添加了200 µg/mL肝素的培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天——免疫复合物摄取
	<ol>
		<li>从 BV-2 细胞中移除培养基。使用多通道移液器将 125 µL 免疫复合物转移至细胞中。</li>
		<li>将细胞与免疫复合物在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时45分钟2. 
		用DNA特异性染料对细胞核进行染色，并用可选择性标记低pH细胞区室的探针染色酸性细胞器。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟。2. 
		注意：用无血清培养基（SFM）稀释染料。</li>
		<li>使用高内涵筛选共聚焦系统进行活细胞成像。设置温度&#160;至 37 °C 和 5% CO2为获得高质量图像，使用63倍水浸物镜，对每个成像视野采集0.5 µm间距的Z轴层切图像（每Z栈20层）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+soluble+A%CE%B2+oligomers+as+a+drug+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).</li>
<li>Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+aggregates+as+immunotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%28Scholar+edition%29%22%5BJournal%5D)">Tau aggregates as immunotherapeutic targets.</a> Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).</li>
<li>Martin, L., Latypova, X., Terro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+tau+protein%3A+Implications+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease.</a> Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+The+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Giacobini, E., Gold, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer+disease+therapy--moving+from+amyloid-beta+to+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).</li>
<li>Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+targeting+pathological+tau+conformers+in+a+tangle+mouse+model+reduces+brain+pathology+with+associated+functional+improvements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements.</a> Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).</li>
<li>Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+targeting+pathological+phospho-tau+protein+in+a+mouse+model+reduces+functional+decline+and+clears+tau+aggregates+from+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain.</a> Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).</li>
<li>Chai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+with+anti-Tau+antibodies+in+two+transgenic+models%3A+reduction+of+Tau+pathology+and+delay+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).</li>
<li>Yanamandra, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tau+antibodies+that+block+tau+aggregate+seeding+in+vitro+markedly+decrease+pathology+and+improve+cognition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).</li>
<li>Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+internalization+and+degradation+of+pathological+tau+is+enhanced+by+an+anti-tau+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody.</a> Scientific Reports. 5, 11161(2015).</li>
<li>Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Therapeutic+Mechanisms+of+Tau+Antibodies%3A+Promoting+Microglial+Clearance+Versus+Blocking+Neuronal+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica+communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Schneider, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-based+treatment+strategies+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases.</a> Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).</li>
<li>Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+uptake+into+neurons+occurs+primarily+via+clathrin-dependent+Fcgamma+receptor+endocytosis+and+is+a+prerequisite+for+acute+tau+protein+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).</li>
<li>Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Koenigsknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.jneurosci.org/content/24/44/9838.short">Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism.</a> Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).</li>
<li>Kopec, K. K., Carroll, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Peptide+1-42+Induces+a+Phagocytic+Response+in+Murine+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptive+immune+system+restrains+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+modulating+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小胶质细胞，即大脑的常驻免疫细胞，最近被确认为在针对tau蛋白病的抗体介导治疗策略中发挥重要作用的关键参与者10,11小胶质细胞介导的抗体清除tau蛋白及阻断神经元摄取9，抑制或破坏纤维形成13,14 神经元内纤维的清除 通过 溶酶体途径15，可能均有助于在tau蛋白病小鼠模型中观察到的抗tau抗体疗效5,6,7,8,9.
本文描述了一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取，旨在建立一种研究工具，以更深入地表征抗tau抗体作用机制。
该实验方法改编自Funk 等11使用 BV-2 细胞，即永生化的小鼠小胶质细胞。尽管它们无法完全等同于原代小胶质细胞，但具备许多原代小胶质细胞的特征，包括高效吞噬 Aβ 和 tau 纤维的能力。11,16,17,18,19此外，他们表现出可重复的行为 体外 这使得它们非常适用于需要极低实验变异性的检测方法开发和定量研究。此外，与使用原代小胶质细胞相比，永生化细胞系可实现更高的检测通量，并避免了动物牺牲的需要。
本实验所用的tau蛋白聚集体是通过高度可重复的方法获得的 体外 我们近期描述的聚集实验步骤13，且形态与从阿尔茨海默病（AD）患者脑组织中分离出的成对螺旋纤维（PHFs）相似。尽管我们未观察到由tau蛋白聚集体黏附于塑料或玻璃表面所导致的意外结果，但使用稳定且特征明确的tau蛋白聚集体对该检测方法的可重复性起到了关键作用。
显著影响实验可重复性的另一个方面是细胞密度。本方案中所述每孔细胞数量代表了在所述条件下最佳的细胞密度。
与Funk et al.11所描述的方法不同，我们使用了一种对pH敏感的染料标记tau蛋白聚集体&#160;，该染料在进入酸性细胞器后荧光信号显著增强，从而实现细胞内tau的定量检测。结合胰蛋白酶消化细胞表面结合的免疫复合物和/或tau蛋白，可确保流式细胞术检测到的荧光信号来源于tau的内化摄取，而非其在细胞表面的结合。此外，使用pH敏感染料可在显微镜实验中更便捷地检测内化的tau聚集体，无需消化表面结合的免疫复合物或tau聚集体，从而避免了细胞重新铺板和恢复培养的额外步骤。
与先前报道的方法相比11，我们进一步优化了检测方法的显微镜读取结果，在显微镜实验中使用了一种针对酸性细胞器的高度选择性染料&#160;，这不仅使我们能够确认抗体介导的tau蛋白摄取，还能确定tau蛋白聚集体在内体-溶酶体区室中的定位。
我们开发的检测方法具有最佳的特异性，能够产生良好的实验窗口，从而实现阳性样本与阴性样本之间的显著区分。有趣的是，该检测方法可间接检测抗体亲和力的差异，因此是研究抗tau抗体效应功能的有力工具。

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是淀粉样蛋白β肽和tau蛋白发生构象改变，并自我组装形成病理性聚集体。正常的可溶性淀粉样蛋白β肽会转化为寡聚体和纤维状淀粉样蛋白β，而异常磷酸化的tau蛋白则以寡聚体和神经原纤维缠结的形式积累1,2。这些蛋白质聚集体导致神经元死亡，进而引起记忆丧失和持续进行性的认知功能下降。其他因素，包括无效的神经炎症反应以及清除错误折叠蛋白能力的下降，可能加剧并加速疾病进展。目前针对AD的干预策略主要提供对症缓解，尚无能够改变疾病进程的治疗方法或预防手段。
越来越多的证据表明，过度磷酸化的 tau 蛋白聚集体在阿尔茨海默病（AD）的病理过程中起着关键作用。在非病理状态下，tau 是一种天然未折叠蛋白，可结合微管并促进其组装形成神经元细胞骨架。当 tau 蛋白发生过度磷酸化时，会从细胞骨架上解离，并在神经元内聚集形成 tau 聚集体，这些聚集体被认为导致了与 AD 相关的大部分病理变化3聚集的tau蛋白最初在细胞内开始积聚，但随着疾病进展，推测其会从受损神经元释放到细胞外空间，并可被邻近或突触连接的健康神经元摄取，从而以一种 &#34;类朊病毒方式&#34;一旦被细胞内化，tau 聚集体便会诱导更多的 tau 蛋白发生聚集 通过 模板化构象变化4.
根据这一假说，能够阻断tau蛋白种子效应的疗法可能减缓甚至逆转tau蛋白介导的神经退行性疾病的进程。支持这一观点的证据表明，通过基因突变使小鼠易感tau蛋白病，并被动注射抗tau抗体后，其tau蛋白病理改变减少，认知功能得到改善5,6,7,8,9。然而，治疗性抗体减少病理改变的具体机制仍不明确。
一种被提出的作用机制是，小胶质细胞（大脑的常驻免疫细胞）通过抗体介导的方式摄取并清除病理性聚集的tau蛋白。近期研究表明，小胶质细胞能够高效地内化并降解病理性tau蛋白亚型，而抗tau抗体可增强这一能力。 通过 一种依赖于Fc的机制，涉及小胶质细胞表面表达的Fc受体及受体介导的吞噬作用10,11这些数据表明，小胶质细胞可能是治疗性抗体的重要效应分子。
本文介绍一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取。利用该检测方法获得的数据有助于阐明抗tau抗体的作用机制，因此可作为推动抗tau抗体向潜在AD治疗药物研发后续&#160;阶段发展的有效工具。

<table><tbody><tr><td>BV-2 细胞</td><td>ICLC 细胞库</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基（葡萄糖 4.5 g/dL）</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>EasYFlask 培养瓶</td><td>Nunc</td><td>156499 / 159910</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green STP 酯</td><td>Life Technologies</td><td>P35369&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 pH 8.5 100 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PD10 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&amp;nbsp;多孔培养板</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 孔检测板</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 (20 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr></tbody></table>

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除tau蛋白

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是脑内聚集的tau蛋白和淀粉样蛋白累积，导致神经元功能障碍，最终引发认知能力下降。目前认为，神经元内过度磷酸化的tau蛋白聚集物是导致AD相关病理变化的主要原因。这些聚集物被认为会释放到细胞外空间，并被邻近的健康神经元摄取，从而在其中诱导进一步的tau蛋白聚集。 &#34;类朊病毒样&#34; 传播可被能够结合并 &#34;中和&#34; 在阿尔茨海默病（AD）的临床前小鼠模型中，已证实细胞外tau蛋白聚集体的存在。治疗性抗体减轻病理的一种提出机制是通过小胶质细胞介导的抗体依赖性摄取与清除病理性聚集形式的tau蛋白。本文描述了一种定量的基于细胞的检测方法，用于评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取。该方法采用小鼠小胶质细胞系BV-2，具有高特异性、低变异性及中等通量的特点。利用该检测所获得的数据有助于更深入地表征抗tau抗体的效应功能。

聚集的重组tau蛋白被共价标记了一种pH敏感的绿色染料。该染料在被酸性细胞器内化后荧光显著增强，从而实现细胞内定量检测。将标记后的tau聚集体与抗tau单克隆抗体共同孵育。具体而言，我们使用了CBTAU-28.1的一种嵌合形式（小鼠IgG1 Fc区）。该人源抗体可结合tau蛋白的N端插入区域，并具有结合能力 体外 生成的tau蛋白纤维13在本实验中，我们还测试了CBTAU-28.1的亲和力增强型变体——dmCBTAU-28.1。实验使用亲代型和高亲和力突变型的CBTAU-28.1 Fab片段以及小鼠IgG1同型对照作为对照。
在肝素存在下，将BV-2细胞与预先形成的免疫复合物或单独的聚集态tau蛋白共同孵育两小时，以阻断抗体非依赖性的tau摄取。孵育后，用胰蛋白酶消化细胞以去除结合在细胞外膜上的tau蛋白，并通过流式细胞术分析tau的摄取情况。正如我们近期所报道13，CBTAU-28.1变体能够以剂量依赖的方式促进BV-2细胞对tau蛋白的摄取。该摄取过程由Fc段介导，因为CBTAU-28.1的Fab片段未能增加基础水平的tau摄取（图2）。此外，与野生型抗体相比，高亲和力的dmCBTAU-28.1抗体介导tau蛋白进入BV-2细胞的程度更高（图2）。
通过共聚焦显微镜确认了抗体介导的tau蛋白摄取以及tau聚集体在内体-溶酶体区室中的定位（图3），其中使用对低pH细胞器具有选择性的探针对酸性细胞区室进行染色。在与CBTAU-28.1共同孵育的细胞内，观察到绿色pH染料标记的tau聚集体形成的细胞内点状结构。此外，细胞内tau聚集体常与选择性红色低pH染料标记的区室共定位，提示tau聚集体存在于酸性细胞器中。CBTAU-28.1的Fab片段未增加tau蛋白的摄取，再次表明其内化机制依赖于Fc受体（图3）。
<img alt="流式细胞术散点图、BV-2细胞门控、FITC-A直方图、rTau+细胞定量、分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：流式细胞术分析中用于检测BV-2细胞摄取tau蛋白的门控策略。 图中显示了仅BV-2对照组（A-C）、同型对照组（D-F）和dmCBTAU-28.1处理组（G-I）的代表性数据。首先在FSC-A与SSC-A密度图上圈选BV-2细胞群体，排除碎片和死亡细胞（A、D、G）；随后在FSC-A与FSC-H密度图上进一步圈选，以排除细胞双联体和聚集体（B、E、H）。利用单细胞门控生成pH荧光染料（本代表性结果中为FITC）的单参数直方图（C、F、I），并测定几何平均荧光强度。或者，通过仅BV-2对照组确定阴性细胞范围，进而计算pH荧光染料-tau阳性细胞的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光和rTau细胞浓度图、蛋白质结合分析、实验数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：CBTAU-28.1介导tau聚集体被小胶质BV-2细胞摄取。将重组tau蛋白聚集体共价标记绿色荧光pH敏感性染料，并与人源抗tau抗体CBTAU-28.1的小鼠嵌合体、其亲和力优化形式dmCBTAU-28.1、相应的Fab片段、小鼠IgG1同型对照抗体或无抗体（仅tau聚集体）共同孵育。随后将免疫复合物与BV-2细胞在肝素存在下孵育两小时，以阻断抗体非依赖性的tau摄取。通过流式细胞术评估免疫复合物的摄取情况，并以荧光强度的几何平均值（GM）（A）或tau阳性（tau+）细胞百分比（B）表示。图（A）中的误差条表示两次独立实验的标准差，而图（B）显示单次实验结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Tau 聚集体免疫荧光、溶酶体追踪、Hoechst 染色、细胞研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：Tau 聚集体被 BV-2 细胞摄取并定位于细胞内的酸性细胞器中。预先形成的 Tau-抗体免疫复合物在肝素存在下与 BV-2 细胞共孵育两小时，以阻断抗体非依赖性摄取。孵育后，细胞核使用特异性的蓝色 DNA 染料染色，酸性细胞区室则使用对低 pH 区室具有选择性的红色染料染色。活细胞成像显示，在与 CBTAU-28.1 和 dmCBTAU-28.1 共孵育的细胞内，可见标记的 Tau 聚集体（绿色）形成细胞内点状信号，而同型对照组则无此现象。此外，细胞内的 Tau 聚集体常与红色染料信号共定位（呈现黄色），提示 Tau 聚集体存在于酸性细胞区室中。CBTAU-28.1 的 Fab 片段未增加 Tau 的摄取，表明其内化机制依赖于 Fc 受体。图像代表使用 63X 水浸物镜获取的 20 层 Z 轴堆栈图像（每层 0.5 µm）的最大强度投影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取，旨在建立一种研究工具，以更深入地表征抗tau抗体作用机制。

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是脑内聚集的tau蛋白和淀粉样蛋白累积，导致……

治疗性抗 Tau 抗体减轻阿尔茨海默病病理的潜在机制之一，是小胶质细胞摄取并清除病理性聚集的 Tau 蛋白。本文介绍了用于评估小胶质细胞对 Tau 摄取能力的细胞水平检测方法。该检测是一种有用的实验工具，可更深入地表征抗 Tau 抗体作用机制。实验第一天，首先用1× PBS清洗培养瓶中的BV-2细胞。随后加入0.5%胰蛋白酶-EDTA，在37°C、5% CO₂条件下孵育，直至细胞从培养瓶壁脱落。用移液器上下吹打3至5次，将细胞重悬于培养基中。计数细胞，并用含有200微克/毫升肝素的培养基制备细胞悬液，终浓度为每毫升100,000个细胞。将250微升该细胞悬液加入96孔平底组织培养板的每个孔中。将培养板置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。将预先制备的pH染料-Tau聚集体在冰上解冻后，用无血清培养基稀释至每孔65微升，配制成500纳摩尔的溶液。用65微升无血清培养基稀释抗体，使其浓度达到目标浓度的两倍。在96孔U型底板中混合pH染料-Tau聚集体与抗体。密封此稀释板，并在37摄氏度下孵育过夜。次日，从含有BV-2细胞的96孔板中移除培养基。用100 µL室温的1×PBS洗涤每个孔中的细胞。从BV-2细胞板中移除PBS。使用多通道移液器将125微升稀释板中的氨基复合物转移至96孔BV-2细胞板的每孔中，在37摄氏度、5%CO2条件下孵育2小时。孵育结束后，从细胞中移除氨基复合物，并用100微升室温1×PBS洗涤每孔细胞。吸除 1× PBS 后，加入 50 微升 25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。随后，加入 200 微升培养基，通过上下吹打重悬细胞以使其脱离。将细胞转移至 96 孔 U 型底板，于 4 摄氏度以 400 × g 离心 5 分钟。将培养板置于冰上，吸除上清液。加入150 µL预冷的1×PBS，然后在4 °C下以400 ×g离心5分钟。将培养板放在冰上，弃去之前加入的1×PBS，每孔加入150 µL预冷的1×PBS，再次洗涤。在相同条件下再次离心。将培养板置于冰上，弃去之前加入的 PBS，每孔加入 150 µL FACS 缓冲液以洗涤细胞。在 4°C 下以 400 ×g 离心 5 分钟。将培养板置于冰上，吸去之前加入的FACS缓冲液，并将细胞重悬于每孔200 µL FACS缓冲液中。立即进行FACS分析，在活细胞门内采集20,000个事件。进行FACS分析时，使用前向散射面积（FSCA）与侧向散射面积（SSCA）密度图，通过排除前向散射信号较低的事件（如碎片和死细胞），圈选活细胞门。然后，在活细胞群体中，利用FSCA与前向散射高度（FSCH）作图，建立单细胞门控，排除细胞双联体和聚集体。接着，利用单细胞门控内的事件绘制pH荧光染料的单参数直方图。使用生成的直方图首先确定平均荧光强度。随后，通过排除仅使用 BV-2 对照所确定的阴性细胞，计算 pH 染料-Tau 阳性细胞的百分比。流式细胞术结果显示，CBTau-28.1 抗体以剂量依赖性方式促进 BV-2 细胞对 Tau 的摄取。与野生型抗体相比，高亲和力双突变型 CBTau-28.1 抗体在 BV-2 细胞中介导的 Tau 摄取程度更高。CBTau-28.1 Fab 片段未增加基础 Tau 摄取，表明其内化机制依赖于 Fc 受体。共聚焦显微镜证实抗体介导了 Tau 摄取的增加。绿色 pH 荧光染料标记的 Tau 聚集体常与溶酶体红色荧光染料（Lysotracker Red）标记的酸性细胞器共定位，提示 Tau 聚集体存在于内溶酶体区室中。CBTau-28.1 的 Fab 片段未再次增加 Tau 的摄取，表明该摄取过程确实由 Fc 介导。我们刚刚描述的这一检测方法可让我们特异性且稳定地定量小胶质细胞中抗体介导的 Tau 摄取。利用该检测方法获得的数据有助于阐明抗 Tau 抗体的作用机制，因此可作为推动抗 Tau 抗体向潜在阿尔茨海默病治疗药物进一步开发的有力工具。

cell-based-assay-to-study-antibody-mediated-tau-clearance-by-microglia

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

微胶质细胞抗体介导的陶氏清除研究

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

本视频展示了一种基于细胞的检测方法，该方法利用pH敏感的荧光标记Tau蛋白聚集体，通过荧光激活细胞分选技术定量分析小鼠小胶质细胞对Tau蛋白的摄取。...

一种基于细胞的检测方法用于评估小胶质细胞对Tau蛋白的摄取

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

本文介绍了一种利用甲氧基-X04对阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样Aβ斑块进行可视化成像的实验方案。甲氧基-X04可穿过血脑屏障，并特异性结合致密核心Aβ斑块中的β-折叠片层结构，从而可在进行免疫染色及电镜制样前对含斑块的组织切片进行预筛选。...

相关光学显微镜与电子显微镜技术研究小胶质细胞与β-淀粉样蛋白斑块的相互作用

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于确定纳米颗粒对神经毒性的影...

小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。...

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau...

通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

本方案详细描述了小鼠脑组织中IBA1和TMEM119的免疫荧光共染色逐步操作流程，以及小胶质细胞密度、分布和形态的分析，同时包括外周髓系细胞浸润的检测。...

利用 IBA1 和 TMEM119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。...

从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。...

利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

了解利用BV-2小鼠小胶质细胞系定量检测抗体介导的Tau蛋白聚集体内吞的实验方法。该方案通过流式细胞术和共聚焦显微镜揭示Fc受体依赖的清除机制，为阿尔茨海默病免疫治疗研究提供可靠工具。

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白

探索更多视频