筛选棉花基因型对肾形线虫的抗性

该方法有助于培育抗肾形线虫的棉花品种，通过鉴定其他棉花物种中的抗性基因型并评估育种群体。该技术的主要优势在于提供了一种简单且非破坏性的肾形线虫筛选方法。

首先，在每个直径4厘米、高21厘米的圆锥形塑料盆底部放入一团棉花，每粒种子对应一个盆。然后将经过蒸汽灭菌的土壤混合物装入盆中，至距离盆口约2厘米处。在每个盆中插入一根塑料标签，标明将要种植的基因型，并在每个盆中播种一粒相应基因型的棉花种子。

用额外的土壤填满每个花盆以覆盖种子，并将花盆放入设定为28摄氏度恒温的生长室中，光照周期为16小时荧光灯和白炽灯照射。然后将滴灌头插入每个花盆中，使用自动灌溉系统每天浇水两次。播种后7天，在每株植物旁边的土壤中挖一个小型凹穴，并向每个凹穴中加入1毫升肾形线虫悬浮液。

接种后，需仔细控制盆中水量，以防止将线虫从根区冲走。接种28天后，用剪刀剪去植株上大部分完全展开的叶片，然后挤压花盆，将土壤连同植株一起滑入手中取出。将根系置于10升容器的自来水内轻轻振荡，以去除根部附着的土壤，随后再用干净的自来水在另一容器中短暂冲洗。

使用剪刀在土壤线以下约一厘米处将清理干净的根系从植株上剪下。将根系放入一个120毫升的塑料非无菌一次性样本容器中。接着，用约30毫升的红色食用染料溶液完全覆盖根系，并将样本容器放入微波炉中加热染色液，直至溶液开始沸腾。

当样品冷却至室温后，用 100 毫升自来水替换红色食用色素溶液，以去除任何过量的染料。然后盖上标本容器的盖子，并将样品在 4°C 下保存，直至进行根部侵染分析。为回收植株用于种子生产，将一团棉花置于新的锥形塑料盆底部，并用泥炭藓盆栽基质部分填满该盆。

将一个收获的营养枝根系放入花盆中，并牢固地添加盆栽基质以填满花盆。在每个花盆中插入一根新标记的塑料支柱，用于标识棉花基因型，并将整盘花盆置于盛有水的塑料容器中。短暂浇水以润湿盆栽基质，然后将花盆放入生长室中，设置恒定温度为 28 °C，光照周期为 16 小时。

大约30天后，为每株植物准备一个6升的塑料盆，并用培养基质部分填满。将每株植物移栽至6升盆中，每栽植一株幼苗即紧实添加培养基质。然后将植物置于玻璃温室中，并加水使基质保持湿润。

为了评估琴瑟根结线虫（R. reniformis）对根部的侵染情况，从样本容器中取出一份根部样品。在20倍放大倍数下，使用体视显微镜计数附着在根系上的雌性线虫数量。线虫对根系的成功侵染可能受多种因素影响，包括接种所用线虫的活性以及季节变化，因为线虫在冬季活动性较低。

然后将根系置于纸巾上约10分钟，以去除多余水分。称量根系以确定根鲜重。不同切除样本间的根系生长差异较为常见。

这些变异可通过鲜根重量进行测量，在相同基因型的植株之间也可观察到。与感病棉花基因型相比，抗性棉花基因型中成功建立取食位点的雌性肾形线虫数量相对较少。可通过鲜根重量数据计算每克根组织中雌性肾形线虫的数量，以比较不同基因型间的差异。

对于抗性基因型，每克根中肾形线虫的雌虫数量通常少于10条，而感性基因型每克根中通常含有超过30条线虫。此处展示的是来自一个包含300株植物的分离F2群体的部分数据。在进行线虫评价时，根系生长和线虫侵染程度的此类变异范围较为常见，这说明本方法能够在单次实验中筛选大量植株，减少变异，并有助于准确评估抗性遗传特性。

通过该方法，可确定抗肾形线虫的遗传机制，从而鉴定出与抗性相关的DNA标记。这些标记可用于标记辅助育种，以及将线虫抗性转移至陆地棉。该技术建立后，为研究人员提供了一种非破坏性方法，可在重新进行线虫筛选后回收植株，从而助力抗性棉花品种的培育。