Name: 筛选抗内虫抗性棉基因型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 了解快速无损筛选棉花抗肾形线虫基因型的方法。该技术通过根部染色和显微镜计数评估感染程度，支持大规模育种群体筛选，并可回收植株用于后续育种，为培育抗性品种提供高效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国农业部农业研究局资助。本文中提及的商标名称和商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部对其有任何推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。作者声明无利益冲突。技术协助由Kristi Jordan提供。

1. 维持具瘤根结线虫（R. reniformis）接种源
<ol>
	<li>将15 cm直径、13.5 cm高的红陶土花盆填入经蒸汽巴氏消毒的混合基质，基质由1份砂壤土&#160;和2份沙子组成。在每个花盆中种植易感番茄（Solanum lycopersicon）品种，并将花盆置于温室中。 
	注意：也可使用其他易感植物品种（如棉花）代替番茄。</li>
	<li>用线形肾形线虫接种番茄植株（参见步骤3.3）。在温室中将植株维持在约28 °C的温度条件下。</li>
</ol>
2. 种植棉花基因型以评估对R. reniformis的抗性
<ol>
	<li>将2份细沙与1份砂质壤土混合，制备土壤&#160;从野外采集。</li>
	<li>对土壤混合物进行蒸汽巴氏消毒，以确保土壤中无线虫和土传植物病原体。</li>
	<li>将土壤混合物加入圆锥形塑料盆（直径4 cm，高21 cm）中。在装土前，先在盆底放置一团棉花，以防止土壤流失。将土壤填充至距盆口约2 cm处。</li>
	<li>为每个花盆准备一根塑料标签桩，用于标明将要种植的基因型。</li>
	<li>种植用于评价的棉花基因型的种子。
	<ol>
		<li>在评估分离群体时，每个花盆中播种一粒种子，每粒种子代表一种独特的基因型。</li>
		<li>对于棉花品种或种质资源材料，每盆播种2至3粒种子，以确保至少有一株成功萌发，其余幼苗在接种线虫前从盆中移除。 
		注意：或者，种子可在播种前萌发24至72小时，以减少因种子无活力而导致的无效种植盆数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>种植选定的抗性与感性对照基因型的植物种子。 
	注意：对照基因型需重复5到10次，以评估筛选方法本身固有的自然变异。</li>
	<li>用额外的土壤填满花盆，以覆盖每个花盆中的种子。</li>
	<li>将花盆放入生长室中。生长室温度保持恒定在28 °C，即环境空气温度。采用荧光灯与白炽灯混合光源提供人工照明，光照周期为16小时。</li>
	<li>在每个花盆中放置滴灌头，使用自动灌溉系统每天浇水两次。根据植物的生长情况，调节灌溉系统以增加供水量。</li>
</ol>
3. 棉花植株的线虫接种及根部样品制备
<ol>
	<li>在接种前一天，采用淘洗法19和离心漂浮法20，从感病番茄植株上提取虫形肾形线虫（见步骤1）。将提取的线虫在4 °C下保存。 
	注：贝尔曼漏斗法提取21是线虫提取的替代方法。</li>
	<li>通过计数100 µL样品中线虫的数量，确定所提取线虫的总数，并用自来水配制含1,000条线虫/mL的悬浮液用于接种。</li>
	<li>在播种后7天，用线虫悬浮液接种棉花幼苗。在植株旁的土壤中挖一个小凹坑，用移液器将1 mL肾形线虫悬浮液加入凹坑中。</li>
	<li>接种后28天，取出植株进行线虫评估。 
	注：此时植株高度约为15 cm，具有4至6片完全展开的叶片。
	<ol>
		<li>在将植株从盆中取出前，用剪刀剪除大部分完全展开的叶片。</li>
		<li>为取出植株，轻轻挤压花盆，将土壤连同植株一起滑入手掌中。</li>
		<li>将根系在10 L容器内的自来水中轻轻晃动，以去除根部附着的土壤。随后在另一容器的清洁自来水中短暂漂洗根系。</li>
		<li>用剪刀在土壤线以下约1 cm处剪下根系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将根系放入一个120 mL的塑料、非无菌、一次性样本容器中，并放入原花盆中的塑料标签桩以便识别。 
	注：&#160;在进入步骤3.7之前，可同时处理多个样本。接下来进入步骤4，对植株地上部分进行营养繁殖。</li>
	<li>用自来水配制12.5%（v/v）的红色食用染料溶液，用于染色附着在根系上的线虫17。</li>
	<li>向样本容器中的根系样品加入约30 mL红色食用染料溶液，确保完全浸没根系。</li>
	<li>将样本容器放入微波炉中加热，直至染色液开始沸腾。取出样本后，于室温下冷却。</li>
	<li>倒去根系样品中的红色食用染料溶液，向样本容器中加入约100 mL自来水以去除多余染料。盖上容器盖子，将样品在4 °C冰箱中保存。接下来进入步骤5，评估根部感染情况。 
	注：&#160;在进入步骤5之前，本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
4. 营养繁殖以恢复植株用于种子生产
<ol>
	<li>在锥形塑料花盆底部放入一团棉花（参见步骤 2.3），并用泥炭藓栽培基质部分填满花盆。然后将营养枝放入花盆中，并牢固地添加栽培基质直至填满花盆。在每个花盆中插入一根新标记的塑料支撑杆，以标明棉花基因型。</li>
	<li>将花盆托盘放入一个塑料容器（长 73.6 cm × 宽 45.7 cm × 高 15.2 cm）中，并加入水，短暂浇水以润湿栽培基质。将花盆置于生长室中，设置恒温 28 °C，光照周期为 16 小时。根据需要向塑料容器中补充水，以保持基质湿度。</li>
	<li>约 30 天后，将植株移栽至较大的花盆中用于种子生产。用栽培基质部分填满一个 6 L 的塑料花盆（参见步骤 4.1），从原小花盆中取出植株，将其放入 6 L 花盆中，并牢固地添加栽培基质直至填满花盆。</li>
	<li>将植株移入玻璃温室中，并加水润湿栽培基质。将温室温度维持在约 28 °C（无需人工照明）。
	<ol>
		<li>根据需要手工浇水，持续约 30 天。</li>
		<li>当约 75% 的植株需要每日浇水时，改用自动浇水系统进行每日浇水。根据植株生长需要，调整自动浇水系统以增加浇水频率。</li>
		<li>在花芽起始前，向每个花盆中添加约 10 g 缓释肥料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>植株成熟后进行收获，并处理棉花种子样品以获得用于进一步评估的种子。
	<ol>
		<li>收获棉花种子时，手工从植株上打开的棉铃中取出棉花，并放入标记好的纸袋中。种子附着在棉纤维上，后续步骤将去除这些纤维。</li>
		<li>使用 10 锯片实验室轧花机去除种子样品上的绒毛纤维。</li>
		<li>使用浓硫酸去除种子样品上的短绒纤维。将种子样品在 15%（v/v）的碳酸钠溶液中中和，用自来水冲洗样品，并在强制通风干燥器中干燥样品。</li>
		<li>将种子样品放入标记好的信封中储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. R. reniformis 根部感染的评估
<ol>
	<li>从样本容器中取出根系样本，在体视显微镜（20倍放大）下计数附着在根系上的雌性线虫数量。 
	注意：&#160;只有肾形线虫的雌性个体能够侵染植物根部。</li>
	<li>将根系置于纸巾上约10分钟，以去除多余水分。称量根系重量，记录鲜根重。</li>
	<li>将线虫数量和鲜根重数据输入计算机电子表格程序，计算每克根组织中的雌性线虫数量。</li>
</ol>

<ol><li>Heald, C. M., Robinson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+current+distribution+of+Rotylenchulus+reniformis.+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States.</a> Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).</li>
<li>Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. <a target="_blank" href="http://www.apsnet.org/publications/plantdisease/2004/February/Pages/88_2_100.aspx">Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges.</a> Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).</li>
<li>Robinson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reniform+in+U.S.+cotton%3A+when%2C+where%2C+why%2C+and+some+remedies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).</li>
<li>Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287486592_Rotylenchulus_species_Identification_distribution_host_ranges_and_crop_plant_resistance">Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance.</a> Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).</li>
<li>Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotylenchulus+reniformis+management+in+cotton+with+crop+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation.</a> Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).</li>
<li>Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+nematode+management+in+cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">The future of nematode management in cotton.</a> Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).</li>
<li>Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255648326_Reniform_Nematode_Resistance_in_Upland_Cotton_Germplasm">Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm.</a> Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).</li>
<li>Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/250117962_Resistance_to_Rotylenchulus_reniformis_and_Meloidogyne_incognita_Race_3_in_the_Major_Cotton_Cultivars_Planted_Since_1950">Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950.</a> Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).</li>
<li>Carter, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+resistant+reaction+of+Gossypium+arboreum+to+the+reniform+nematode%2C+Rotylenchulus+reniformis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis.</a> Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).</li>
<li>Erpelding, J. E., Stetina, S. R. <a target="_blank" href="https://scinapse.io/papers/2101431983">Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728.</a> World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).</li>
<li>Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. <a target="_blank" href="https://www.cotton.org/journal/2004-08/3/upload/jcs08-191.pdf">New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton.</a> Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).</li>
<li>Robinson, A. F., Percival, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+Meloidogyne+incognita+race+3+and+Rotylenchulus+reniformis+in+wild+accessions+of+Gossypium+hirsutum+and+G.+barbadense+from+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico.</a> Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).</li>
<li>Stetina, S. R., Young, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+female+and+egg+assays+to+identify+Rotylenchulus+reniformis+resistance+in+cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton.</a> Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).</li>
<li>Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. <a target="_blank" href="http://journals.fcla.edu/nematropica/article/view/69719">Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis.</a> Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).</li>
<li>Yik, C. -P., Birchfield, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistant+germplasm+in+Gossypium+species+and+related+plants+to+Rotylenchulus+reniformis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis.</a> Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).</li>
<li>Stetina, S. R., Erpelding, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gossypium+arboreum+accessions+resistant+to+Rotylenchulus+reniformis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis.</a> Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).</li>
<li>Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+food+coloring+stain%3A+new%2C+safer+procedures+for+staining+nematodes+in+roots+and+egg+masses+on+root+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces.</a> Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).</li>
<li>Erpelding, J. E., Stetina, S. R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbr.12560">Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895.</a> Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).</li>
<li>Byrd, D. W. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+semi-automatic+elutriators+for+extracting+nematodes+and+certain+fungi+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil.</a> Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).</li>
<li>Jenkins, W. R. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19650801105">A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil.</a> Plant Disease Reporter. 48 (9), 692(1964).</li>
<li>Robinson, A. F., Heald, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/19283091/">Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis.</a> Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).</li>
<li>Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).</li>
<li>Schmitt, D. P., Shannon, G. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/32/1/CS0320010275">Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races.</a> Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了评估抗性遗传特性以及培育抗性品种，需要一种有效的筛选方案来：1）鉴定抗R. reniformis的棉花基因型；2）培育抗性品种。大多数方案通过从棉花根系或盆栽土壤中提取线形线虫或虫卵，来评估R. reniformis的种群密度或繁殖率8,11,12,14,15。这些方法通常更为耗时，且实验内部及实验之间的结果变异性较大。此外，在未设重复的温室实验中，使用这些方案可能导致棉花基因型更频繁地被误判11。然而，对于所评估的不同方案或参数，仍可获得相似的结果9,13。
<p c...

Rotylenchulus reniformis（Linford 和 Oliveira），通常称为肾状线虫，是美国东南部土壤中主要的寄生性线虫物种之一1,2,3。该线虫是一种专性定居型半内寄生线虫，必须依赖寄主植物完成其生活史2,4。幼虫期的雌性线虫呈蠕虫状，可侵入寄主植物的根系，并在中柱内建立取食位点2,3。随着线虫取食并逐渐成熟，其位于寄主根外的后部在产卵期间会膨胀，形成典型的肾形结构（图1）。Rotylenchulus reniformis 能够侵染超过300种植物的根系，包括棉花4。陆地棉（Gossypium hirsutum L.）在美国东南部广泛种植，但由于缺乏对 R. reniformis&#160;具有抗性的品种，导致线虫防控困难2,3。目前采用的防控策略包括使用杀线虫剂以及与非寄主作物轮作，以降低土壤中 R. reniformis 的种群密度5,6，但籽棉产量损失通常仍可达1%至5%2。R. reniformis 感染的症状可能包括植株矮化、根系生长受抑、营养缺乏、落果以及成熟延迟2。然而，由于田间症状分布均匀，可能不易察觉；因此，需要有效的评估方法来检测 R. reniformis 感染，以鉴定和培育抗性陆地棉品种。棉花对 R. reniformis 抗性的评价被认为较为困难7，因为即使植株表现出感染症状，其受侵染的根系外观仍可能看似正常8。
为了从棉花种质资源库中鉴定出对 R. reniformis&#160; 具有抗性的材料，并确定这些材料的抗性遗传特性，需要建立一种有效的线虫筛选方案。该方案将有助于将抗性基因导入陆地棉。已有多种生物测定方法被用于评估棉花中 R. reniformis 的侵染情况8,9,10,11,12,13,14,15。总体而言，目前用于鉴定 R. reniformis 抗性棉花基因型的方法主要有两类。最常用的方法是从未病植株或土壤中提取卵和/或蠕虫状线虫8,11,12,14,15。该方法的一般流程为：将不同棉花基因型的种子分别种植于独立的花盆中，待幼苗生长7至14天后，通过向土壤中添加含有 R. reniformis 蠕虫态线虫的混合液进行接种，随后让线虫侵染根系30至60天。接着，从每株植物的受侵染根系或盆栽土壤中提取蠕虫状线虫和/或卵。通过计数所提取的线虫或卵的数量，估算其种群密度和繁殖率，并与对照基因型进行比较，从而鉴定出具有抗性的基因型。
另一种替代方法（如本文所述）包括在显微镜下检查被线虫侵染的棉花根系，以确定寄生在根部的雌性线虫数量10,16。与其他方法类似，将不同棉花基因型分别种植于独立的花盆中，并在播种后约7天接种蠕虫状线虫。接种后30天内，从各植株上取出根系，并将根部附着的土壤冲洗干净。随后，使用红色食用染料对附着在根系上的线虫进行染色17，并在显微镜下观察根系，统计感染位点的数量，从而比较抗性棉花基因型（依据每克根组织中的线虫数量确定）与感性对照之间的差异16。该第二种方法的优势在于提高了通量，缩短了评估所需天数，并可在单次实验中评估更多独立基因型。相比基于感染症状视觉观察的筛选方法，评估种群密度或繁殖率的方法通常更为耗时7。然而，该方法的一个局限性在于无法评估由卵产量所反映的、抑制线虫繁殖的寄主植物抗性13。
筛选方案 R. reniformis 抗性常在评估过程中破坏根系7 并涉及丢弃营养枝。为克服这一限制，已开发出一种营养繁殖方法，以实现植株的回收用于种子生产18在去除根系以进行线虫评估后，将营养茎种植于盆栽土壤中，以促进根系重新生长。该方法适用于大多数 R. reniformis 筛选方案。一种简单快速的无性繁殖方法对于育种至关重要 R. reniformis 需要恢复后代以将抗性基因型推进到下一代的抗性陆地棉品种。
本文介绍了一种用于大规模筛选棉花基因型对肾形线虫抗性的实验方案。该方案旨在建立一种简单、快速且非破坏性的筛选方法，以评估棉花育种群体对线虫的抗性，从而助力抗性陆地棉品种的培育。采用本方案，通常可在35天内获得数据，单次实验可评估超过300个基因型。文中提供了抗性与感性基因型的数据，以展示使用该方法时常见的变异情况。

<table><tbody><tr><td>Ray Leach 锥形容器</td><td>Stuewe and Sons Inc.</td><td>SC10U</td><td></td></tr><tr><td>锥形容器托盘</td><td>Stuewe and Sons Inc.</td><td>RL98</td><td></td></tr><tr><td>沙子</td><td>多种品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td>多种品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pylon 4 英寸植物标签（4 英寸长 × 5/8 英寸宽）</td><td>Pylon Platics</td><td>L-4-W</td><td>任何品牌或供应商均可接受。</td></tr><tr><td>4 盎司样品容器</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-731</td><td>任何品牌或供应商均可接受。</td></tr><tr><td>红色食用色素</td><td>McCormick &amp;amp; Co., Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头</td><td>多种品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 L 容器</td><td>多种品牌</td><td></td><td>廉价的桶即可满足要求。</td></tr><tr><td>6 L 花盆</td><td>Nursery Supplies Inc.</td><td>Poly-Tainer-Can No2A</td><td>任何品牌或供应商均可接受。可使用不同尺寸的花盆。</td></tr><tr><td>育苗基质</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>Metro-Mix 360</td><td>任何品牌或供应商均可接受。</td></tr><tr><td>肥料</td><td>Everris NA Inc.</td><td>Osmocote Plus</td><td>任何品牌或供应商均可接受。</td></tr><tr><td>塑料容器（73.6 cm 长 × 45.7 cm 宽 × 15.2 cm 深）</td><td>Rubbermaid</td><td>3O29&amp;nbsp;</td><td>任何品牌或供应商均可接受。</td></tr></tbody></table>

筛选棉花基因型对肾形线虫的抗性

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

为了改进对根结线虫的防治，需要建立一种快速、非破坏性的肾形根结线虫（Rotylenchulus reniformis）筛选方法，以促进抗性棉花（Gossypium hirsutum）品种的培育。目前大多数方法需要从棉花根系或盆栽土壤中提取线虫的蠕虫状个体或虫卵，以测定其种群密度或繁殖率。这些方法通常耗时较长，且仅能评估少量基因型。本文介绍了一种替代方法，即通过肉眼观察根系的线虫侵染情况。该方法包括在棉花播种后7天接种蠕虫状线虫，并在接种后28天统计附着于根系上的雌虫数量。数据以每克鲜根重量上的雌虫数量表示，以校正根系生长差异带来的影响。该方法能有效评估与线虫建立侵染位点能力相关的寄主植物抗性；但无法评估抑制线虫繁殖的抗性类型。与其他筛选方法类似，该方法在实验内外不同个体基因型之间常观察到线虫侵染程度的变异。文中提供了数据以展示该方法所观察到的变异范围。为校正此类变异，实验中需包含对照基因型。尽管如此，该方法仍为评估寄主植物抗性提供了一种简便而快速的手段。该方法已成功用于从G. arboreum种质资源库中鉴定抗性材料，并用于评估超过300个个体的分离群体，以解析抗性的遗传基础。此外，还开发了一种营养繁殖方法，用于抗性育种中植株的回收。在线虫评估取样去除根系后，将地上营养茎重新栽种，以促使其形成新的根系。通常超过95%的茎段可成功发育出新根系，并正常生长至成熟。

Rotylenchulus reniformis 两种品种根系感染情况如图所示 图1. 与感病棉花基因型相比，较少的雌性肾形线虫能够在抗病棉花基因型上建立取食位点。不同材料间的根系生长存在差异，如图所示。 图2通过鲜根重量测定的这种变异，也可在同一基因型的植株之间观察到（表1). Gossypium arboreum 与陆地棉基因型相比，某些基因型通常表现出较低的根系生长速率。为校正这种差异，需收集根系鲜重数据，并据此计算每克根组织中雌性肾形线虫的数量。对于抗性基因型，每克根组织中雌性肾形线虫数量通常少于10个，而感性基因型每克根组织中线虫数量通常超过30个。
筛选棉花基因型对R. reniformis抗性的一个挑战是实验内部及实...

本文介绍了一种对棉花基因型进行快速、非破坏性筛选以鉴定其对肾形线虫抗性的实验方案。该方案包括通过肉眼观察感染线虫的棉花幼苗根部，以确定其感染反应。随后，通过营养繁殖每株植物的营养芽，获得植株用于种子生产。

一种快速、非破坏性的根结线虫（Rotylenchulus reniformis）筛选方案对于培育抗性棉花（Gossypium ...）至关重要

该方法有助于培育抗肾形线虫的棉花品种，通过鉴定其他棉花物种中的抗性基因型并评估育种群体。该技术的主要优势在于提供了一种简单且非破坏性的肾形线虫筛选方法。首先，在每个直径4厘米、高21厘米的圆锥形塑料盆底部放入一团棉花，每粒种子对应一个盆。然后将经过蒸汽灭菌的土壤混合物装入盆中，至距离盆口约2厘米处。在每个盆中插入一根塑料标签，标明将要种植的基因型，并在每个盆中播种一粒相应基因型的棉花种子。用额外的土壤填满每个花盆以覆盖种子，并将花盆放入设定为28摄氏度恒温的生长室中，光照周期为16小时荧光灯和白炽灯照射。然后将滴灌头插入每个花盆中，使用自动灌溉系统每天浇水两次。播种后7天，在每株植物旁边的土壤中挖一个小型凹穴，并向每个凹穴中加入1毫升肾形线虫悬浮液。接种后，需仔细控制盆中水量，以防止将线虫从根区冲走。接种28天后，用剪刀剪去植株上大部分完全展开的叶片，然后挤压花盆，将土壤连同植株一起滑入手中取出。将根系置于10升容器的自来水内轻轻振荡，以去除根部附着的土壤，随后再用干净的自来水在另一容器中短暂冲洗。使用剪刀在土壤线以下约一厘米处将清理干净的根系从植株上剪下。将根系放入一个120毫升的塑料非无菌一次性样本容器中。接着，用约30毫升的红色食用染料溶液完全覆盖根系，并将样本容器放入微波炉中加热染色液，直至溶液开始沸腾。当样品冷却至室温后，用 100 毫升自来水替换红色食用色素溶液，以去除任何过量的染料。然后盖上标本容器的盖子，并将样品在 4°C 下保存，直至进行根部侵染分析。为回收植株用于种子生产，将一团棉花置于新的锥形塑料盆底部，并用泥炭藓盆栽基质部分填满该盆。将一个收获的营养枝根系放入花盆中，并牢固地添加盆栽基质以填满花盆。在每个花盆中插入一根新标记的塑料支柱，用于标识棉花基因型，并将整盘花盆置于盛有水的塑料容器中。短暂浇水以润湿盆栽基质，然后将花盆放入生长室中，设置恒定温度为 28 °C，光照周期为 16 小时。大约30天后，为每株植物准备一个6升的塑料盆，并用培养基质部分填满。将每株植物移栽至6升盆中，每栽植一株幼苗即紧实添加培养基质。然后将植物置于玻璃温室中，并加水使基质保持湿润。为了评估琴瑟根结线虫（R. reniformis）对根部的侵染情况，从样本容器中取出一份根部样品。在20倍放大倍数下，使用体视显微镜计数附着在根系上的雌性线虫数量。线虫对根系的成功侵染可能受多种因素影响，包括接种所用线虫的活性以及季节变化，因为线虫在冬季活动性较低。然后将根系置于纸巾上约10分钟，以去除多余水分。称量根系以确定根鲜重。不同切除样本间的根系生长差异较为常见。这些变异可通过鲜根重量进行测量，在相同基因型的植株之间也可观察到。与感病棉花基因型相比，抗性棉花基因型中成功建立取食位点的雌性肾形线虫数量相对较少。可通过鲜根重量数据计算每克根组织中雌性肾形线虫的数量，以比较不同基因型间的差异。对于抗性基因型，每克根中肾形线虫的雌虫数量通常少于10条，而感性基因型每克根中通常含有超过30条线虫。此处展示的是来自一个包含300株植物的分离F2群体的部分数据。在进行线虫评价时，根系生长和线虫侵染程度的此类变异范围较为常见，这说明本方法能够在单次实验中筛选大量植株，减少变异，并有助于准确评估抗性遗传特性。通过该方法，可确定抗肾形线虫的遗传机制，从而鉴定出与抗性相关的DNA标记。这些标记可用于标记辅助育种，以及将线虫抗性转移至陆地棉。该技术建立后，为研究人员提供了一种非破坏性方法，可在重新进行线虫筛选后回收植株，从而助力抗性棉花品种的培育。

screening-cotton-genotypes-for-reniform-nematode-resistance

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

筛选抗内虫抗性棉基因型

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

介绍了两种不同的根结线虫植物筛选方法。所述方法包括以非破坏性方式对线虫进行高通量筛选，从而便于将这些植物用于育种项目。...

高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

在本视频中，我们展示了一种筛选试验，用于评估小分子杀线虫剂对线虫的杀灭效果。若经药物处理后，样品中活动性线虫数量减少，则认为该杀线虫剂有效。...

小分子杀线虫剂筛选实验：一种针对 Ditylenchus dipsaci 的中通量潜在杀线虫剂筛选方法

本文介绍了一种利用针头注射法将专性寄生真菌病原体Ustilago maydis接种于玉米和类蜀黍植物的方法。针头注射接种法可将真菌病原体精确地递送至植物叶片之间，病原菌在此处通过形成附着胞侵入植物体内。该方法效率高，能够实现U.

一种快速高效评估致病性的方法 Ustilago maydis 在玉米和大刍草品系上

病毒诱导的基因沉默是鉴定植物非寄主抗性相关基因的有效工具。我们展示了利用表达 GFPuv...

通过VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性的基因

本实验方案旨在对莴苣（Lactuca sativa...

半高通量筛选生菜（Lactuca sativa）种质资源中潜在的耐旱性材料

本文介绍了一种对烟草幼苗进行 Phytophthora nicotianae...

筛选烟草基因型对Phytophthora nicotianae的抗性

防控西瓜枯萎病需要了解病原菌的生理小种组成。本文介绍了根浸法、带菌种子播种法和改良盘浸法三种接种方法，以验证其在尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp.

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

本实验方案描述了一种可靠且简便的Ditylenchus...

培养与筛选植物寄生线虫 Ditylenchus dipsaci

本文利用数字显微镜生成的图像，逐步展示对棉花植株叶片和苞片蜜腺进行表型分析的过程。该方法可有效对棉花叶片和苞片的蜜腺进行评分，因为相关数据能够以数字图像的形式进行采集和保存。...

利用数字显微镜观察棉花叶片和苞片蜜腺以提高评分准确性和数据保存

了解快速无损筛选棉花抗肾形线虫基因型的方法。该技术通过根部染色和显微镜计数评估感染程度，支持大规模育种群体筛选，并可回收植株用于后续育种，为培育抗性品种提供高效工具。

筛选棉花基因型对肾形线虫的抗性

探索更多视频