利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白
2018年10月19日
本文介绍了应用单击化学辅助 RNA-路特捕获 (无花果) 策略来识别与编码和非编码 rna 结合的蛋白质的详细协议。
这种方法，CARIC，通过提供RNA结合蛋白的全面普查，可以帮助回答基因序列后转录领域的关键问题。CARIC 的主要优点是能够捕获与各种RNA结合的蛋白质，如mRNA和非编码RNA。该方法可用于各种类型和生物体的研究RNA蛋白相互作用的工作。
首先，在37摄氏度的二氧化碳大气中，在37摄氏度的辅以DMEM中培养 HeLa 细胞。当细胞达到约80%的汇合时，用15毫升的预战新鲜培养剂取代每道菜上的培养培养。在每个菜中加入15微升100毫摩尔，最终浓度为1毫摩尔。
对于实验和没有紫外线控制样品，每盘添加 7.5 微升 100 毫摩尔 4 SU。用铝箔盖住盘子，使用先前的条件培养细胞16小时。在此之后，将先前数量的欧盟和/或四个 SU 的一半添加到相应的板中，然后继续培养两个小时。
要开始体内交叉链接，请去除培养培养剂，每次洗涤使用五毫升 PBS 用 PBS 洗三次 PBS。尽可能去除残留的 PBS。对于实验和没有四个SU控制样品，将盘子放在冰上，盖上盖子。
使用 UV 交链接器在 365 纳米和 2 个百分厘米平方下用紫外光照射细胞。对于无紫外线控制样品，请将盘子放在冰上，并保护它们免受光线照射。接下来，向每个菜中加入一毫升的预解缓冲液。
使用橡胶细胞提升器刮擦细胞，并在 15 毫升管中收集预解悬浮液。将预解缓冲液添加到含有从两个盘子的悬浮液的管子中，将总体积调整到六毫升。然后添加相等体积的 R 解解缓冲液。
用窄针通过注射器多次通过细胞的细胞，直到酸盐清晰均匀。在四摄氏度下用温和的旋转孵育利沙酸盐一小时。在此稀释20卷稀释缓冲液中的酸盐，并在15毫升的解流管中将其分成15毫升馏分，分子截止量为10千吨。
使用摆动铲斗旋转器，在 4000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转管约 15 分钟，直到每个分数集中在小于 1 毫升的体积。在每个浓缩的利沙酸盐馏分中加入14毫升稀释缓冲液，并重复浓缩过程。然后结合分数，使用前面描述的浓度过程将它们浓缩成六毫升的体积。
首先准备文本协议中概述的反应组合。将此反应混合物添加到预清除的六毫升利沙酸盐中，并混合良好。加入162.5微升的还原试剂，混合好。
在室温下以800转/时在轨道摇床上孵育两小时。在此淬火后，加入5毫摩尔EDTA，并在室温下在轨道摇床上孵育5分钟。接下来，将反应混合物分成两个50毫升的管子，每根管中含有四卷预冷却的甲醇，并在负30摄氏度下孵育30分钟。
在4000倍G和4摄氏度的离心机15分钟。丢弃上流液，在颗粒中加入一至两毫升预冷却甲醇。上下移液以分解颗粒，确保颗粒最终完全悬浮，没有可见的块。
重复离心和再暂停过程两次。在此之后，仔细抽出残留的甲醇，确保不干扰颗粒。加入10毫升的重组缓冲液，上下移液溶解颗粒。
在4000倍G和4摄氏度的离心机10分钟。然后将上一液转移到新管中，确保收集 20 微升样品进行质量控制。将已清理和重组的样品转移到准备好的链球菌珠上。
在四摄氏度下孵育，温和旋转过夜。在 4000 次 G 下旋转珠子五分钟。将上一液转移到新管中，确保收集 20 微升样品进行质量控制。
用 10 毫升洗涤缓冲液 A. 在转速 12 rpm 和室温下温和旋转 10 分钟，清洗珠子。然后在4000次G下旋转珠子5分钟。取出上一液，再次重复洗涤和离心过程。
重复此洗涤过程以洗涤缓冲液 B 和洗涤缓冲液 C，如文本协议中所述。在此之后，用10毫升50毫升盐酸三酯洗涤珠子。将珠子在 4000 次 G 下旋转五分钟。
拆下上流液，将珠子均匀地分割在两个 1.5 微离心管之间。要开始躲避捕获的 RNP，在 400 微升洗涤、定居的珠子中加入 400 微升准备好的生物素洗脱缓冲液。在室温下以1500转/分的速度在轨道摇床上孵育20分钟。
然后在轨道摇床上孵育，热块在1500 rpm和65摄氏度，持续10分钟。将珠子在 7800 倍 G 下离心一分钟，然后收集 elud 的 RNP。向珠子添加400微升新鲜生物素洗脱缓冲液。
重复孵化和离心过程，收集第二个耳，并将两个耳管组合在一个15毫升管中。接下来，在组合的 RNP 流液中添加三卷稀释缓冲液，以降低 SDS 的浓度。使用 0.5 毫升超滤管，将样品浓缩到文本协议中概述的约 40 微升。
每微升 RNase A 添加 0.5 微克，并在 37 摄氏度下孵育两小时，以释放交对的 RNase 中的 RBP。收集两个微升的 RBC 进行质量控制。在优化 CARIC 协议时，质量控制步骤至关重要。
通过凝胶荧光分析对点击标记样品进行具有代表性的质量控制。只有双标记的样本在高分子量下显示一个强烈的涂片带，表示交联 RNP 的信号。通过省略四个 SU 或 EU 来取消 RNP 信号。它也可以通过消化与RNase A.In在某些情况下，在没有四个SU控制样本中观察到一个强大的涂抹带。
此频段表示标记的未交叉链接 RNase，在大多数情况下，该 RNase 在热加热期间会降解。通过西方印迹分析评估亲和力民意测验数据缺陷的质量控制，分析在下拉和下拉后显示样品中的生物素信号。对捕获的RSP进行银染色分析后发现，对于 HeLa 细胞，一般总捕获效率在输入蛋白的 0.05% 到 0.1% 之间。
在尝试此过程时，重要的是要记住，RNase 对核糖核素敏感。保持实验环境尽可能干净，以减少RNase的去生长。按照这个程序，使用质谱法进行蛋白质阿拉木图鉴定，可以预造铁结合蛋白。
开发后，CARIC 技术将为更全面地了解工作中邮政转录 OT 法规铺平道路。
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概览
本文介绍了一种详细的协议，用于点击化学辅助RNA相互作用组捕获（CARIC）策略，该策略可识别与编码和非编码RNA结合的蛋白质。CARIC提供了RNA结合蛋白的全面普查，有助于理解转录后基因调控。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA生物学
- 蛋白质-RNA相互作用
- 转录后调控
背景
- 理解RNA结合蛋白对基因调控至关重要。
- CARIC捕获与各种RNA类型结合的蛋白质，包括mRNA和非编码RNA。
- 这种方法可以应用于不同的生物体。
- HeLa细胞常用于此类研究。
研究目的
- 提供识别RNA结合蛋白的协议。
- 增强对RNA-蛋白质相互作用的理解。
- 促进转录后基因调控研究。
使用的方法
- 在补充DMEM中培养HeLa细胞。
- 使用100毫摩尔的EU来标记RNA。
- 进行点击化学以捕获RNA相互作用组。
- 分析蛋白质-RNA相互作用。
主要结果
- 成功识别RNA结合蛋白。
- 展示了CARIC在不同RNA类型中的多功能性。
- 提供了RNA-蛋白质相互作用动态的洞见。
- 建立了一种可靠的方法用于未来RNA生物学研究。
结论
- CARIC是研究RNA结合蛋白的强大工具。
- 这种方法可以推进基因调控机制的理解。
- 未来的应用可能包括各种生物学背景和生物体。
常见问题
Executive Industry Relevance
Comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is essential for de-risking target validation in post-transcriptional regulatory networks. The CARIC strategy enables transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs, expanding the scope of druggable targets beyond mRNA-binding proteins. This approach supports mechanistic de-risking by providing a more complete census of RNA-protein interactions relevant to disease mechanisms and therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying RBPs bound to diverse RNA species, including non-coding RNAs implicated in disease pathways.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for capturing RNA interactomes, reducing variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing RBP networks that modulate RNA stability, translation, and localization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative RBP profiles that can be used to develop binding assays for small molecule or nucleic acid therapeutics.
- Operational Value: Produces reproducible, biotin-tagged RNP complexes suitable for streptavidin-based pulldown and downstream proteomic analysis.
- Assay Readiness: Supports screening campaigns by delivering enriched RBP fractions for target validation and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates biomarker discovery by linking RBP expression or activity to disease-relevant RNA dysregulation.
- Preclinical Modeling: Enables use of CARIC in disease models to assess target modulation and pathway engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing mechanistic insights into RBP-mediated RNA regulation in pathophysiological contexts.
Pipeline & Workflow Integration
CARIC fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for RNA-centric therapeutic strategies. It enables early-stage biological de-risking by mapping the RBP landscape before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing direct RNA-protein interactions in native cellular contexts.
- Screening: Delivers assay-ready RBP extracts for evaluating compound effects on RNA interactomes.
- Analytics: Generates quantitative mass spectrometry-compatible samples for comparing RBP abundance across conditions.
- Translational Research: Connects RBP capture to preclinical validation by enabling correlation with phenotypic outcomes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling RNA interactomes across multiple targets, cell lines, and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by capturing RBPs on both coding and non-coding RNAs, reducing false negatives in target identification.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized metabolic labeling, UV cross-linking, and click chemistry steps.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by revealing RBP networks that influence RNA-based drug mechanisms and resistance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by providing mechanistic data on RBP modulation in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, click chemistry, and mass spectrometry-based proteomics.
- Needs access to UV cross-linkers, metabolic labeling reagents (EU, 4SU), and streptavidin agarose beads.
- Demands cross-team standardization of labeling efficiency, cross-linking duration, and lysis conditions.
- Requires adaptation considerations for primary cells, tissue models, or organisms beyond HeLa.
- Practical limitations include potential background from uncross-linked RNA and RNase sensitivity during sample handling.
