Name: 利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习CARIC技术用于RNA结合蛋白的捕获与鉴定，通过点击化学辅助方法分析HeLa细胞中的蛋白质-RNA相互作用。该技术为转录后基因调控研究提供全面解决方案。

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本工作得到国家自然科学基金项目 91753206、21425204 和 21521003 以及国家重点研发计划项目 2016YFA0501500 的资助。

警告：在适用情况下，所用试剂应购买无RNase的形式，或溶解于无RNase的溶剂中（大多数情况下，使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水）。在处理RNA样本和无RNase试剂时，务必佩戴手套和口罩，并频繁更换，以避免RNase污染。
1. 代谢标记并进行紫外交联细胞裂解液的制备
<ol>
	<li>EU 和 4SU 的代谢标记
	<ol>
		<li>在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 HeLa 细胞。为准备一次标准质谱检测的一个实验组或对照组样本，培养约 4 × 107 个 HeLa 细胞（分置于两个 15 cm 培养皿中）。</li>
		<li>当培养的 HeLa 细胞融合度达到约 80% 时，吸除培养基，并向每个 15 cm 培养皿中加入 15 mL 预热的新鲜培养基。</li>
		<li>向每个培养皿中加入 15 μL 的 100 mM EU（溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中），使其终浓度为 1 mM；同时加入 7.5 μL 的 100 mM 4SU（溶于 PBS 中），使其终浓度为 0.5 mM，用于实验组和 noUV 对照组样本。对于 no4SU 对照组样本，仅向每个培养皿中加入 15 μL 的 100 mM EU（溶于 PBS 中），使其终浓度为 1 mM。 
		注意：4SU 具有光激活特性；因此，在加入 4SU 后需避光操作。</li>
		<li>用铝箔包裹培养皿，继续培养细胞 16 小时。随后，向实验组、noUV 对照组和 no4SU 对照组样本中分别补加步骤 1.1.3 中 EU 和 4SU 用量的一半，或仅补加 EU，继续培养 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 紫外交联
	<ol>
		<li>吸除培养基，用每皿 5 mL 的 PBS 洗涤细胞 3 次，并尽可能去除残留的 PBS。 
		注意：残留液体将显著降低交联效率。</li>
		<li>对于实验组和 no4SU 对照组样本，将培养皿置于冰上并打开皿盖，使用紫外交联仪以 365 nm 紫外光照射，剂量为 2 J/cm2。</li>
		<li>对于 noUV 对照组样本，将培养皿置于冰上并避光保存。 
		注意：noUV 对照组样本后续所有操作均应在暗室中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解与匀浆
	<ol>
		<li>向每个培养皿中的细胞加入 1 mL 预裂解缓冲液（10 mM Tris∙HCl，pH 7.5，50 mM LiCl，0.02% Nonidet P-40，以及不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物）。使用橡胶细胞刮刀刮取细胞，并将预裂解液收集至 15 mL 离心管中。 
		注意：此步骤将破坏细胞膜，释放可溶性胞质蛋白和 RNA。切勿离心该管并弃去上清液。</li>
		<li>将两个 15 cm 培养皿所得悬液合并，用预裂解缓冲液调整总体积至 6 mL。向该预裂解悬液中加入等体积的 R-裂解缓冲液（200 mM Tris∙HCl，pH 7.5，500 mM LiCl，2% 十二烷基硫酸锂 [LDS]）。</li>
		<li>使用细针头（27 号）注射器反复抽吸数次，使细胞裂解物充分匀浆，直至溶液澄清均匀。将裂解物在 4 °C 条件下轻轻旋转孵育（约 15 rpm）1 小时。 
		注意：此步骤可确保蛋白质完全变性。裂解物可在 -70 °C 安全保存长达一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击反应前处理
	<ol>
		<li>加入 20 倍体积的稀释缓冲液（50 mM Tris∙HCl，pH 7.5）稀释裂解物，并将其分装为每份 15 mL。 
		注意：高盐和高去垢剂浓度的溶液会降低 Cu(I) 催化的点击反应效率；因此，必须更换裂解物的缓冲体系。</li>
		<li>使用 15 mL 超滤管（截留分子量 10 kDa）对每份样品进行浓缩，直至体积小于 1 mL。在 4 °C 条件下，使用摆桶转子以 4,000 × g 离心约 15 分钟。</li>
		<li>向浓缩后的裂解物中加入 14 mL 稀释缓冲液，重复步骤 1.4.2。合并各组分后，通过超滤（4,000 × g，4 °C，约 15 分钟）浓缩至 6 mL。 
		注意：此时大部分盐分和 LDS 已被去除，裂解物已适用于点击反应。裂解物可在 -70 °C 保存最多一周。应避免反复冻融，因其会导致 RNA 显著降解。若需进行小规模分析，建议分装保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNA互作组捕获样品的制备
<ol>
	<li>裂解液的预清除
	<ol>
		<li>每6 mL裂解液中加入100 μL链霉亲和素磁珠，室温下轻轻旋转（约15 rpm）30分钟，以去除天然生物素化蛋白。</li>
		<li>使用磁铁沉淀珠子（约20秒）&#160;4 °C 下孵育后，将预清除的裂解液转移至新管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击反应的性能
	<ol>
		<li>制备反应混合液：6.5 μL 生物素储备液（100 mM 叠氮-生物素溶于二甲基亚砜 [DMSO]，终浓度为 100 μM），3.25 μL 铜储备液（现配；1 M CuSO₄）4 溶解于水中，终浓度为500 μM），65 μL配体储备液（200 mM THPTA溶解于水中，终浓度为2 mM），以及262.75 μL H2O. 
		注：THPTA 是三[(1-羟丙基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺的缩写。</li>
		<li>将反应混合物加入6 mL预清除裂解液中，充分混匀。然后向裂解液中加入162.5 μL还原剂（现配，终浓度为5 mM的40 mg/mL抗坏血酸钠），充分混匀。最终体积应为6.5 mL。</li>
		<li>将反应混合物在室温下于摇床（800 rpm）中孵育2小时。向反应混合物中加入5 mM EDTA，孵育5分钟以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小规模表征
	<ol>
		<li>按照步骤2.2.1配制反应混合液，将生物素储备液替换为染料储备液（例如，100 mM 叠氮-Cy5 溶于 DMSO 中。 
		注意：试剂用量应根据裂解液体积进行调整。通常，20 μL 裂解液 aliquot 已足以用于凝胶内荧光分析等表征实验。</li>
		<li>将反应混合物加入裂解液中，在室温下孵育2小时。然后加入三分之一体积的LDS上样缓冲液（4×），在55 °C变性5分钟，随后在10% bis-Tris凝胶上进行电泳分离。 
		注意：为确认荧光信号出现在RNA上，应在点击反应后设置经RNase A消化的对照组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应混合物的纯化
	<ol>
		<li>向淬灭的反应混合物中加入八倍体积的预冷甲醇（100%），在 -30 °C 下孵育 30 分钟以进行沉淀。在 50 mL 锥形离心管中进行沉淀操作。 
		注意：如果总体积超过 50 mL，将反应混合物分装至两个 50 mL 锥形离心管中。</li>
		<li>配制复性缓冲液：将一份体积的缓冲液A（4%十二烷基硫酸钠[SDS]和10 mM EDTA）与八份体积的缓冲液B（1% Brij-97、150 mM NaCl和50 mM三乙醇胺，pH 7.4）混合。</li>
		<li>在 4,000 x g 条件下离心 g 4 °C下离心15分钟，弃上清液。向沉淀中加入约1 - 2 mL预冷的甲醇，用移液器吹打数次以充分分散沉淀，确保沉淀完全悬浮且无可见团块。用预冷的甲醇充满离心管，重复此步骤2次。</li>
		<li>在 4,000 x g 下离心 g 4 °C 下离心 15 分钟，弃上清液。将试管放回，再次于 4,000 x g 5 分钟后，尽可能小心地吸出残留的甲醇，避免扰动沉淀。</li>
		<li>将10 mL重悬缓冲液加入沉淀中。用移液器吹打数次以溶解沉淀。在4,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新管中。取20 μL样品用于质量控制（见第4节）。 
		注意：现在样本已准备好进行RNA互作组捕获。重建的样本可在-70 °C保存最多一周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNA-相互作用组捕获
<ol>
	<li>链霉亲和素琼脂糖珠的制备
	<ol>
		<li>每10 mL重建样品，取1,600 μL链霉亲和素琼脂糖浆液（800 μL沉降珠）加入15 mL圆锥形离心管中。</li>
		<li>在4,000 × g 条件下离心5分钟，使珠子沉淀。小心移除上清液，避免扰动沉淀的珠子。</li>
		<li>用10 mL 50 mM Tris∙HCl（pH 7.5）洗涤珠子。在4,000 × g 条件下离心5分钟，去除上清液。重复此步骤2次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和捕获
	<ol>
		<li>将步骤2.4.6中纯化并重建的样品转移至链霉亲和素琼脂糖珠中（见步骤3.1）。在4 °C下轻轻旋转孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>链霉亲和素珠的洗涤
	<ol>
		<li>在4,000 × g 条件下离心5分钟使珠子沉淀，将上清液转移至新管中。取20 μL样品用于质量控制。</li>
		<li>用10 mL洗涤缓冲液A（含2% SDS的PBS，pH 7.4）洗涤珠子。室温下轻轻旋转孵育10分钟（约12 rpm）。在4,000 × g 条件下离心5分钟，去除上清液。重复1次。</li>
		<li>使用洗涤缓冲液B（8 M尿素和250 mM NH4HCO3溶于水中）重复步骤3.3.2。再使用洗涤缓冲液C（含2.5 M NaCl的PBS，pH 7.4）重复步骤3.3.2。然后用10 mL 50 mM Tris∙HCl（pH 7.5）洗涤珠子。在4,000 × g 条件下离心5分钟，去除上清液。</li>
		<li>将珠子均分并转移至两个1.5 mL微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>捕获RNP的洗脱
	<ol>
		<li>配制生物素洗脱缓冲液：12.5 mM生物素、75 mM NaCl、7.5 mM Tris∙HCl（pH 7.5）、1.5 mM EDTA、0.15% SDS、0.075% 皂苷（sarkosyl）和0.02% 脱氧胆酸钠。 
		注意：将该缓冲液储存于室温，因为生物素在4 °C时可能析出沉淀。</li>
		<li>向400 μL洗涤后的沉降珠中加入400 μL生物素洗脱缓冲液。</li>
		<li>在室温下于旋转摇床（1,500 rpm）孵育20分钟，随后在带有加热模块的旋转摇床上（1,500 rpm，65 °C）孵育10分钟。在7,800 × g 条件下离心1分钟，收集洗脱的RNP。</li>
		<li>向珠子中加入400 μL新鲜的生物素洗脱缓冲液，重复步骤3.4.3。将两次洗脱液合并至一个15 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNase消化
	<ol>
		<li>向洗脱的RNP中加入三倍体积的稀释缓冲液，以降低SDS浓度。使用0.5 mL超滤管（截留分子量10 kDa）在4 °C、12,000 × g 条件下离心约30分钟，将样品浓缩至约40 μL。</li>
		<li>加入0.5 μg/μL的RNase A，在37 °C孵育2小时，以释放与RNA交联的RNA结合蛋白（RBP）。取2 μL RBP样品用于质量控制（见第4节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 质量控制
<ol>
	<li>亲和沉淀效率的控制
	<ol>
		<li>从步骤 2.4.6 中取 10 μL “沉淀前”样品，从步骤 3.3.1 中取 10 μL “沉淀后”样品。</li>
		<li>使用标准 Western 印迹方法（10% bis-Tris 凝胶）分析样品。</li>
		<li>用链霉亲和素-HRP 偶联物对聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行染色，以监测“沉淀后”样品中残留的生物素信号。 
		注意：如果“沉淀后”样品的生物素信号强于“沉淀前”样品信号的五分之一，则应增加步骤 3.1.1 中使用的链霉亲和素-琼脂糖微珠的用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总捕获效率的控制
	<ol>
		<li>从步骤 3.5.2 中取 2 μL 释放的 RBP 样品，从步骤 2.4.6 中取 0.5 μL “沉淀前”样品（作为 0.1% 输入）。</li>
		<li>使用标准银染程序分析样品。
		<ol>
			<li>用固定液（40% 乙醇，10% 乙酸）固定凝胶 20 分钟，随后用敏化液（13 mM Na2S2O3、83 mM 醋酸钠、30% 乙醇）敏化 30&#160;分钟。</li>
			<li>用去离子水洗涤凝胶 3 次，每次 5&#160;分钟，然后用 15 mM AgNO3 溶液染色 20&#160;分钟。再用去离子水洗涤 2 次，每次 1&#160;分钟，接着在 0.24 M Na2CO3 和 0.012% 甲醛溶液中显色，当染色达到合适强度时，用 45 mM EDTA 终止反应。 
			注意：捕获的 RBP 的银染强度应与 0.1% 输入样品的强度相近。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 质谱样品的制备
<ol>
	<li>捕获的RNA结合蛋白的凝胶内胰蛋白酶消化28
	<ol>
		<li>向步骤3.5.2中释放的RBP样品加入四分之一体积的SDS上样缓冲液（5×），在95 °C下变性10&#160;分钟。</li>
		<li>在1.5 mm厚的10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离RBP。</li>
		<li>按照标准方案用银染法染色凝胶。</li>
		<li>切下实验样品或对照样品的泳道，去除浓缩胶部分及RNase A的主要条带（约15 kDa）。</li>
		<li>将切下的泳道切成小块（约1–1.5 mm × 约1–1.5 mm）。 
		注意：凝胶小块的最短边不应短于1 mm，以防止堵塞移液器吸头。</li>
		<li>将凝胶小块转移至微量离心管中，用脱色液（等体积混合的100 mM Na2S2O3 和 30 mM K3[Fe(CN)6]）进行脱色。</li>
		<li>用200 mM碳酸氢铵（ABC）洗涤凝胶小块，直至其完全无色。</li>
		<li>用1 mL纯乙腈（ACN）脱水凝胶小块；再用200 μL含10 mM二硫苏糖醇（溶解于50 mM ABC中）的溶液重悬并水合，在56 °C孵育45分钟。 
		注意：完全脱水后的凝胶小块应变得坚硬且不透明。若脱水后仍较软，应去除ACN并加入1 mL纯ACN再次脱水。</li>
		<li>将凝胶小块冷却至室温，加入200 μL含58 mM碘乙酰胺（溶解于50 mM ABC中）的溶液，避光于室温孵育45分钟。</li>
		<li>用少量水短暂洗涤后，用1 mL纯ACN再次脱水凝胶小块。 
		注意：凝胶小块必须完全脱水。</li>
		<li>用适量10 ng/μL胰蛋白酶溶液（溶解于50 mM ABC中）重悬凝胶小块，在37 °C孵育12&#160;–&#160;16&#160;小时。 
		注意：凝胶小块应完全重水合且无白色核心，去除多余液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化后肽段的稳定同位素二甲基标记29
	<ol>
		<li>加入200 μL提取缓冲液（水中含5%甲酸和50%乙腈），从凝胶小块中提取消化后的肽段，37 °C下涡旋振荡（1,200&#160;rpm）30&#160;分钟。</li>
		<li>重复步骤5.2.1两次，将所有提取液合并至同一微量离心管中。</li>
		<li>通过真空离心干燥提取的肽段。</li>
		<li>将肽段重新溶解于200 μL 100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB，pH 8.5）中。 
		注意：步骤5.2.4–5.2.6应在冰上于通风橱中操作。</li>
		<li>分别向实验组和对照组样品中加入8 μL 4% CH2O 和 8 μL 4% 13CD2O。 
		注意：为控制稳定同位素标记的偏差，应在另一次独立的生物学重复实验中对实验组和对照组交换使用的同位素。</li>
		<li>加入8 μL新鲜配制的0.6 M NaBH3CN，并充分混匀。</li>
		<li>室温下涡旋振荡孵育1小时。</li>
		<li>将样品置于冰上冷却，加入32 μL 1%氨水溶液终止反应，随后再加入16 μL甲酸进一步淬灭反应。</li>
		<li>将实验组样品与对应的对照组样品合并至同一微量离心管中，通过真空离心干燥样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二甲基标记肽段的分级分离
	<ol>
		<li>制备停-抽-洗脱小柱（StageTips）30。
		<ol>
			<li>将一片C18膜插入延长型10-μL吸头中。</li>
			<li>向吸头中加入300 μg悬浮于乙腈中的高pH C18微球。</li>
			<li>将吸头垂直插入自制支架中的微量离心管内，确保吸头稳定且底部悬空。</li>
			<li>以1,400 × g 离心2分钟，弃去穿流液。</li>
			<li>用50 μL含80%乙腈的10 mM ABC（pH 10.0）洗涤吸头，重复一次。 
			注意：通过加入28%氨水调节10 mM ABC溶液的pH。</li>
			<li>用50 μL含50%乙腈的10 mM ABC（pH 10.0）洗涤吸头，重复一次。</li>
			<li>用50 μL 10 mM ABC（pH 10.0）洗涤吸头，重复一次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将肽段重新溶解于50 μL 10 mM ABC（pH 10.0）中。</li>
		<li>将重悬后的样品加入已制备好的小柱中，将穿流液重新加载至小柱以确保肽段高效结合。</li>
		<li>用50 μL 10 mM ABC（pH 10.0）洗涤小柱，重复一次。</li>
		<li>使用50 μL含6%、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%、40%、80%和6%乙腈的10 mM ABC（pH 10.0）溶液，分步洗脱获得12个组分。</li>
		<li>将间隔相等的两个组分合并（第1与第7、第2与第8，依此类推），共得到六个合并组分。</li>
		<li>通过真空离心干燥样品。干燥后的肽段可保存于-30 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 质谱仪性能与数据分析
<ol>
	<li>液相色谱-串联质谱法进行肽段分析
	<ol>
		<li>将步骤 5.3.7 中获得的干燥肽段组分用含 0.1% 甲酸的 15 μL 水溶液重新溶解。取 1 μL 溶液点样于 pH 试纸上，检测复溶肽段的 pH 值（pH 应低于 3）。</li>
		<li>将复溶后的样品注入液相色谱（LC）柱中。在高效液相色谱（HPLC）中采用适当的溶剂梯度（溶剂 A 为含 0.1% 甲酸的水溶液，溶剂 B 为含 0.1% 甲酸的乙腈溶液）。典型的溶剂 B 梯度如下：40 分钟内从 5% 升至 35%，4 分钟内从 35% 升至 70%，随后在 75% 保持 10 分钟。</li>
		<li>通过电喷雾使洗脱的肽段离子化，并将质谱仪设置为数据依赖模式。在初始 MS 扫描中选择丰度最高的 15 个离子（多电荷离子：2+、3+ 或更高）进行串联质谱（MS/MS）扫描（碰撞诱导解离，CID）。将动态排斥数量设为 500，最大持续时间为 25&#160;s。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 MaxQuant 进行蛋白质鉴定与定量31
	<ol>
		<li>将蛋白质鉴定的错误发现率（FDR）设为 0.01，并将唯一肽段数量设为 2，以提高准确性和可靠性。</li>
		<li>将用于蛋白质定量的最小比值计数（唯一肽段 + 刀锋肽段）设为 2，并启用 重新定量 和 跨运行匹配 功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 R/Bioconductor 软件包 limma 评估富集显著性32
	<ol>
		<li>在 limma 中执行适度 t 检验，基于至少三个生物学重复，检验 Log2 倍数变化是否显著偏离零。使用 read.table 函数读取数据表，然后使用 lmFit 和 eBayes 函数进行数据拟合。使用 topTable 函数导出计算结果（包括平均 Log2 倍数变化和 P 值）。</li>
		<li>采用 Benjamini–Hochberg 方法对 P 值进行校正，以控制错误发现率（FDR）。</li>
		<li>设定 FDR 为 0.01，以生成在实验样本中显著富集的蛋白质列表。设定两倍或三倍变化作为阈值，进一步控制假阳性结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
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<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
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<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

保持RNA完整性良好是成功进行CARIC实验的关键之一。通过使用适当的Cu(I)配体并谨慎操作，RNA降解可显著减少，尽管仍观察到部分降解现象。实验样品中EU和4SU的取代率分别为1.18%和0.46%（数据未显示）。对于长度为2,000 nt的完整RNA，约90%的RNA至少含有一个EU和一个4SU；对于长度为1,000 nt的部分降解RNA，约70%的RNA至少含有一个EU和一个4SU。因此，RNA的部分降解不会显著降低CARIC的效率，但严重降解是不可接受的。
另一个关键步骤是步骤1.4，即点击反应的准备。RNA上的Cu(I)催化点击反应对LDS浓度敏感。高浓度（&#62; 0.1%）的LDS会导致含EU的RNA上的标记信号减弱，同时蛋白质上的背景信号增强（数据未显示）。
除了 EU 之外，CARIC 还可与其他可点击核苷兼容，例如炔基和叠氮基腺苷类似物33,34,<sup clas...

人类基因组被转录成多种类型的编码和非编码RNA（ncRNA），包括mRNA、rRNA、tRNA、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）以及长链非编码RNA（lncRNA）1。这些RNA中的大多数都结合了RNA结合蛋白（RBP），并以核糖核蛋白颗粒（RNP）的形式发挥功能2。因此，全面鉴定RNA结合蛋白（RBP）是理解RNA与RBP之间调控网络的前提，该网络与多种人类疾病相关3,4,5。
过去&#160;近年来，已在多种真核系统中发现大量RNA结合蛋白2,6，包括人类7,8,9,10,11，小鼠12,13,14，酵母9,15,16，斑马鱼17, 黑腹果蝇18,19, 秀丽隐杆线虫16, 拟南芥20,21,22和人类寄生虫23,24,25这些进展得益于Castello开发的RBP捕获策略 等7 和 Baltz 等8 2012年，该方法结合了 体内 RNA 及其相互作用蛋白的紫外交联、poly(A) RNA 的寡核苷酸(dT) 捕获，以及基于质谱（MS）的蛋白质组学分析。然而，由于 poly(A) 主要存在于成熟 mRNA 上，而成熟 mRNA 仅占真核生物转录组的约 3% - 5%26这种广泛使用的方法无法捕获与非poly(A) RNA相互作用的RNA结合蛋白（RBPs），包括大多数非编码RNA（ncRNAs）和前体mRNA（pre-mRNAs）。
本文报道了一种新近开发的策略，用于在转录组范围内全面捕获聚腺苷酸化（poly(A)）和非聚腺苷酸化（non-poly(A)）RNA结合蛋白的详细实验步骤。27称为CARIC，该策略结合了 体内 UV交联与利用光激活及代谢标记对RNA进行标记 &#34;可点击的&#34; 核苷类似物（含有可参与点击反应的生物正交功能基团）、4-硫代尿苷（4SU）和5-乙炔基尿苷（EU）。采用CARIC策略获得理想结果的关键步骤包括高效的代谢标记、紫外交联和点击反应，以及RNA完整性的维持。由于点击反应中用作催化剂的Cu(I)可能导致RNA断裂，因此必须使用能够减少RNA断裂的Cu(I)配体。本文描述了如何在细胞裂解液中进行高效的点击反应，同时避免严重的RNA降解。
尽管本方案仅描述了在HeLa细胞中捕获和鉴定RNA结合蛋白（RBP）的方法，但CARIC策略可适用于多种细胞类型，并可能拓展至活体生物。除了RBP的捕获外，本方案还提供了质谱样品制备以及蛋白质鉴定与定量的简化分步操作流程，对于不熟悉蛋白质组学实验的研究人员尤为有帮助。

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 &amp;& 链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU（5-乙炔基尿苷）</td><td>芜湖华仁科技有限公司</td><td>CAS:69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU（4-硫代尿苷）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times;PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>配备365 nm紫外灯</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>用于处理水。有剧毒！</td></tr><tr><td>Tris&amp;middot;HCl，pH 7.5</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88265</td><td>每50 mL裂解缓冲液使用一片。</td></tr><tr><td>LDS（十二烷基硫酸锂）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 超滤管（截留分子量 10 kDa）</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL超滤管（截留分子量10 kDa）</td><td>默克密理博</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>叠氮-生物素</td><td>点击化学工具</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [三(3-羟丙基三唑基甲基)胺]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>叠氮-Cy5</td><td>点击化学工具</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDS 样品缓冲液（4&amp;times;)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% bis-Tris 凝胶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [聚氧乙烯（20）油醚]</td><td>J&amp;amp;K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素琼脂糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl（月桂酰肌氨酸钠）&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;月桂酰肌氨酸钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>版本：1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

利用点击化学辅助的rna相互作用组捕获（caric）策略捕获与鉴定rna结合蛋白

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

全面鉴定RNA结合蛋白（RBPs）对于理解细胞内的转录后调控网络至关重要。目前广泛使用的RBP捕获策略依赖于靶标RNA的多聚腺苷酸化[poly(A)]，该修饰主要存在于真核生物成熟mRNA上，导致大多数非poly(A) RNA结合蛋白未被识别。本文详细描述了一种近期报道的方法——点击化学辅助RNA相互作用组捕获技术（CARIC），该方法通过结合RNA的代谢标记、体内紫外交联以及生物正交标记，实现了对poly(A)和非poly(A) RBP的全转录组范围捕获。

展示了质量控制步骤的代表性结果。结果包括步骤 2.3.2 中描述的凝胶内荧光分析图（图 1）、步骤 4.1.3 中描述的蛋白质印迹分析图（图 2A）以及步骤 4.2.2 中描述的银染分析图（图 2B）。质量控制步骤对于优化 CARIC 实验方案至关重要。在进行大规模 RBP 鉴定实验制备时，务必包含质量控制环节。
<img alt="聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，RNA分析，凝胶内荧光Cy5，考马斯亮蓝染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58580/58580fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：步骤2.3.2中所述点击标...

本文介绍了一种应用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略的详细方案，用于鉴定与编码RNA和非编码RNA结合的蛋白质。

利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白

全面鉴定RNA结合蛋白（RBPs）对于理解细胞内的转录后调控网络至关重要。一种广泛应用的……

该方法CARIC通过全面清查RNA结合蛋白，有助于解答基因转录后调控领域的关键问题。CARIC的主要优势在于能够捕获与多种RNA（如mRNA和非编码RNA）结合的蛋白质。该方法可应用于多种类型和生物体，用于研究RNA-蛋白质相互作用。首先，在37摄氏度、5% CO2的培养箱中，用添加补剂的DMEM培养HeLa细胞。当细胞融合度达到约80%时，将每皿中的培养基更换为15毫升预热的新鲜培养基。向每皿中加入15微升100毫摩尔的EU，使其终浓度为1毫摩尔。对于实验组和无紫外照射的对照组样品，向每皿中加入 7.5 微升 100 毫摩尔的 4 SU。用铝箔包裹培养皿，并按照先前的条件培养细胞 16 小时。此后，向相应的培养板中加入先前剂量一半的 EU 和/或 4 SU，继续培养 2 小时。开始体内交联实验时，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每皿三次，每次使用5 mL PBS。尽可能彻底去除残留的PBS。对于实验组和无4 SU对照组样品，将培养皿置于冰上并打开皿盖。使用紫外交联仪，在365纳米波长、2焦耳/平方厘米的条件下照射细胞。对于无紫外照射的对照样品，将培养皿置于冰上并避光保存。接着，向每个培养皿中加入1毫升预裂解缓冲液。使用橡胶细胞刮刀刮取细胞，并将裂解前悬液收集至15毫升离心管中。向含有两块培养皿细胞悬液的离心管中加入裂解前缓冲液，调节总体积至6毫升。然后加入等体积的R裂解缓冲液。用带有细针的注射器将细胞裂解液反复抽吸数次，直至裂解液变得澄清且均匀。将裂解液在4°C条件下轻轻旋转孵育1小时。之后，将裂解液用20倍体积的稀释缓冲液稀释，并分装至若干15毫升超滤管（截留分子量为10千道尔顿）中，每管15毫升。使用摆桶式转子，在4000 × g、4°C条件下离心约15分钟，直至各组分浓缩至体积小于1毫升。向每份浓缩的裂解液组分中加入14毫升稀释缓冲液，并重复上述浓缩步骤。随后合并各组分，并使用前述浓缩方法将其进一步浓缩至6毫升体积。首先，按照文本方案中所述配制反应混合液。将该反应混合液加入6毫升预清除的裂解液中，并充分混匀。再加入162.5 µL还原剂，并充分混匀。在室温下，将样品置于转速为800 rpm的摇床上孵育两小时。随后加入终浓度为5毫摩尔的EDTA以终止反应，并在室温下继续于摇床上孵育5分钟。接着，将反应混合物等分至两个50毫升离心管中，每管加入四倍体积的预冷甲醇，于-30摄氏度孵育30分钟。在4000 × g、4 °C条件下离心15分钟。弃去上清液，向沉淀中加入1至2毫升预冷的甲醇。用移液器上下吹打，使沉淀完全重悬，确保无可见团块残留。重复离心和重悬过程两次。此后，小心尽可能吸出残留的甲醇，注意不要扰动沉淀。加入10毫升重建缓冲液，用移液器吹打数次以溶解沉淀。在4000 × g、4°C条件下离心10分钟。然后将上清液转移至新管中，并确保收集20 µL样品用于质量控制。将纯化并重新溶解的样品转移至预先准备好的链霉亲和素琼脂糖珠中。在4°C下轻轻旋转孵育过夜。在4000 × g下离心5分钟以沉淀微珠。将上清液转移至新管中，并确保收集20 µL样品用于质量控制。用10毫升洗涤缓冲液A洗涤磁珠。在室温下以12 rpm的速度轻轻旋转孵育10分钟。然后在4000 ×g下离心5分钟使磁珠沉淀。弃去上清液，并重复洗涤和离心过程一次。按照文本方案中所述，使用洗涤缓冲液B和洗涤缓冲液C重复此洗涤步骤。随后，用10毫升50毫摩尔的Tris盐酸缓冲液洗涤磁珠。在4000 ×g 条件下离心5分钟，沉淀磁珠。移除上清液，并将磁珠均分至两个1.5 mL离心管中。为开始洗脱捕获的核糖核蛋白复合物（RNPs），向400 µL洗涤并沉淀后的磁珠中加入400 µL已配制的生物素洗脱缓冲液。在室温下以1500 rpm于摇床中孵育20分钟。然后在振荡培养箱中，于65摄氏度、1500 rpm条件下孵育10分钟。将磁珠在7800 ×g条件下离心1分钟，收集洗脱的RNP。向磁珠中加入400 µL新鲜的生物素洗脱缓冲液。重复孵育和离心步骤，收集第二次洗脱液，并将两次洗脱液合并至一个15毫升离心管中。随后，向合并的RNP洗脱液中加入三倍体积的稀释缓冲液，以降低SDS的浓度。使用0.5毫升超滤管，按照文本方案中的说明，将样品浓缩至约40微升。加入0.5微克/微升的RNase A，37摄氏度孵育两小时，以释放与RNA交联的RNA结合蛋白（RBP）。取2微升RBP用于质量控制。在优化CARIC实验方案时，质量控制步骤至关重要。通过凝胶内荧光分析对点击标记样品进行代表性质量控制。仅双标记样品在高分子量区域显示出明显的弥散条带，代表交联核糖核蛋白（RNP）的信号。若省略四种硫代尿苷（SU）或乙炔基尿苷（EU）中的任意一种，RNP信号均会消失。该信号也可通过RNase A消化而消除。在某些情况下，无四种硫代尿苷（SU）的对照样品中也可观察到明显的弥散条带。该条带代表带有标记但未交联的核糖核酸酶，在大多数情况下会在加热变性过程中降解。通过蛋白质印迹分析对亲和沉淀数据的质量进行控制，检测沉淀前和沉淀后样品中的生物素信号。对捕获的RNA结合蛋白进行银染分析，结果显示，在HeLa细胞中，总体捕获效率占输入蛋白的0.05%至0.1%。在进行该实验操作时，需注意RNase对核糖核酸酶敏感。应尽量保持实验环境清洁，以减少RNase的降解。完成本实验步骤后，可进行质谱分析以鉴定铁结合蛋白。在该技术得到开发后，CARIC 技术将为更全面地理解转录后 O-GlcNAc 修饰调控机制提供新的途径。

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利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白

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