Name: 利用网格和收集荧光蛋白陶瓷的结构解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习MeshAndCollect晶体学方法，利用同步辐射光源从Cerulean荧光蛋白小晶体收集完整衍射数据，结合Dozer软件分析实现1.7埃分辨率结构解析，为结构生物学研究提供高效实验方案。

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我们感谢欧洲同步辐射装置（ESRF）通过其内部研究计划提供光束时间。

1. 青色荧光蛋白（Cerulean）的表达与纯化
注意：本实验方案基于 Lelimousin 等人21 发表的文献。
<ol>
	<li>在37 °C下，于4 L自诱导培养基中培养表达His标签Cerulean蛋白的大肠杆菌BL21细胞23 直到OD600=1，然后在 27 °C 下过夜孵育。</li>
	<li>在5,000 x g下收获细菌细胞 g 并裂解细胞 通过 在 200 mL 含 20 mM Tris（pH 8.0）、500 mM NaCl 和 1× 无 EDTA 蛋白酶抑制剂的缓冲液中进行超声处理（40% 功率，5 分钟，脉冲 10 秒，暂停 10 秒）。</li>
	<li>将上清液上样至His-trap Ni-NTA柱，用含100 mM咪唑的相同缓冲液条件洗脱Cerulean。</li>
	<li>合并呈亮黄色的组分。该蛋白质具有内在颜色，因此含Cerulean的组分易于辨认。</li>
	<li>在20 mM Tris pH 8.0缓冲液中，使用S75柱纯化蛋白质（4 mL）。</li>
	<li>合并亮黄色组分，并将蛋白质溶液浓缩至15 mg/mL。</li>
</ol>
2. 结晶
<ol>
	<li>在20 °C下，使用Linbro板进行悬滴气相扩散法24。在孔中加入1 mL沉淀剂溶液，该溶液包含100 mM HEPES（pH 6.75）、12% PEG8000和100 mM MgCl2。对于悬滴，将1 µL浓度为15 mg/mL的蛋白溶液与1 µL沉淀剂溶液混合。晶体应在24小时内出现。</li>
	<li>收集所得晶体，并将其转移至100 µL的微晶接种缓冲液中，该缓冲液包含0.1 M HEPES（pH 6.75）和22% PEG 8000。</li>
	<li>使用0.1 mL组织研磨器研磨晶体，并用接种缓冲液按1:100比例稀释。</li>
	<li>取一份蛋白储备溶液（15 mg/mL），加入胰蛋白酶（在相同缓冲液中浓度为0.5 mg/mL）进行消化，反应1小时（体积比1:10 (v/v)）。</li>
	<li>将消化后的蛋白溶液与10%含微晶的缓冲液（v/v）混合。</li>
	<li>采用气相扩散法，在0.1 M HEPES（pH 7）、14% PEG 8000、0.1 M MgCl2条件下，于1–1.5 μL的悬滴中生长晶体（尺寸约为10×10×20 µm3）。</li>
</ol>
3. 晶体安装
<ol>
	<li>使用合适的环状工具，例如，将一个具有700个25 µm方孔的网格环安装在SPINE标准样品架上25。将晶体从结晶液滴（步骤2.6）转移至1 µL冷冻保护剂溶液中（将井内沉淀剂溶液与甘油混合，终浓度为20% v/v）。</li>
	<li>通过将网格环移至晶体下方并将其从液滴中提起，将蛋白质晶体悬液装载到网格环上。理想情况下，晶体的最大尺寸应在5 µm – 30 µm范围内，且网格环上的晶体之间无重叠。</li>
	<li>用滤纸快速轻触样品架以吸除多余液体。使晶体沉降，使其位于环的平面上，并尽可能减少周围残留的体相液体。</li>
	<li>将样品架迅速浸入装满液氮的UniPuck样品盒中。将样品盒存放在合适的储存容器中，于100 K条件下保存，直至可使用同步辐射束流时间。</li>
</ol>
4. 同步辐射实验的离线准备工作
注意：请尽早申请同步辐射机时，并遵循相关同步辐射装置提供的在线指南，了解可用的访问类型以及如何提交申请。欧洲同步辐射装置（ESRF）的指南可参见 http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying。若申请者属于ESRF区块分配组（BAG）成员，则无需为每个具体项目单独提交申请；在此情况下，实验人员应联系其BAG负责人以安排机时。
<ol>
	<li>提案通过并收到实验邀请后，应安排所有参与者完成安全培训。填写“A表”（通过 ESRF 用户门户（http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form），填写样品所需的安 全信息。请联系本地联系人讨论实验细节。提交并验证 A 表格后，您将获得实验编号和密码。</li>
	<li>连接到扩展的 ISPyB26 （http://www.esrf.fr/）并选择 MX.</li>
	<li>使用A表单中的实验编号和密码登录。</li>
	<li>选择 运输 | 添加新内容 并填写所需信息。</li>
	<li>选择 添加包裹 并填写相关数据。选择 添加容器选择一个Unipuck，并填写所需信息，包括样品架在puck中的位置。</li>
</ol>
5. 将样品装载到光束线上
<ol>
	<li>在实验站内，将样品托盘装入样品更换器（SC）杜瓦瓶中，并记录其位置。</li>
	<li>锁定实验舱门，进入控制站。</li>
	<li>登录 ISPyB 系统（https://esrf.fr/），选择准备实验，找到对应的运输批次，点击下一步，并填写光束线名称及样品托盘在样品更换器中的位置。</li>
	<li>使用 A 表单上提供的实验编号和密码，登录光束线控制软件（本例中为 MXCuBE227,28）。
	<ol>
		<li>点击同步按钮，使光束线控制软件与 ISPyB 数据库同步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光束线控制软件将样品支架安装到测角仪上。在 MXCuBE2 中，右键单击样品更换器区域中的某个位置，然后选择安装样品。</li>
	<li>利用大多数 ESRF MX 光束线上安装的 MK3 mini-kappa 测角仪29，通过 MXCuBE2 的“视觉重对齐”工作流程30，将样品支架平面与测角仪的旋转轴对齐。
	<ol>
		<li>点击居中按钮，然后在环状支架尖端边缘的中点处进行三点点击居中操作。通过点击保存按钮保存该居中位置。</li>
		<li>再次点击居中按钮，然后在环状支架杆部起始位置的中点处进行三点点击居中操作。同样点击保存按钮保存第二个位置。</li>
		<li>通过点击选择其中一个已保存的居中位置。</li>
		<li>在高级选项下，将视觉重取向工作流程添加至 MxCuBE2 数据采集队列中。</li>
		<li>点击采集队列按钮以启动该工作流程。</li>
		<li>工作流程完成对齐后，再次对样品支架进行居中操作，此次选择网格中央的某个位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MXCuBE2 中旋转 omega 轴，使样品支架的网格面与 X 射线束方向垂直。</li>
	<li>在 MXCuBE2 中选择扫描样品支架所需的光束尺寸（仅适用于具有可变光束尺寸的光束线）。
	<ol>
		<li>在光束线控制软件中点击光阑下拉菜单，并选择一个数值，例如 10 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为网格扫描定义一个扫描网格。
	<ol>
		<li>在 MXCuBE2 中点击网格工具图标，网格工具窗口将出现。</li>
		<li>在 MXCuBE2 的样品视图中，通过鼠标左键点击并拖动，覆盖样品支架上含有晶体的区域，绘制网格。</li>
		<li>点击网格工具窗口中的加号按钮以保存网格（网格将变为绿色）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 准备并执行 MeshAndCollect 工作流程
<ol>
	<li>在 MXCuBE2 的分辨率字段中输入应收集衍射图像的分辨率（dmin），例如，此处为 1.8 Å。</li>
	<li>在高级数据采集选项卡中选择MeshAndCollect，将其添加到队列中，然后点击采集队列。</li>
	<li>在出现的参数窗口中，使用光束线相关的默认参数。在本实验中，默认参数为每次网格扫描点的曝光时间为 0.037 秒，透射率为 100%（在此情况下产生 4 × 1011 光子/秒），每条网格扫描线振荡角度为 1°。</li>
	<li>点击继续。网格扫描开始运行，软件 DOZOR1 会分析并根据衍射强度对每个网格点采集的衍射图像进行排序。此过程在后台运行。</li>
	<li>DOZOR 分析完成后，将生成热图，并根据衍射强度自动分配后续部分数据采集的顺序（见图 1）。 
	注意：此步骤的结果也可在 ISPyB 中查看。对于部分数据集的采集，光束线控制软件中将弹出一个包含设置的新选项卡，请选择合适的旋转范围（即 0.1°）、图像数量（即 100）、曝光时间、分辨率、透射率、反向扫描等参数。理想情况下，每个待采集楔形数据的剂量应低于加曼极限（30 MGy）。在所述实验条件下，每幅图像的近似曝光时间为 0.037 秒至 0.1 秒。</li>
	<li>点击继续以启动部分数据采集。</li>
</ol>
7. 数据处理
注意：部分数据集将使用合适的程序（XDS10）进行整合。为此将使用一个Python脚本，该脚本可识别每个独立的数据集，对其进行积分，并确保不同部分数据集之间的指标化保持一致。
<ol>
	<li>打开包含图像的文件夹：/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean。</li>
	<li>对用于收集部分数据集的文件夹中的 process 子文件夹创建一个安全备份。
	<ol>
		<li>在 Linux 终端中，使用命令 cp –r process process_backup。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进入 process 文件夹并启动数据处理脚本。
	<ol>
		<li>在 Linux 终端中，输入命令 cd process，然后按回车键。</li>
		<li>输入 procMultiCrystalData，然后按回车键。 
		注意：脚本会要求输入空间群和晶胞参数（此信息为可选项），请根据提示输入相应内容。在最后一次用户确认后，脚本将自动运行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据集的合并
注意：在整合所有部分数据集后，将选择其中最佳组合进行合并，以生成用于结构解析与精修的最终数据集。该合并过程的不同目标可包括获得完整的数据覆盖（强烈推荐）、高冗余度或最优的数据统计指标（高 &#60;I/σ(I)&#62;低R因子， 等等。后者有时可能会影响完整性及/或多重性，因此应谨慎选择此选项。
<ol>
	<li>使用 ccCluster 程序合并部分数据集14采用层次聚类分析（HCA）来确定同晶部分数据集的可能组合（）。
	<ol>
		<li>类型 ccCluster 在 Unix 终端中打开其图形用户界面（GUI）。 
		注意：在 ccCluster 图形用户界面中会绘制出一个树状图。该图基于各部分数据集之间的同构性，提示哪些部分数据集最适合进行合并。</li>
		<li>点击纵轴上数值约为 0.4 的节点。通常，较高的数值会包含更多的部分数据集，但会导致合并统计结果变差，因为部分数据集之间的同晶性会降低。</li>
		<li>点击 合并数据所选簇将在后台进行处理，估计的合并统计结果将出现在图形用户界面（GUI）的新标签页中。此步骤可针对不同的数据集组合重复进行。对于良好的部分数据集组合，其完整性应接近100%。 &#60;I/σ(I)&#62; 数值较高（最低分辨率壳层中为10或更高）以及R-meas31 数值较低（在低分辨率壳层中约为5%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于选定的每种组合，使用生成的输入脚本将所选的部分数据集合并为一个单一的 mtz 文件（即， 无意义32).</li>
	<li>使用标度程序对该文件中的强度数据进行精确标度和合并（即， 漫无目的的32）并且，与源自单晶数据收集的文件一样，使用输出结果进行后续的相位确定和结构解析33.</li>
</ol>

<ol><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li>
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<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li>
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<li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li>
<li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+%28SSX%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li>
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<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xia2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
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<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li>
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<li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">How good are my data and what is the resolution?</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li>
<li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+phasing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESRF+upgrade+programme+phase+II+%282015+-+2022%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+orange+book%22%5BJournal%5D)">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露

MX 实验的成功通常取决于是否存在相对较大且衍射质量良好的晶体。对于从小型晶簇优化为较大晶体失败的项目，MeshAndCollect 方法提供了一种可能性，即通过收集一系列小型晶体的同晶型部分数据集并将其组合，从而获得完整的衍射数据以解析结构。via 该方法适用于 MX 同步辐射光束线，理想情况下应具备高光子通量和小光束直径，并配备先进的衍射仪设备和快速读出探测器。在这样的终端实验站上，此类实验的数据收集部分大约需要 20 分钟，具体时间取决于需收集的部分数据集数量以及待分析的含晶体样品载体数量。
MeshAndCollect 实验成功最重要的前提是样品载具上存在足够数量（至少 50 个，理想情况下 100 个）能够产生衍射的位点。根据经验，待分析晶体的最小尺寸在最小维度上应约为 5 µm。该方法适用于任何标准的可低温冷冻的样品载具，但使用刚性且笔直的网格载具时效果最佳。
在欧洲同步辐射装置（ESRF），MeshAndCollect 以一种用户友好的方式集成于 Passerelle（http://isencia.be/passerelle-edm-en）工作流30中，并可通过 MXCuBE2 光束线控制软件获取。相较于其他序列化晶体学（SX）方法，MeshAndCollect 的一个主要优势在于，所收集的数据可由标准程序及用于单晶 MX 的自动化处理流程进行分析。
正如我们的示例所示，MeshAndCollect 非常易于应用，可获得一系列部分衍射数据集，这些数据集通常来自微小晶体，并可合并生成完整的数据集用于结构解析。此外，MeshAndCollect 有望拓展蛋白质晶体学的取样空间，因为它提供了一种方法，能够从结晶化实验中获取可用数据，即使在最后的优化步骤（即大晶体的生长）未能成功的情况下亦可实现。
鉴于当前向更亮X射线光源发展的趋势（例如， 极端明亮光源（EBS）项目/欧洲同步辐射装置35可以预见，由于辐射损伤的增加，由MeshAndCollect实现的多晶体数据收集方法将在基于同步辐射的MX光束线上成为标准的数据收集方式，而非目前的例外情况。

大分子X射线晶体学（MX）是目前最常用的方法，可用于获得生物大分子三维结构的原子级分辨率信息。然而，其主要瓶颈之一是需要相对较大且衍射质量良好的晶体。
通常情况下，尤其是在结晶膜蛋白时，只能获得最大尺寸为几微米的非常微小的晶体。辐射损伤效应限制了从单个微晶所能收集到的完整衍射数据集的分辨率。2，而为了提高信噪比，从而改善数据集的分辨率，通常需要合并来自不同但同晶型晶体的多个部分衍射数据集。同步辐射源及其他来源的X射线束流密度的提升（例如 X射线自由电子激光（X-FELs）使得即使是非常微小的生物大分子晶体也能收集到有用的衍射数据。这进一步推动了新技术的发展，用于整合从大量不同晶体中收集的部分衍射数据集，以生成完整的数据集用于结构解析。这类技术通常被称为序列晶体学（SX）。3,4,5,6,7,8SX的一个典型示例是使用注射装置将晶体悬浊液的细流注入X射线束中3,4,5每次晶体暴露于X射线时都会记录一张衍射图样，从而从成千上万个独立晶体中收集到大量“静态”衍射图像，这些信息随后被合并以生成完整的数据集。然而，此类序列数据收集方式存在一个显著缺点，即静态图像的处理可能存在问题。若在序列晶体学实验中能够对晶体进行旋转，和/或从同一晶体收集多张衍射图像，则数据质量将得到显著提升。6.
MeshAndCollect1 的开发旨在将序列化晶体学（SX）与“标准”微晶X射线晶体学（MX）旋转数据收集相结合，能够以自动化方式使实验人员从同一或不同样品架上装载的多个相同大分子目标晶体中收集部分衍射数据集。通过合并所收集的部分数据集中最同晶的数据，最终获得完整的衍射数据集。MeshAndCollect 可兼容任何先进的同步辐射X射线MX光束线（理想情况下为插入器件装置，且在样品位置处光束尺寸相对较小（20 µm 或更小））。除了可从一系列小尺寸、衍射质量良好的晶体中整合出完整数据集外，该方法还非常适用于对微晶的衍射质量进行初步实验评估，以及处理不透明样品，例如在介质相（in meso）生长的膜蛋白微晶9。
在MeshAndCollect实验开始时，通过低剂量X射线扫描确定单个样品托上所含大量晶体在二维平面上的位置。扫描过程中收集的衍射图像由程序DOZOR1自动分析，该程序根据各晶体的衍射强度对其在样品托上的位置进行排序。系统基于设定的衍射强度阈值自动分配用于收集部分数据集的位置；最后，从每个选定位置收集小角度范围的衍射数据楔块，通常为±5°旋转范围。经验表明，该旋转范围可为每颗晶体提供足够数量的衍射点，以满足部分数据集标定的需求，同时减少可能的晶体中心定位误差，并降低在特别密集的支撑材料上照射到多个晶体的风险1。随后，各个衍射数据楔块（即部分数据集）可通过手动方式或利用自动化数据处理流程进行处理10,11,12,13。在后续结构解析过程中，需进一步确定最佳的部分数据集组合以进行合并14,15,16，之后所得的完整数据集可如同来自单晶实验的数据一样进行处理。
作为 MeshAndCollect 方法实际应用的一个示例，本文展示了利用在同一块样品支撑物上依次收集的多个微晶衍射数据集组合而成的完整数据集，解析青色荧光蛋白（Cyan Fluorescent Protein, CFP）Cerulean 晶体结构的过程。Cerulean 是由来自维多利亚水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）经工程改造而来17，其荧光发色团由三个连续的氨基酸残基通过自催化环化反应形成。Cerulean 通过将发色团的第一和第二个残基——丝氨酸和酪氨酸——分别突变为苏氨酸（S65T）和色氨酸（Y66W），并进一步引入其他突变（Y145A、N146I、H148D、M153T 和 V163A）以优化发色团所处的微环境，从而获得显著但非最优的荧光量子产率（QY = 0.49）18,19,20。研究表明，Cerulean 荧光性能未达最优可能与复杂的蛋白质动力学有关，包括蛋白中11条β-链之一的稳定程度不足21，以及在不同pH和光照条件下容纳两种不同构型的发色团异构体22。我们选择 Cerulean 作为模型蛋白，用以展示 MeshAndCollect 实验方案的应用，原因在于其晶体尺寸可通过结晶条件相对容易地调控。Cerulean 的结构与其母体蛋白 GFP 高度相似，均由围绕中心α-螺旋的11条β-链构成的β-桶状结构组成，发色团即位于该α-螺旋上。

<table><tbody><tr><td>光束线</td><td>ESRF ID 23-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浓缩器：Amicon Ultra-4 Ultracel-30K</td><td>默克密理博</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>XDXm 结晶板及密封剂</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>4,693,159,001</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21 (DE3)</td><td>Life Technologies 赛默飞世尔科技</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR Chemicals Prolabo</td><td>14388.29T</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Euromedex</td><td>10-110-C</td><td></td></tr><tr><td>His-trap HP</td><td>GE 医疗</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MicroMeshes 700/25</td><td>MiTeGen</td><td>SKU：&amp;nbsp;M3-L18SP-25L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator vibra cell 75/15</td><td>SONICS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300-GL</td><td>GE 医疗集团</td><td>17-5174-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Unipuck</td><td>分子维度</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;项目&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>Solange Delageni&amp;egrave;re，Patrice Brenchereau，Ludovic Launer，Alun W. Ashton，Ricardo Leal，St&amp;eacute;法妮·维耶，约瑟&amp;eacute; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&amp;aacute;n M. McSweeney, St&amp;eacute;法妮·蒙特卡莫，马克斯·纳瑙，达伦·斯普赖斯，奥洛夫·斯文森，马丁·A·沃尔什，戈登·A·伦纳德；ISPyB：一个用于同步辐射大分子晶体学的信息管理系统，《生物信息学》，第27卷，第22期，2011年11月15日，第3186页&amp;ndash;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td><td>局部发育</td></tr><tr><td>无目的的</td><td>MRC 分子生物学实验室</td><td>埃文斯，P.R.，穆尔舒多夫，G.N. 我的数据质量如何？分辨率是多少？ &lt;em&gt;生物晶体学报 D 辑：生物晶体学&lt;/em&gt;. &lt;强&gt;69&lt;/strong&gt; (7), 1204&amp;ndash;1214，doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013)。</td><td></td></tr><tr><td>ccCluster</td><td>ESRF</td><td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. 多晶体大分子晶体学实验的层次聚类：该方法的 &lt;em&gt;ccCluster&lt;/em&gt; 程序。 &lt;em&gt;应用晶体学杂志&lt;/em&gt;. &lt;强&gt;50&lt;/strong&gt; (6), 1844&amp;ndash;1851，doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017)。</td><td>局部发育</td></tr><tr><td>DOZOR</td><td>ESRF</td><td>Bourenkov 和 Popov，未发表数据</td><td>局部发育</td></tr><tr><td>MeshAndCollect 工作流程</td><td>ESRF</td><td>Zander, U. &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; &lt;em&gt;网格过滤与收集&lt;/em&gt;一种用于同步辐射大分子晶体学光束线的自动化多晶体数据采集工作流程。 &lt;em&gt;生物晶体学报 D 部分&lt;/em&gt;. &lt;强&gt;71&lt;/strong&gt; (11), 2328&amp;ndash;2343，doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015)。</td><td>局部发育</td></tr><tr><td>MXCuBE2</td><td>ESRF</td><td>Gabadinho, J. &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; &lt;em&gt;MxCuBE&lt;/em&gt;一种为大分子晶体学实验定制的同步辐射光束线控制环境。 &lt;em&gt;同步辐射杂志&lt;/em&gt;. &lt;强&gt;17&lt;/strong&gt; (5), 700&amp;ndash;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. 同步辐射中子与光通讯，意大利国家研究委员会。(19), 24&amp;ndash;226 (2014).</td><td>局部发育</td></tr><tr><td>XDS</td><td>马克斯·普朗克研究所&amp;uuml;医学研究</td><td>Kabsch, W. &lt;em&gt;XDS&lt;/em&gt;. &lt;em&gt;生物晶体学报 D 卷&lt;/em&gt;. &lt;强&gt;66&lt;/strong&gt; (2), 125&amp;ndash;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 meshandcollect 解析荧光蛋白 cerulean 的结构

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

X射线晶体学是获取生物大分子三维结构高分辨率信息的主要技术。直到最近，该技术的一个主要要求是需要能够获得相对较大且衍射质量良好的晶体，而这类晶体通常难以制备。然而，随着序列晶体学的发展以及多晶体数据收集方法的复兴，大尺寸晶体的可获得性已不再成为限制因素。本文展示了自动化MeshAndCollect流程的应用，该流程首先识别固定在同一样品支架上多个微小晶体的位置，随后指导从这些晶体中收集一系列部分衍射数据集，用于后续合并并应用于结构解析。MeshAndCollect可适用于各种类型的微晶，即使其衍射较弱亦可使用。作为示例，本文展示了该技术用于解析青色荧光蛋白（CFP）Cerulean晶体结构的应用。

采用 MXCuBE2 中的 MeshAndCollect 功能（见图 1A），对位于同一样品托上难以通过肉眼识别的小型天蓝色荧光蛋白（Cerulean）晶体收集了部分衍射数据集。为筛选样品托，我们在网状环的中心绘制了一个网格（见图 1B），并根据 DOZOR 评分热图（见图 1C、1D），自动收集了 85 个部分衍射数据集。这些数据集分别进行积分后合并（见上文），最终获得一套在 dmin = 1.7Å 条件下完整度达 99.8% 的数据集（见表 1）。最高分辨率区间内的半数据集相关系数（CC1/2）34 为 60%（ = 4.7）。如预期所示，利用该数据集可通过分子置换法33 直接解析出 Cerulean 的晶体结构。经过结构精修后，Rwork 为 22.8%，Rfree 为 25.4%。与先前测定的结构（PDB 编号 2WSO21）进行叠加比对，其主链 Cα 原子的总体均方根偏差（rmsd）为 0.1 Å。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>合并数据集的统计信息</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚类阈值</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>部分数据集数量</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空间群</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶胞参数 (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率范围</td>
			<td>46.58-1.70 (1.73-1.70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmerge (所有 I+ 和 I-)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmeas (所有 I+ &amp;#38; I-)</td>
			<td>0.142 (0.813)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpim (所有 I+ &amp;#38; I-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总观测数/唯一观测数</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均((I)/sd(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>半数据集相关性 Mn(I) CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>数据完备性</td>
			<td>99.8 (99.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均冗余度</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终 Rcryst</td>
			<td>22.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终 Rfree</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：合并数据集的统计信息，表明所收集数据的高质量。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg" /> 
图 1：使用 MeshAndCollect 从同一样品 holder 中包含的多个微小晶体采集一系列部分数据集。 A) MXCuBE2 的用户界面。覆盖在在线轴成像视图区域上的绿色椭圆表示网格工具。B) 使用该工具在样品 holder 的实时图像上绘制网格。C) DOZOR 评分的热图。D) 衍射图像示例。E) 层次聚类分析后的树状图。红色的数据集用于合并。F) Cerulean 的整体结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们展示了使用MeshAndCollect方法收集多个荧光蛋白Cerulean小晶体的部分衍射数据，从而获得一套完整的衍射数据集，用于后续的结构解析。

使用 MeshAndCollect 解析荧光蛋白 Cerulean 的结构

X射线晶体学是获取生物大分子三维结构高分辨率信息的主要技术……

自动化的MeshAndCollect方案被开发用于将序列晶体学与标准旋转数据收集相结合，以测量从样品环上分离的小晶体。该方法首先确定安装在同一样品架上的晶体位置，然后指导收集部分数据集，这些数据集随后将被合并并用于结构解析。MeshAndCollect的优势在于，它允许您使用相同的实验设置快速完成实验，包括结构解析、配体筛选等，且仅需极微小的晶体即可实现。该方法最适合用于配备高光子通量、小光束直径和快速重载探测器的同步辐射光束线VMX。首先，连接至蛋白质晶体学光束线数据库的扩展信息系统，并选择MX。使用A表单中的实验编号和密码登录。然后，选择“样品 shipment 添加新条目”并填写所需信息。选择添加部分并填写相关数据。选择添加容器，选择一个SC3载物盘，并填写所需信息，包括样品架在载物盘中的位置。在实验舱内，将载物盘装入样品更换器门中，并记录其位置。接下来，登录蛋白质晶体学光束线数据库的信息系统。选择“准备实验”，找到货件，点击“下一步”，并在样品交换器中指明光束线和样品托盘位置。使用A表上提供的实验编号和密码登录光束线控制软件。按“同步”以将光束线控制软件与蛋白质晶体学光束线数据库的信息系统同步。使用光束线控制软件将样品托架安装到测角仪上。然后在样品更换器区域中右键单击一个位置，并选择“安装样品”。选择中心按钮，然后在环状针尖边缘的中点处点击三次以进行居中。通过选择“保存”来保存居中位置。在“高级”选项下，将工作流程“视觉重定向”添加到数据采集队列中。然后通过单击“Collect Queue”启动工作流程。接下来，通过单击选择一个已保存的中心位置。再次单击“center”按钮，然后在环状结构起始部分的中点进行三次点击以确定中心。单击“保存”以保存第二个位置，然后单击“继续”。在工作流程将样品台平面与测角仪的旋转轴对齐后，再次将样品台中心置于网格中央的某个位置。使用光束线控制软件旋转 ω 轴，调整样品架方向，使网格面与 X 射线束方向垂直。在光束线控制软件中，单击“光圈”下拉菜单并选择一个数值，然后单击网格工具图标，打开网格工具窗口。在光束线控制软件的样品视图中，通过在样品托上含有晶体的区域按住鼠标左键并拖动来绘制网格。要保存网格，请点击网格工具窗口中的加号按钮。在光束线控制软件的分辨率字段中，输入应采集衍射图像的分辨率。如果对晶体的衍射质量没有先验信息，建议选择 2 到 2.5 之间的数值。在高级数据收集选项卡中选择 MeshAndCollect。将其添加到队列中，然后点击收集队列。在参数窗口中，使用与光束线相关的默认参数。在本实验中，默认参数为每次网格扫描点的曝光时间为 0.037 秒，透射率为 100%，每条网格扫描线振荡角度为 1 度。单击继续。网格扫描运行后，使用软件 Dozer 分析在每个网格点收集的衍射图像，并根据衍射强度进行排序。Dozer 分析完成后，将生成热图，并根据衍射强度自动分配后续部分数据采集的顺序。最后，单击“继续”以启动部分数据采集。在MXCuBE中实现的MeshAndCollect方法被用于收集位于同一样品托上难以通过肉眼识别的小尺寸天蓝蛋白（Cerulean）晶体的部分衍射数据集。为了对样品托进行筛选，在网格环中心绘制了一个网格，并根据Dozer评分热图自动收集了85个部分衍射数据集。这些数据集分别进行积分后合并，最终获得一套分辨率为1.7 Å、完整度达99.8%的数据集。正如预期，Cerulean 的晶体结构可通过分子置换法利用所生成的数据集解析。经过结构精修后，得到 R_work 为 22.8%，R_free 为 25.4%。与先前测定的结构进行叠加比较，结果显示主链α碳原子的全局均方根偏差（RMSD）为 0.1 埃。对于需要优化晶体生长阶段的项目，MeshAndCollect 提供了一种可能性，即通过整合从小晶体获得的这些非晶态部分数据集，来获取完整的数据集。该技术为结构生物学家开辟了新途径，使其能够利用仅能产生少数微晶的样品来解析结构。

structure-solution-fluorescent-protein-cerulean-using

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

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使用 MeshAndCollect 解析荧光蛋白 Cerulean 的结构

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