优化的干扰素-γ ELISpot 法检测豚鼠疫苗接种后T细胞免疫应答

过去，在豚鼠模型中对免疫治疗剂的表征仅限于测量体液免疫。ELISpot 实验克服了这一限制，将有助于研究人员在该动物模型中生成更有意义的数据。该技术的主要优势在于细胞来源于外周血。

无需进行尸体解剖。这使得研究人员能够在自然感染过程中或在整个疫苗接种程序期间，对单个豚鼠的T细胞反应的强度和动力学进行测量。本次实验操作将由Holly Pugh演示。

她是一位来自Inovio公司临床前研发部门的研究助理。首先，向ELISpot检测板的每个孔中加入15 µL的35%乙醇。60秒后，向每个孔中加入150 µL的PBS。

倒置培养板以终止乙醇预处理。处理ELISpot检测板时也应格外小心，避免污染或损坏膜。洗涤时，向每孔加入250 µL PBS。

重复洗涤两次后，向每孔加入100微升捕获用抗豚鼠干扰素γ抗体VE4。然后在4摄氏度孵育至少12小时。孵育结束后，洗涤平板三次。

每孔加入 200 µL 封闭缓冲液。在室温下孵育平板 2 小时。随后再洗涤平板 3 次。

在锥形管中加入4.5 ml室温密度梯度介质。然后将Hanks'平衡盐溶液与血液等体积混合。将稀释后的血液缓慢地分层加在密度梯度介质上方，注意不要扰动两相界面。

此后，在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，离心过程中不使用刹车。从离心机中取出离心管时，注意不要扰动各层。正确识别各层后，吸取完整的中间白膜层以收获 PBMCs。

将经 HBSS 稀释的血液缓慢地铺加在密度梯度介质上。避免扰动试管，并关闭离心机刹车。将细胞转移至新的 15 ml 离心管中。

然后用R10培养基将细胞稀释至总体积15 ml。离心收集细胞后，弃去上清液，并将细胞重悬于15 ml R10培养基中。将细胞悬液通过70微米细胞筛网过滤至新离心管中。

用台盼蓝排斥法计数细胞并确定活细胞数量，然后用R10培养基稀释细胞。首先去除封闭缓冲液，并洗涤培养板。

针对每个PBMC样本，分别设置阳性对照、阴性对照以及每种实验特异性刺激物的三复孔。将蛋白肽混合物用R10培养基稀释至所需终浓度的三倍。随后，向板上的刺激物检测孔中加入50微升肽-R10培养基混合液。

然后将50 µL用R10培养基配制的MT多肽制剂加入到平板的阴性对照孔中。将ConA用R10培养基稀释后加入到平板的阳性对照孔中，随后向所有孔中加入100 µL PBMC悬液。将ELISpot板放入培养箱中平坦的表面上，并在孵育期间避免扰动平板。

从培养箱中小心取出培养板后，将培养板倒置以弃去上清液。随后洗涤培养板三次。向每孔中加入100 µL稀释后的生物素化检测捕获抗豚鼠干扰素γ抗体N-G3。

然后在室温下孵育平板两小时。将平板倒置以去除抗体溶液，并重复洗涤三次。从平板中移除 PBS 后，向每个孔中加入 100 微升用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶（ALP）标记的链霉亲和素。

然后在室温下孵育平板1小时。将平板倒置以弃去ALP链霉亲和素溶液，并用PBS洗涤平板两次。倒置平板，用干净的纸巾轻压以去除多余的PBS。

用去离子超纯水洗涤，每孔加入 250 微升。将酶标板倒置，用干净的纸巾吸去多余的水分。随后，每孔加入 100 微升 BCIP/NBT 底物溶液。

将培养板在室温下避光孵育 20 分钟。用去离子水清洗培养板四次。然后将培养板倒置并轻拍以去除多余的水分。

最后，从培养板底部移除塑料引流管，并使膜完全干燥。如前所述，成功进行密度梯度离心后，试管底部的红色黏稠液体应含有大部分红细胞。白膜层位于血浆层与密度梯度介质层之间。

在加入捕获抗体之前对孔板进行预处理，可使检测结果的界限更加清晰，同时减少阴性对照孔中非特异性斑点的数量。斑点表明外周血单个核细胞（PBMC）群体中存在产生干扰素γ的T细胞。在进行该技术操作时，务必记住应谨慎而迅速地处理血液样本。

这将提高细胞活力，改善斑点形成，并减少非特异性斑点的产生。请注意，操作血液和BCIP/NBT底物可能存在危险，因此在进行本实验时，应始终采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）。我认为，该实验方案可使研究人员能够研究具有重要T细胞组分的疾病，例如结核病（TB）、埃博拉病毒病和单纯疱疹病毒（HSV）感染。

重要的是，这将优化豚鼠模型中的疫苗接种方案的开发，并减少对相关性较低的动物模型的使用。