Name: 优化干扰素伽隆弹性体检测在几内亚猪模型接种疫苗后 t 细胞反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解干扰素伽隆ELISpot检测技术，用于几内亚猪外周血单个核细胞中T细胞反应的定量分析。该方法无需解剖即可动态监测疫苗接种后的免疫应答，为结核病、埃博拉等疾病的疫苗研发提供重要工具。

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我们谨向Inovio Pharmaceuticals的成员表示感谢&amp;感谢D部门提供的技术支持以及Acculab工作人员提供的优质饲养服务。特别感谢Alysha Vu和Joe Agnes对稿件的校对。本工作未获得公共、商业或非营利部门资助机构的任何专项资助。

此处所述所有方法均已获得 Acculab 动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。
注意：本实验方案需使用可能具有危害性的材料。请参考生产商提供的材料安全数据表（MSDS），并在整个操作过程中穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. 豚鼠免疫位点的准备、皮内Mantoux注射以及CELLECTRA-3P-EP操作步骤
<ol>
	<li>豚鼠处理部位的准备。
	<ol>
		<li>将豚鼠放入诱导室，用5%异氟烷蒸气进行麻醉。</li>
		<li>将动物从诱导室中取出，安置鼻罩，持续提供2%异氟烷蒸气以维持整个操作过程中的麻醉状态。</li>
		<li>剃除腹部侧 flank 区域约4 cm2的毛发。</li>
		<li>用乙醇棉片对剃毛区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pDNA制剂的注射及电穿孔操作。
	<ol>
		<li>使用胰岛素注射器，采用Mantoux技术将100 µl制剂注入真皮层。进针时针尖斜面向上，与动物体表呈10度角。</li>
		<li>拔出针头后，立即在注射形成的皮丘上放置CELLECTRA®-3P电极阵列，并施加电场。</li>
		<li>使动物脱离麻醉状态，并监测其恢复情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 非终末放血
<ol>
	<li>从麻醉的豚鼠颈静脉采血。
	<ol>
		<li>将豚鼠放入诱导室中，并按照 1.1.1 所述方法进行麻醉。</li>
		<li>使用带有 27G 1/2 英寸针头的 3 ml 注射器穿刺麻醉动物的颈静脉，采集 3 ml 血液。</li>
		<li>立即将血液转移至含 K2EDTA 的采血管中，轻轻倒置管子数次以使血液与抗凝剂充分混合，并置于冰上。 
		注意：避免血液凝固对于血液样本后续处理的成功至关重要。</li>
		<li>监测动物恢复情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血液样本处理
<ol>
	<li>通过密度梯度离心法从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
	<ol>
		<li>用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）将血液按1:1体积比稀释。 
		注意：为避免污染，此后所有操作均应在生物安全柜中进行，并采用无菌技术。</li>
		<li>将稀释后的血液缓慢加至含有4.5 ml Ficoll-Paque Plus的15 ml锥形离心管中，形成液面分层。注意避免扰动界面。注意：为确保有效分离，Ficoll-Paque必须处于室温。</li>
		<li>以800 rcf离心30分钟，关闭刹车。 
		注意：也可选用SepMate™管（STEMCELL Technologies）进行PBMC分离。将HBSS稀释的血液加入已装有3.5 ml Ficoll-Paque Plus的15 ml SepMate管中，随后以1200 rcf离心10分钟（开启刹车）。该节省时间的梯度离心方法可获得相当的细胞活力、得率及斑点形成能力。</li>
		<li>收集白膜层（Buffy-Coat），并用R10培养基（含10% (v/v) 热灭活FBS和1% (v/v) 青霉素-链霉素的RPMI1640培养基）稀释至总体积15 ml。</li>
		<li>以450 rcf离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>用R10培养基洗涤细胞两次。</li>
		<li>将细胞重悬于1 ml R10培养基中，并通过70 µm细胞筛网转移至新离心管中。</li>
		<li>计数细胞，并通过台盼蓝染色法确定活细胞数量。</li>
		<li>用R10培养基将细胞稀释至浓度为每毫升1×10^6个活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. ELISpot 板的制备与细胞刺激
<ol>
	<li>在接种 PBMCs 之前，包被并封闭 96 孔 ELISpot PVDF 膜板的孔。
	<ol>
		<li>板孔应预处理 60 秒。乙醇预处理可减少非特异性斑点形成，并改善斑点的清晰度。 
		注意：需特别注意确保整个膜与 15 µl 35% 乙醇充分接触。</li>
		<li>60 秒后，每孔加入 150 µl 1× PBS，然后通过倒置板子排空孔内液体。 
		注意：乙醇预处理对时间非常敏感。膜的孵育时间不得超过 60 秒。在后续操作步骤中，膜不得干燥。</li>
		<li>每孔用 250 µl 1× PBS 洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入 100 µl 含 5 µg/ml 捕获用抗豚鼠 IFN-γ 抗体 V-E4 的 PBS 溶液进行包被。</li>
		<li>在 4°C 下孵育至少 12 小时。</li>
		<li>每孔加入 250 µl PBS，洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入 200 µl 封闭缓冲液（含 10% (w/v) 蔗糖和 2% (w/v) BSA 的 PBS 溶液），在室温下孵育 2 小时。</li>
		<li>每孔用 250 µl PBS 洗涤三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PBMCs 与抗原特异性肽段、阳性对照和阴性对照一同接种至板孔中。
	<ol>
		<li>将蛋白-肽混合物用 R10 培养基稀释至所需终浓度的肽段溶液。</li>
		<li>每个样本 PBMCs 设三个复孔进行检测。 
		注意：先将含刺激物的培养基加入 ELISpot 板孔中，再加入 PBMC 悬液。</li>
		<li>向指定孔中加入 50 µl 肽段-R10 培养基混合液。</li>
		<li>阴性对照孔中加入 50 µl 不含肽段的 R10 培养基配方。</li>
		<li>阳性对照孔中加入含 5 µg/ml 刀豆球蛋白 A（ConA）的 R10 培养基。</li>
		<li>向所有孔中加入 100 µl PBMC 细胞悬液</li>
		<li>在 37°C、含 5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 18 小时。 
		注意：将 ELISpot 板放置在培养箱内平坦的表面或支架上，孵育期间避免移动或扰动板子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 干扰素-γ阳性斑点的检测
<ol>
	<li>与检测抗体孵育及板子显色。 
	注意：本节所有步骤均无需无菌操作。
	<ol>
		<li>小心从培养箱中取出板子，安全弃去孔内液体。用 PBS 每孔 250 µl 洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入 100 µl 用封闭缓冲液稀释的 2 µg/ml 生物素化检测用抗豚鼠 IFN-γ 抗体 N-G3。 
		注意：将抗体溶液过滤（22 µm）以降低背景信号。</li>
		<li>室温下与检测抗体孵育 2 小时。</li>
		<li>弃去上清液，用 PBS 每孔 250 µl 洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入 100 µl 用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶（ALP）标记的链霉亲和素。 
		注意：将溶液过滤（22 µm）以降低背景信号。</li>
		<li>室温下与 ALP-链霉亲和素偶联物孵育 1 小时。</li>
		<li>弃去 ALP-链霉亲和素溶液，用 PBS 每孔 250 µl 洗涤两次，并通过将板子倒置并轻压于干净纸巾上来去除多余的 PBS。</li>
		<li>用 UltraPure DI 水每孔 250 µl 洗涤一次，并通过将板子倒置并轻压于干净纸巾上来去除多余的水分。</li>
		<li>每孔加入 100 µl BCIP/NBT（注意）底物溶液。注意：BCIP/NBT 高度易燃，若吞咽、接触皮肤或吸入有毒。使用前请参阅材料安全数据表（MSDS）。</li>
		<li>室温避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗板子 4 次，倒置轻敲以去除多余水分。</li>
		<li>从 ELISpot 板底部移除塑料排水垫，让板子自然干燥。</li>
		<li>通过手动计数或使用自动 ELISpot 读板仪（例如 CTL-Immunospot S6 读板仪）对斑点进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+protection+against+pathogenic+human+and+avian+influenza+viruses+via+in+vivo+electroporation+of+synthetic+consensus+DNA+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens.</a> PloS One. 3 (6), 2517(2008).</li>
<li>Lee, J. Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+baculovirus-based+vaccine+expressing+M2+protein+induces+protective+CD8%2B+T-cell+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).</li>
<li>Kinnear, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+T+cells+protect+against+RSV+infection+in+the+absence+of+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody.</a> Mucosal Immunology. , (2017).</li>
<li>Sridhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+correlates+of+protection+against+symptomatic+pandemic+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).</li>
<li>Brand, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T-cell+counts+and+interleukin-8+and+CCL-5+plasma+concentrations+discriminate+disease+severity+in+children+with+RSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection.</a> Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).</li>
<li>Bouvier, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+influenza+virus+transmission+studies%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective.</a> Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).</li>
<li>St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Ebolavirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Ebolavirus Infection.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).</li>
<li>Todo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdermal+Permeation+of+Drugs+in+Various+Animal+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species.</a> Pharmaceutics. 9 (3), 33(2017).</li>
<li>Schafer, H., Burger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+cellular+immunology+and+vaccine+research+the+in+the+guinea+pig%3A+monoclonal+antibodies+to+cell+surface+antigens+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines.</a> Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).</li>
<li>Sedgwick, J. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+immunoenzymatic+technique+for+the+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).</li>
<li>Moodie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+definition+criteria+for+ELISPOT+assays+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Response definition criteria for ELISPOT assays revisited.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).</li>
<li>Gillis, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel%2C+guinea+pig-specific+IFN-gamma+ELISPOT+assay+and+characterization+of+guinea+pig+cytomegalovirus+GP83-specific+cellular+immune+responses+following+immunization+with+a+modified+vaccinia+virus+Ankara+%28MVA%29-vectored+GP83+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine.</a> Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).</li>
<li>Schultheis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+guinea+pig+T+cell+responses+elicited+after+EP-assisted+delivery+of+DNA+vaccines+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin.</a> Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).</li>
<li>Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf">https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf</a> (2013).</li>
<li>Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Terminal+Blood+Sampling+Techniques+in+Guinea+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51982(2014).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).</li>
<li>Lewis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+hematology%3A+studies+on+guinea-pigs+%28Cavia+porcellus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%3A+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus).</a> Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).</li>
<li>Flecknell, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+P+%22Laboratory+Animal+Anaesthesia+%28Fourth+Edition%29%22">Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition)</a>. Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).</li>
<li>Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+guinea+pig+interferon-gamma%3A+tools+for+cytokine+detection+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization.</a> Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).</li>
<li>Lipiainen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stability+of+cytokine+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Formulation and stability of cytokine therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).</li>
<li>Wang, X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Specific+CD8+T+Cells+in+Peripheral+Tissues+Are+More+Resistant+to+Apoptosis+Than+Those+in+Lymphoid+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs.</a> Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).</li>
<li>Veron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Sequencing+of+T+Cell+Receptor+in+Peripheral+Blood+and+Muscle+from+Adeno-Associated+Virus+Vector-Injected+Subjects+Reveals+Differences+in+T+Cell+Clonality+Between+the+Two+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments.</a> Molecular Therapy. 23, 210(2015).</li>
<li>Sckisel, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phenotypes+of+memory+CD4+and+CD8+T+cells+in+the+spleen+and+peripheral+tissues+following+immunostimulatory+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33(2017).</li>
<li>Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+Dendritic+Cells+and+Their+Role+in+Cutaneous+Carcinoma+and+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Developmental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123(2013).</li>
<li>Amante, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Transfection+of+Dendritic+Cells+in+the+Epidermis+After+Plasmid+Delivery+Enhanced+by+Surface+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).</li>
<li>Mahe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+targeting+of+vaccine+compounds+to+skin+antigen-presenting+cells+by+hair+follicles+and+their+transport+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).</li>
<li>Vandermeulen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-specific+promoters+for+genetic+immunisation+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation.</a> Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).</li>
<li>Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+vaccination+using+skin+electroporation+promotes+poly-functional+CD4+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses.</a> Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+skin+dendritic+cells+to+improve+intradermal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).</li>
<li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+strategy+targets+epidermal+dendritic+cells%2C+initiating+their+migration+and+induction+of+a+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response.</a> Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054(2014).</li>
<li>Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+immunobiology+of+human+skin+and+functional+specialization+of+skin+dendritic+cell+subsets+to+innovate+intradermal+vaccination+design%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prototype+device+for+electroporation-enhanced+DNA+vaccine+delivery+simultaneously+to+both+skin+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle.</a> Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).</li>
<li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+synthetic+DNA+antigens+offers+protection+in+nonhuman+primates+challenged+with+highly+pathogenic+avian+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus.</a> Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electroporation-Enhanced+Intradermal+Delivery+of+DNA+Vaccine+Using+a+Minimally+Invasive+Surface+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).</li>
<li>Kichaev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+mediated+DNA+vaccination+directly+to+a+mucosal+surface+results+in+improved+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).</li>
<li>Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+reactions+of+CD4-+and+CD8-positive+T+cell+subpopulations+in+spleen+and+lymph+nodes+of+guinea+pigs+after+vaccination+with+Bacillus+Calmette+Guerin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin.</a> Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).</li>
<li>Shedlock, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Broad+Cytotoxic+T+Cells+by+Protective+DNA+Vaccination+Against+Marburg+and+Ebola%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola.</a> Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).</li>
<li>Hensel, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+Herpes+Simplex+Virus+2+%28HSV-2%29+Vaccines+Adjuvanted+with+Stable+Emulsion+and+Toll-Like+Receptor+9+Agonist+Induce+a+Robust+HSV-2-Specific+Cell-Mediated+Immune+Response%2C+Protect+against+Symptomatic+Disease%2C+and+Reduce+the+Latent+Viral+Reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02257(2017).</li>
</ol>

作者 Katherine Schultheis、Holly M. Pugh、Bryan S. Yung、Janet Oh、Holly M. Pugh、Jacklyn Nguyen、Laurent Humeau、Kate E. Broderick 和 Trevor R.F. Smith 是 Inovio Pharmaceuticals 的员工，因此从该公司获得薪酬和福利，包括股票所有权和股票期权。

豚鼠是疫苗和皮内递送策略临床前研发中一种有价值的动物模型。上述方案描述了在此高度相关的模型中检测抗原特异性T细胞反应的方法学。该检测方法可明确计数经抗原特异性肽段刺激后产生干扰素-γ的外周T细胞。通过非终末性采血可监测免疫反应的动力学过程。
我们优化了实验方案，并确定了使用该检测方法获得最佳结果的关键环节。例如，采血管中血液凝块的形成将导致外周血单个核细胞（PBMC）回收率和存活率不理想。豚鼠血液凝固速度非常快18采血过程必须迅速完成。Au-Birck 等人提供了豚鼠模型中采血技术的全面指南16由于采血需要全身麻醉，建议查阅该操作相关方面的适用标准操作规程19麻醉不足的豚鼠在用指甲轻轻夹住脚趾间的组织后会出现腿部移动或发声反应，或在夹捏耳朵后出现耳部抽动及胡须前伸的现象。将血液立即转移至含有抗凝剂的试管中，并通过滚动或反复倒置试管充分混匀，是本方案中的关键步骤。本方案所述实验使用EDTA抗凝管，未测试其他类型抗凝剂。请注意EDTA为高渗溶液，试管应尽量填充至半管以上，因此必须根据采样体积选择合适规格的试管。
若操作正确，密度梯度离心法可稳定获得纯净的外周血单个核细胞（PBMC）制备物。在离心前进行梯度分层时，密度梯度介质必须处于室温，且使用常规离心管时不应启用离心机刹车。在PBMC处理的实用性方面，一个显著改进是将密度梯度离心法与PBMC分离装置相结合，这可缩短离心时间。使用PBMC分离装置或常规离心管进行密度梯度离心，所得PBMC的活率、活细胞数量及斑点形成能力相似。无论采用何种离心管进行分离，均应立即收集白膜层。PBMC与密度梯度介质长时间接触具有细胞毒性。
准确计数有活力的外周血单个核细胞（PBMCs）对于将数量一致的细胞接种到检测板孔中至关重要。应采用某种活/死细胞区分方法。在本实验室中，我们使用台盼蓝排染法和自动细胞计数仪。
斑点质量定义为边缘清晰、对比度高的斑点，可提高检测的准确性并实现稳定一致的斑点计数，尤其是在使用自动化计数系统时。根据制造商的建议，我们发现对ELISpot板进行乙醇预处理是减少背景斑点数量并改善斑点清晰度的关键步骤。强烈建议在实验方案结束时使用酶标仪对ELISpot检测板进行成像。每个孔的原始图像均可被快速高效地获取并储存。与操作人员手动计数相比，使用图像分析软件对数字图像进行分析，可实现更客观的分析和斑点计数。
开发本实验方法的一个绝对必要条件是获得一对合适的抗豚鼠干扰素-γ抗体。小鼠单克隆抗体 V-E4 和 N-G3 是通过杂交瘤技术制备的，其B细胞克隆来源于经重组豚鼠干扰素-γ免疫的小鼠20。据报道，IgG1亚型的V-E4和IgG2a亚型的N-G3均能结合重组及天然抗原。在夹心ELISA体系中，将V-E4作为捕获抗体，生物素标记的N-G3作为检测抗体，可对重组和天然蛋白均实现高灵敏度检测，同时保持较低的背景信号。这两种抗体已通过由Hubert Schaefer博士实验室主导的生产合作协议向科学界提供，Schaefer博士为本出版物的共同作者。相关申请将由Schaefer博士实验室接收，并由其商业合作伙伴进行生产。
据报道，干扰素-γ在常规缓冲液或培养基中不稳定21. Schaefer 等20 使用已降解且失去生物学功能的IFN-y时，采用抗体V-E4和N-G3进行ELISA检测，仅观察到回收率出现中等程度下降。然而，将PBMCs的肽段刺激孵育时间延长至超过18小时的情况应谨慎测试。
使用外周血单个核细胞（PBMCs）的优势已被讨论。然而，此处描述的检测方法仅反映外周循环T细胞的抗原特异性应答。浸润组织的T细胞或从淋巴器官（如脾脏和淋巴结）分离的细胞可能表现出不同的特性22,23,24。在比较经相同pNP流感疫苗免疫的豚鼠的PBMCs与脾细胞产生的干扰素-γ斑点时，未观察到细胞应答存在显著差异14。
在本方案中，我们描述了一种皮内疫苗接种程序。皮内免疫的主要原理之一是靶向皮肤中高密度的树突状细胞25。我们及其他研究者已证明，通过调整递送方法26、制剂配方27或药物设计28，可特异性地靶向这些细胞。活化的专业抗原呈递细胞可迁移至引流淋巴结，并激活适应性免疫系统29,30,31,32。树突状细胞是启动有效细胞免疫应答所必需的抗原呈递细胞类型。
在本研究中，动物被接种了编码甲型流感病毒H1N1株A/PuertoRico/8核蛋白的质粒DNA。此前研究表明，通过皮肤递送该pDNA疫苗（pNP）并结合电穿孔技术，可在豚鼠33、雪貂及非人灵长类动物（NHPs）1,34中诱导抗原特异性的体液免疫反应。此外，该疫苗在经表皮递送后可在小鼠中引发强烈的T细胞应答35，通过使用代表这些细胞群特异性表位的肽段进行刺激，可证实该应答由CD4和CD8 T细胞介导。pNP疫苗在黏膜递送后也具有免疫原性，已在兔和豚鼠中观察到体液免疫反应，并在小鼠中检测到细胞免疫和体液免疫反应36。最近，我们课题组还证实了在兔中经肌内递送pNP疫苗后可诱导产生IFN-γ T细胞应答（未发表数据）。
目前，在豚鼠ELISpot实验中观察到的干扰素-γ斑点无法归因于CD4+或CD8+ T细胞亚群。特别是在设计和开发靶向皮肤的免疫疗法时，明确所观察到的干扰素-γ斑点频率是由某一特定亚群的扩增引起，还是由两种亚群的均衡应答所致，对于评估疫苗诱导交叉呈递的有效性具有重要意义。这一局限性可通过在将细胞接种至培养板前对CD4或CD8进行阴性分选，或通过鉴定MHC I类（针对CD8应答）或MHC II类（针对CD4应答）限制性表位来克服。
本文所述利用豚鼠外周血单个核细胞（PBMCs）进行的γ-干扰素ELISpot检测，旨在满足评估豚鼠实验模型中细胞免疫应答动态变化的需求。该方法将有助于优化疫苗及皮肤递送方案的开发。我们认为，该技术可推动这一重要动物模型在具有显著T细胞组分的疾病研究中的应用，例如结核病37、埃博拉38、单纯疱疹病毒（HSV）39等，并减少对相关性较低的动物模型的使用。

本方案可用于检测从哈特利豚鼠外周血单个核细胞（PBMC）群体中分离的细胞在抗原回忆后分泌干扰素-γ（IFN-γ）的情况。我们已应用该检测方法来表征豚鼠对流感疫苗接种方案所产生的抗原特异性T细胞反应的动力学特征和强度。我们认为，该方案将显著推动在此一高度相关动物模型中开展疫苗接种项目的临床前研究。
疫苗诱导的T细胞在抵抗传染性病原体以及与其他疾病相关的免疫治疗通路中发挥着关键作用。多项疫苗研究已凸显了T细胞的重要性。使用编码H5血凝素和N1神经氨酸酶的质粒DNA（pDNA）对雪貂和小鼠进行免疫接种，可在缺乏中和抗体的情况下，使其在流感病毒攻击中免于发病和死亡，表明T细胞免疫具有重要作用1。除了强烈的中和性体液免疫应答外，T细胞在病毒清除2以及小鼠抵抗呼吸道合胞病毒（RSV）感染的保护中亦发挥关键作用3。在人类中，2009年H1N1大流行期间，既存的CD8+ T细胞与疾病严重程度降低相关4。在感染RSV的儿童中，CD4+ T细胞计数与某些细胞因子血浆浓度与疾病严重程度相关5。
豚鼠作为实验动物模型，在医学多个领域的研究与开发中日益受到重视，例如皮肤致敏、营养学研究、听觉系统研究，以及对本工作而言最为相关的传染病研究。它在结核病和白喉疫苗的发现过程中起到了关键作用。近年来，豚鼠也被用作流感6和埃博拉7的动物模型。此外，由于其皮肤在生理上与人类皮肤具有相似性8，豚鼠为经皮药物递送方法提供了一个易于操作的小型动物模型。然而，与其在实验研究中的重要地位相比，可用于表征豚鼠免疫应答的特异性检测方法和探针仍然十分有限9。诸如干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISpot）这类常规用于临床前和临床研究中计数T细胞应答的基础细胞检测方法，此前一直未能建立。
最早的固相酶联免疫斑点法（ELISpot）用于测定多种B细胞群体中特异性抗体分泌细胞的数量10,11。该技术现已发展为可检测分泌多种细胞因子的细胞，包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、颗粒酶B以及IFN-γ。ELISpot检测具有高灵敏度，理论上可检测每一个分泌细胞因子的细胞。据报道，ELISpot检测的检出限低于每100,000个外周血单个核细胞（PBMCs）中10个斑点12。最近，一种针对豚鼠IFN-γ的特异性抗体对已面世13，这为弥补该领域的技术空白提供了新的可能。
IFN-γ 被认为是适应性免疫反应中的重要效应分子；它可在活化后由 CD4 和 CD8 T 细胞产生并分泌。在针对病毒感染的免疫反应中，IFN-γ 具有广泛的生物学功能，例如激活巨噬细胞，以及上调主要组织相容性复合体（MHC）I 类和 MHC II 类分子的表达。此外，IFN-γ 还可促进 B 细胞分化，抑制辅助性 T 细胞 2（T-helper-2）的增殖，并激活自然杀伤细胞。IFN-γ 能阻断病毒感染的体细胞中的病毒复制，并上调 MHC 分子的表达。因此，IFN-γ 的产生是评估 T 细胞对疫苗或病原体反应质量的重要指标。
本文所介绍的IFN-γ ELISpot的一个重要方面是使用外周血单个核细胞（PBMCs）而非脾细胞13。PBMCs可通过采集非终末性血液样本经处理后获得，而脾细胞的获取则需在动物安乐死后摘取脾脏。使用PBMCs可实现对IFN-γ T细胞反应的长期动态监测，并可用于评估如初免-加强免疫方案等对T细胞反应的影响14。
对于目前使用豚鼠作为动物模型的研究人员而言，IFN-γ ELISpot 方法将拓宽其可获得的科学数据范围。该方法的可用性如今可能减少对与目标疾病相关性较低的动物模型开展研究的必要性，此前这些动物模型的选择往往是由于检测细胞反应的试剂更容易获得。使用外周血单个核细胞（PBMCs）而非脾脏或淋巴结，可实现非终末性实验并对个体动物进行持续监测。
以下详细描述了在豚鼠中检测针对质粒DNA疫苗的干扰素-γ（IFN-γ）细胞免疫应答的各个步骤。我们概述了具体的递送方法，并介绍了包括采血、血液处理、外周血单个核细胞（PBMC）分离、实验操作及数据分析在内的通用ELISpot检测流程。ELISpot检测的示意图见图1。
<img alt="ELISPOT 检测示意图：血液样本采集、PBMC 分离、抗原包被、斑点计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：豚鼠 ELISpot 实验方案的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Cellectra-3P</td><td>Inovio Pharmaceuticals</td><td></td><td>ID-电穿孔装置/非商业用途，R&amp;仅限研发</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA 血液采集管</td><td>BD</td><td>367844</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE医疗集团&amp;nbsp;</td><td>17144003</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>SepMate 管</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85415</td><td>PBMC分离装置</td></tr><tr><td>RPMI&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-135</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;beta;β-巯基乙醇</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>96孔ELISpot PVDF膜&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MSIPS4W10</td><td>ELISpot 检测板</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844-1L</td><td></td></tr><tr><td>UPDI</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>超纯去离子水</td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30378.03</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A（ConA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶（ALP）偶联链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems Inc.&amp;nbsp;</td><td>SEL002</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems Inc.&amp;nbsp;</td><td>SEL002</td><td></td></tr><tr><td>捕获抗豚鼠干扰素-γ&amp;gamma; 抗体 V-E4</td><td>GenScript</td><td>订单号：U5472CE080-3</td><td>批号 # A217071153</td></tr><tr><td>生物素标记的检测用豚鼠干扰素-γ抗体&amp;gamma; 抗体 N-G3&amp;nbsp;</td><td>GenScript</td><td>订单号：U5472CE080-1</td><td>批号 # A21700598</td></tr><tr><td>CTL S6 微量分析仪</td><td>免疫斑点</td><td>#S6MIC12</td><td>全自动ELISpot酶标仪</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR</td><td>贝克曼库尔特</td><td>731050</td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>ImmunoSpot 5.1</td><td>免疫斑点</td><td></td><td>检测分析软件</td></tr><tr><td>ESCO 二类 A2 型</td><td>ESCO</td><td></td><td>生物安全柜</td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛</td><td>康宁公司</td><td>VWR 货号# 21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Exel Comfort Point 胰岛素注射器</td><td>MedLab Supply&amp;nbsp;</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td></td><td>离心机</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Quad Pak 试剂盒</td><td>贝克曼库尔特</td><td>383722</td><td></td></tr><tr><td>Incu Safe</td><td>松下医疗保健</td><td></td><td>培养箱</td></tr><tr><td>22 &amp;micro;m 滤光片</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>VWR 货号# 597-4520</td><td>22 &amp;micro;m 滤光片</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;nbsp;</td><td>VWR 货号 21903-005&amp;nbsp;</td><td>纸巾</td></tr></tbody></table>

优化的干扰素-γ elispot 法检测豚鼠疫苗接种后t细胞免疫应答

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

豚鼠作为相关的小型动物模型，在结核病、流感、白喉和病毒性出血热等传染病疫苗的研发中发挥了关键作用。我们已证明，将质粒DNA（pDNA）疫苗递送至皮肤可在豚鼠体内诱导强烈的体液免疫反应。然而，由于过去缺乏可用于研究T细胞反应的试剂和方案，该动物在免疫反应建模方面的应用受到一定限制。T细胞在免疫预防和免疫治疗机制中均发挥着关键作用。理解T细胞反应对于传染病和肿瘤疫苗以及相应递送装置的开发至关重要。本文介绍了一种用于检测豚鼠外周血单个核细胞（PBMCs）的γ-干扰素（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISpot）检测方法。该检测方法使研究人员能够在这一重要的啮齿类动物模型中表征疫苗特异性的T细胞反应。对外周血中分离的细胞进行检测，可实现对单个动物免疫原性的动态追踪。

本文展示的结果可作为采用本方案后预期结果的参考，强调了关键步骤的重要性，并证实了所述优化措施的优势。
按照方案第3.1步所述进行密度梯度离心后，试管底部的红色黏稠液体将含有大部分红细胞。如图2A所示，红细胞上方为一层密度介质。在顶部澄清或黄色的血浆层与密度梯度介质之间，存在一层白色或浅棕色的血沉棕黄层（buffy coat），其中含有大部分白细胞和血小板。分离不完全的表现为密度梯度介质上方出现红细胞。图2A中血浆呈现红色最可能是因为溶血所致，因为该血液样本在采集后1.5小时才进行处理。图2B显示了外周血单个核细胞（PBMC）分离装置中离心前（左）和离心后（右）的梯度情况。图2B中的血液样本在采血后尽快处理，血浆呈黄色。
膜用乙醇预润湿（见方案步骤4.1）对斑点形成的影响如图3所示。经预处理的孔中斑点轮廓更清晰，且在含培养基/DMSO的阴性对照孔中斑点数量减少（图3A）。处理后的豚鼠外周血单个核细胞（PBMC）典型存活率约为90%，在常规15 mL离心管和PBMC分离装置中相近（图3B）。从3 mL血液样本中获得的活细胞产量通常介于3 × 106 至 5 × 106 之间。
动物被接种了编码 H1N1 流感毒株 A/PuertoRico/8 核蛋白（NP）的质粒 DNA。 图4 显示了在疫苗接种方案期间T细胞IFN-γ应答的计数结果，以每百万PBMC产生的斑点形成单位（SFU）表示。从非免疫动物采集PBMC进行ELISpot检测，结果显示斑点数可忽略不计（未处理，no tx）。首次免疫（初免）后14天，在免疫原性刺激下，每百万PBMC平均检测到970个IFN-γ斑点。第二次免疫（加强免疫）后7天，针对全部三个肽段混合物的T细胞应答均有所增强，平均达到5020个IFN-γ SFU/106 PBMCs。第二次免疫后第46天（记忆阶段），每10万个细胞中平均产生6310个IFN-γ斑点形成单位（SFUs）6 外周血中计数PBMCs。
图注：
<img alt="离心示意图：血液分离、血浆、白膜层、密度介质、红细胞、10-30 分钟。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：密度梯度离心后各层的代表性图像。（A）常规试管中血液样本离心前（左）和离心后（右）的情况。（B）PBMC 分离装置中血液样本离心前（左）和离心后（右）的情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="含对照组和预处理的细胞活力检测；以点图形式进行研究比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：实验方案的优化。（A）按照本方案进行显色后，ELISpot 检测板孔中 IFN-γ 阳性斑点的典型形态。图示为经乙醇预处理（右侧）或无预处理（左侧）的三个重复孔示例。细胞分别在无刺激对照（顶部，DMSO）、抗原匹配肽段（中部）或有丝分裂原 ConA（底部）存在下过夜孵育。PBMCs 来源于同一只实验动物。使用自动板式扫描仪对孔板成像。（B）不同密度梯度管对处理后细胞的影响比较。采集了 3 只不同豚鼠的 3 mL 血样，每份样品取 1.5 mL，分别采用常规离心管（密度梯度介质）或 PBMC 分离装置进行处理。通过自动细胞计数系统和台盼蓝染色排除法测定细胞活力（左侧，% ± SEM）和活细胞数量（右侧，x 106 ± SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示NP Pool 1-3在初免、加强和记忆阶段的免疫反应（SFU/1×10⁶ PBMCs）的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：在疫苗接种程序过程中检测到强烈的细胞免疫应答。 在第1天和第15天，将30 µg编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的质粒DNA（pDNA）经皮内注射至哈特利豚鼠的腹部侧 flank，随后立即进行皮肤电穿孔。在首次免疫后14天（初免）、第二次免疫后7天（加强）和46天（记忆）检测IFN-γ ELISpot反应。图中显示了5只经处理豚鼠和2只未经处理豚鼠（无处理）的平均SFU值及标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

用于豚鼠外周血单个核细胞的干扰素-γ ELISpot 检测方法的建立，使得在此研究传染病高度相关的动物模型中表征T细胞免疫应答成为可能。我们已应用该检测方法来评估与DNA疫苗经皮内递送相关的T细胞免疫应答。

优化的干扰素-γ ELISpot 法检测豚鼠疫苗接种后T细胞免疫应答

豚鼠在结核病等传染病疫苗的研发过程中，作为相关的小型动物模型发挥了关键作用，……

过去，在豚鼠模型中对免疫治疗剂的表征仅限于测量体液免疫。ELISpot 实验克服了这一限制，将有助于研究人员在该动物模型中生成更有意义的数据。该技术的主要优势在于细胞来源于外周血。无需进行尸体解剖。这使得研究人员能够在自然感染过程中或在整个疫苗接种程序期间，对单个豚鼠的T细胞反应的强度和动力学进行测量。本次实验操作将由Holly Pugh演示。她是一位来自Inovio公司临床前研发部门的研究助理。首先，向ELISpot检测板的每个孔中加入15 µL的35%乙醇。60秒后，向每个孔中加入150 µL的PBS。倒置培养板以终止乙醇预处理。处理ELISpot检测板时也应格外小心，避免污染或损坏膜。洗涤时，向每孔加入250 µL PBS。重复洗涤两次后，向每孔加入100微升捕获用抗豚鼠干扰素γ抗体VE4。然后在4摄氏度孵育至少12小时。孵育结束后，洗涤平板三次。每孔加入 200 µL 封闭缓冲液。在室温下孵育平板 2 小时。随后再洗涤平板 3 次。在锥形管中加入4.5 ml室温密度梯度介质。然后将Hanks'平衡盐溶液与血液等体积混合。将稀释后的血液缓慢地分层加在密度梯度介质上方，注意不要扰动两相界面。此后，在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，离心过程中不使用刹车。从离心机中取出离心管时，注意不要扰动各层。正确识别各层后，吸取完整的中间白膜层以收获 PBMCs。将经 HBSS 稀释的血液缓慢地铺加在密度梯度介质上。避免扰动试管，并关闭离心机刹车。将细胞转移至新的 15 ml 离心管中。然后用R10培养基将细胞稀释至总体积15 ml。离心收集细胞后，弃去上清液，并将细胞重悬于15 ml R10培养基中。将细胞悬液通过70微米细胞筛网过滤至新离心管中。用台盼蓝排斥法计数细胞并确定活细胞数量，然后用R10培养基稀释细胞。首先去除封闭缓冲液，并洗涤培养板。针对每个PBMC样本，分别设置阳性对照、阴性对照以及每种实验特异性刺激物的三复孔。将蛋白肽混合物用R10培养基稀释至所需终浓度的三倍。随后，向板上的刺激物检测孔中加入50微升肽-R10培养基混合液。然后将50 µL用R10培养基配制的MT多肽制剂加入到平板的阴性对照孔中。将ConA用R10培养基稀释后加入到平板的阳性对照孔中，随后向所有孔中加入100 µL PBMC悬液。将ELISpot板放入培养箱中平坦的表面上，并在孵育期间避免扰动平板。从培养箱中小心取出培养板后，将培养板倒置以弃去上清液。随后洗涤培养板三次。向每孔中加入100 µL稀释后的生物素化检测捕获抗豚鼠干扰素γ抗体N-G3。然后在室温下孵育平板两小时。将平板倒置以去除抗体溶液，并重复洗涤三次。从平板中移除 PBS 后，向每个孔中加入 100 微升用封闭缓冲液稀释的碱性磷酸酶（ALP）标记的链霉亲和素。然后在室温下孵育平板1小时。将平板倒置以弃去ALP链霉亲和素溶液，并用PBS洗涤平板两次。倒置平板，用干净的纸巾轻压以去除多余的PBS。用去离子超纯水洗涤，每孔加入 250 微升。将酶标板倒置，用干净的纸巾吸去多余的水分。随后，每孔加入 100 微升 BCIP/NBT 底物溶液。将培养板在室温下避光孵育 20 分钟。用去离子水清洗培养板四次。然后将培养板倒置并轻拍以去除多余的水分。最后，从培养板底部移除塑料引流管，并使膜完全干燥。如前所述，成功进行密度梯度离心后，试管底部的红色黏稠液体应含有大部分红细胞。白膜层位于血浆层与密度梯度介质层之间。在加入捕获抗体之前对孔板进行预处理，可使检测结果的界限更加清晰，同时减少阴性对照孔中非特异性斑点的数量。斑点表明外周血单个核细胞（PBMC）群体中存在产生干扰素γ的T细胞。在进行该技术操作时，务必记住应谨慎而迅速地处理血液样本。这将提高细胞活力，改善斑点形成，并减少非特异性斑点的产生。请注意，操作血液和BCIP/NBT底物可能存在危险，因此在进行本实验时，应始终采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE）。我认为，该实验方案可使研究人员能够研究具有重要T细胞组分的疾病，例如结核病（TB）、埃博拉病毒病和单纯疱疹病毒（HSV）感染。重要的是，这将优化豚鼠模型中的疫苗接种方案的开发，并减少对相关性较低的动物模型的使用。

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