利用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR检测罗非鱼湖病毒

大家好。我叫 Win Surachetpong，是泰国 Kasetsart 大学兽医学院兽医微生物学与免疫学系的助理教授。

我和我的团队专注于罗非鱼的新兴病毒性疾病研究。目前我们正在研究罗非鱼湖病毒（tilapia lake virus），该病毒可导致罗非鱼高死亡率。由于罗非鱼是全球养殖量第二大的鱼类物种，为数百万人提供了蛋白质来源，在粮食安全中发挥着重要作用。

因此，罗非鱼湖病毒的近期暴发造成了社会经济影响，促使许多科学家致力于寻找解决这一问题的方法。迄今为止，我们亟需一种高度敏感、快速且准确的病毒检测方法。在本视频中，我们将逐步展示如何从样本采集、样本处理到实时PCR分析，检测鱼类组织中的罗非鱼湖病毒。

首先，将过量的麻醉剂溶于水中以处死鱼类。将死亡的鱼置于托盘上，使用95%乙醇对器械进行消毒，然后用酒精灯灼烧灭菌。从腹部下方开始，自下而上缓慢切开鱼体，以采集肝脏。

取部分肝脏组织放入1.5毫升离心管中。RNA提取的第一步应在超净工作台中进行，并佩戴防护装备。向管中加入1毫升RNA提取试剂。

使用组织研杵将肝脏研磨成均一的匀浆。向离心管中加入 200 微升氯仿，然后通过反复倒置离心管轻轻混匀。

室温静置三分钟。在 4 °C 条件下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。小心从离心机中取出离心管。

将500微升无色的上层水相轻柔转移至新离心管中。向管中加入等体积的异丙醇。在负20摄氏度下孵育2小时或过夜，以沉淀RNA。

孵育结束后，在相同的离心条件下离心溶液。从离心机中取出离心管，弃去上清液。RNA沉淀可见，如箭头所指。

加入一毫升75%乙醇至管中以洗涤RNA沉淀，并颠倒混匀数次。在4°C、10,000 RCF条件下离心15分钟。从离心机中取出管子，弃去上清液。

使用自动移液器吸出残留的乙醇，并在室温下晾干5至10分钟。加入30至60微升经预热至55至60摄氏度的无RNase水，以溶解RNA沉淀。取1至2微升RNA溶液，使用微量分光光度计测定其浓度。

结果将显示在屏幕上。使用无RNase的水将浓度稀释至200纳克每微升。使用下列所列的试剂和条件进行cDNA合成。

使用热循环仪，按照建议条件将RNA逆转录为cDNA。以下为使用实时PCR测定TiLV载量所用的试剂和条件。将六毫升qPCR预混液加入每个白色qPCR八联管的管中。

随后，将 4 毫升 cDNA 样品加入反应孔中。在此步骤中，每个孔必须更换新的吸头，以避免样品间的交叉污染。使用透明的 qPCR 条形管盖紧密封 qPCR 条板。

轻轻弹击条带末端，使溶液混匀。然后使用微量离心机离心，将所有液体收集至容器底部。按照视频中所示的两步条件操作，选择将要使用的96孔板中的孔位。

选择 cyber green 作为染料的荧光染料。将样本类型设为未知，然后在样本名称框中输入名称。打开实时 PCR 仪的盖子，将 qPCR 条带放入指定的孔中。

然后关闭盖子。根据所选条件运行仪器。当盖子达到设定温度后，仪器将自动启动并开始运行。

qPCR反应条件结束后，会显示扩增曲线。此处，速率箭头指示阈值线在指数扩增阶段与线性阶段之间的截断位置，由此得到CT值。随后，根据标准曲线将CT值外推为病毒拷贝数的对数值，以计算病毒的拷贝数量。

熔解峰也会被显示出来，以确认通过qPCR检测到的病毒是否确实为TiLV，其熔解峰通常在79.5至80.5摄氏度之间。因此，我们希望该方法能成为全球各地农民和相关机构的重要工具，帮助他们实施控制措施，限制TiLV感染的传播。