Name: 常规 rt-pcr 和 sybr 绿色 rt-qpcr 检测罗非鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习使用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR技术检测罗非鱼湖病毒（TiLV）的方法。本方案涵盖从组织取样、RNA提取、cDNA合成到病毒定量分析的完整流程，为水产养殖疾病防控提供高灵敏度检测手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢伯尔尼大学兽医科学学院兽医细菌学研究所提供的支持。本研究由伯尔尼大学兽医科学学院青年研究人员学术促进与性别平等委员会通过授予PN的120%模式资助项目提供经费支持。WS和PR由泰国高等教育委员会教育部下属泰国高等教育研究促进与国家研究型大学项目资助，隶属于泰国卡塞萨特大学高级研究学院农业与食品先进研究中心。我们谨向Kwanrawee Sirikanchana博士致谢，感谢她为视频提供解说，同时感谢Piyawatchara Sikarin对视频的编辑工作。

本研究的动物使用方案已获得泰国 Kasetsart 大学动物伦理委员会批准，许可编号为 ACKU 59-VET-016。
注意：有关本实验方案建议使用的试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 组织样本采集
<ol>
	<li>使用过量丁香油对鱼类实施安乐死（用量取决于&#160;鱼体大小及产品浓度，通常超过 3 mL/L）。将镊子和梅氏剪刀前端四分之一浸入 95%（v/v）乙醇中，随后用酒精灯灼烧器械以达到灭菌目的。 
	注意：可使用三卡因甲磺酸盐（MS-222）替代丁香油。</li>
	<li>找到肝脏并切取一小块组织（约 20–100 mg），或使用盖玻片或手术刀从罗非鱼体表由前向后刮取黏液，收集 200 µL 黏液样本，并将样本置于 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>立即处理样本，或将其保存于 RNA 稳定液中，或转移至 -80 °C 冰箱中暂存，待后续使用。 
	注意：RNA 操作过程中最关键的步骤是获得完整的 RNA 分子，并在整个后续操作中保持其完整性。RNA 骨架本质上比 DNA 更易受损。从组织细胞中提取和分离总 RNA 需要严谨的实验技术；操作时应佩戴手套，使用无 RNase 的水、试剂、仪器、塑料器皿、玻璃器皿及工作区域，并使用带滤芯的吸头进行移液，以全面防止 RNase 污染。</li>
</ol>
2. RNA的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法
<ol>
	<li>向含有第1节组织样本的试管中加入1 mL含苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液。 
	警告：该溶液毒性极强，必须在层流罩内佩戴适当的护目镜、防护服和安全手套，并使用防护设备小心操作。</li>
	<li>使用组织研磨杵匀浆器将组织样本研磨至均匀。 
	注意：也可使用动力匀浆器结合陶瓷珠对样本进行匀浆。确保在进入下一步前组织样本已完全匀浆，或在此暂停实验流程，将完全匀浆的样本于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>加入200 µL氯仿以实现相分离。 
	警告 氯仿具有潜在麻醉性且极度危险，必须在层流罩内佩戴防护设备以及适当的护目镜、防护服和安全手套小心操作。作为毒性较低的替代品，也可使用1-溴-3-氯丙烷。 
	注意：根据实际情况按比例调整体积。例如，若仅使用了500 µL含苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，则此步骤仅需加入100 µL氯仿。
	<ol>
		<li>通过反复倒置混匀样本&#160;15秒。</li>
		<li>在室温（RT）下孵育3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。 
	注意：应清晰分离为下层有机相、白色中间相和含有RNA的上层水相。上层通常无色，但根据匀浆组织的类型和量，可能呈现淡粉色。</li>
	<li>将上层水相（约500 µL）转移至新的微量离心管中，注意勿扰动中间相。 
	注意：不要试图转移全部水相，应保留少量液体，以防RNA所在的水相被有机相或中间相污染。</li>
	<li>加入等体积的100%异丙醇以沉淀RNA。
	<ol>
		<li>若使用的组织量极少，可选择性地向每个样本中加入1 µL（5–10 µg）无RNase的糖原，以促进RNA有效沉淀。这有助于在步骤2.8中识别RNA沉淀。 
		注意：糖原作为RNA的载体，可防止微量RNA粘附在管壁上。</li>
		<li>通过多次倒置充分混匀各管。</li>
		<li>将样本在-20 °C下保存2小时至过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液，注意勿松动微量离心管底部的RNA沉淀。</li>
	<li>加入1 mL 75%乙醇（v/v），通过反复倒置混匀RNA样本。</li>
	<li>在10,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。 
	注意：实验流程可在此暂停，含有RNA沉淀的75%乙醇样本可于-20 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>弃去上清液，注意勿松动微量离心管底部的RNA沉淀。
	<ol>
		<li>可选步骤：使用70%乙醇（v/v）重复步骤2.9–2.11。充分洗涤RNA沉淀可最大限度减少可能干扰下游敏感应用的盐分或污染物残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器吸除残留乙醇，然后在室温下空气干燥RNA沉淀，时间不超过5至10分钟。 
	注意：过度干燥的沉淀将难以重新溶解。</li>
	<li>加入30–60 µL无RNase的水（预热至55–60 °C），以溶解RNA沉淀。</li>
	<li>将RNA置于冰上立即使用，或于-80 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>
3. 使用微量分光光度计测定RNA浓度
<ol>
	<li>将分光光度计的设置切换至RNA模式。</li>
	<li>使用1-2 µL无RNase的水作为空白对照。</li>
	<li>使用1-2 µL每种RNA样品以测定RNA含量。</li>
	<li>记录每种样品在230 nm、260 nm和280 nm处的读数。</li>
	<li>使用无RNase的水将RNA稀释至200 ng/µL。</li>
</ol>
4. 利用总RNA合成互补DNA（cDNA）
<ol>
	<li>混合液 1 &#181;来自方案2的2微克总RNA &#181;M寡聚(dT)、0.5 mM dNTPs混合物，并加至终体积10 &#181;用无核酸酶水配制。为此，根据待测样本和对照的数量配制逆转录主混合液。 
	注意：对照组包括一个无逆转录酶样本（-RT），其中用无核酸酶水替代逆转录酶（见步骤4.3），以及一个无模板对照（NTC），其中以无核酸酶水代替RNA模板加入到预混液中。
	<ol>
		<li>用移液器充分混匀样品，然后短暂离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在指定条件下孵育&#160;65 &#176;5分钟5°C孵育，随后冰上孵育2分钟。
	<ol>
		<li>短暂离心样品，使所有液体聚集于管底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入1×&#160; 逆转录酶缓冲液，100 U 逆转录酶，并加至&#160;每个样本的最终体积至20 &#181;使用无核酸酶的水。
	<ol>
		<li>用移液器充分混匀样品，然后短暂离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 42 ℃ 下孵育样品&#160;&#176;C 下 60 分钟，随后 85 &#176;5分钟，50摄氏度</li>
	<li>将合成的 cDNA 用适量无核酸酶的水稀释至所需浓度，置于冰上立即使用，或于 -20 ℃ 保存&#160;&#176;C，以备后续使用。</li>
</ol>
5. TiLV 常规 PCR
<ol>
	<li>使用第4部分实验方案中生成的cDNA、样品和对照作为模板，结合表1中详述的任一已建立的引物对以及所选的DNA聚合酶，进行PCR反应。 
	注意：此处应额外设置无模板对照（NTC），即在PCR反应中以无核酸酶水替代cDNA。如有条件，还应包含阳性对照，即先前已验证为TiLV阳性的样品，或已将适当的TiLV cDNA片段克隆至质粒中的样本。</li>
	<li>根据所用DNA聚合酶系统的说明书以及待检测样品和对照的数量，配制PCR主混合液。该混合液应包含正向引物、反向引物、dNTPs、MgCl2、所选DNA聚合酶及其缓冲液。</li>
	<li>根据所选DNA聚合酶的说明书，将指定体积的主混合液与建议量的cDNA样品及对照样品混合。 
	注意：通常建议多配制0.5倍反应量，以补偿移液过程中可能的损耗。</li>
	<li>按照所用DNA聚合酶系统的说明书以及所用引物的适当退火温度（表1）进行PCR扩增循环。通常该程序包括：95 °C初始变性2–5分钟，随后进行30–40个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、推荐退火温度下退火30秒、72 °C延伸30秒，最后在72 °C进行5–10分钟的最终延伸。</li>
	<li>根据预期PCR产物大小，取每种PCR反应产物5–15 µL，并加入适当规格的DNA分子量标记物，上样至1–2%琼脂糖凝胶的加样孔中。通过凝胶电泳分离扩增的DNA片段，并用溴化乙锭（EthBr）染色，随后在凝胶成像系统中使用紫外光观察是否出现预期大小的DNA条带（表1）。 
	警告：溴化乙锭具有毒性，操作时应穿戴适当的防护服和安全手套，谨慎处理。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶向 TiLV 基因组片段</td>
			<td colspan="3">上游引物 
			5' - 3'</td>
			<td colspan="3">下游引物 
			5' - 3'</td>
			<td>PCR 产物大小 (bp)</td>
			<td>Tm 
			°C</td>
			<td>原始参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC</td>
			<td colspan="3">GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT</td>
			<td>1641</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong&#160; et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT</td>
			<td colspan="3">AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG</td>
			<td>1000</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT</td>
			<td colspan="3">TTACCATATATATAGTGAAGGC</td>
			<td>1445</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">GTCCAGGGCGGTATGTATTG</td>
			<td colspan="3">CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">GTTGGGCACAAGGCATCCTA</td>
			<td colspan="3">TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT</td>
			<td>250</td>
			<td>56</td>
			<td>Eyngor et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">TATGCAGTACTTTCCCTGCC</td>
			<td colspan="3">TTGCTCTGAGCAAGAGTACC</td>
			<td>491</td>
			<td>57</td>
			<td>Eyngor et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA</td>
			<td colspan="3">CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT</td>
			<td>1352</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG</td>
			<td colspan="3">GAGCTAAGGGAACGGCTATTG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG</td>
			<td colspan="3">ACCGTCCTGTTTCTGAATGG</td>
			<td>358</td>
			<td>60</td>
			<td>Nicholson et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA</td>
			<td colspan="3">GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT</td>
			<td>1250</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td>524</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC</td>
			<td colspan="3">CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG</td>
			<td>1087</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC</td>
			<td colspan="3">CGTTCTGCACTGGGTTACA</td>
			<td>696</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="3">CCAAATTTTACCTCTCGCAT</td>
			<td colspan="3">TCAAGCACTTAAAACTGTACC</td>
			<td>1027</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="3">CCCACACGACAGGACATATAG</td>
			<td colspan="3">GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA</td>
			<td>948</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="3">CTCTCTTTGCATTGCATACCGT</td>
			<td colspan="3">GACCAATTATCCCTGCTTTCA</td>
			<td>704</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="3">TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC</td>
			<td colspan="3">TTCCATCGACTGCTCCTAGA</td>
			<td>486</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="3">ACCTCATCTACACTAACATTTCCA</td>
			<td colspan="3">TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT</td>
			<td>637</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="3">CTTAAGGGCCATCCTGTCATC</td>
			<td colspan="3">TGGCTCAAATCCCAACACTAA</td>
			<td>476</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="3">TTGGTGATGTCACGATGGATA</td>
			<td colspan="3">AGTTCTATCGCCAGCCATGT</td>
			<td>351</td>
			<td>60</td>
			<td>Nicholson et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="3">ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC</td>
			<td colspan="3">TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA</td>
			<td>530</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="3">GATATCCTCCACATGACCCTTC</td>
			<td colspan="3">GTACGTCACTTTGTGCCATTAC</td>
			<td>261</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td colspan="3">AACCCTACTAACACCAAATATAGCT</td>
			<td colspan="3">CTTTCCCTCTGACACCCTGT</td>
			<td>450</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td colspan="3">TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT</td>
			<td colspan="3">CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT</td>
			<td>276</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于终点PCR扩增TiLV cDNA的已发表引物对。加粗显示的引物组用于生成图3A和3B中所示的代表性结果。
6. 鱼类湖病毒定量聚合酶链式反应（qPCR）
<ol>
	<li>使用含有适当TiLV基因组片段3 cDNA的质粒作为标准品，例如pTiLV32，制备重复两次或三次的10倍系列稀释液。</li>
	<li>为所有样本、标准品和对照准备qPCR主混合液，每反应需包含0.4 µL无核酸酶水、0.3 µL正向引物、0.3 µL反向引物和5 µL 2x SYBR Green DNA聚合酶主混合液。
	<ol>
		<li>引物使用浓度为10 µM，引物信息及标准品pTiLV如下： 
		正向引物：TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3') 
		反向引物：TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3') 
		标准品pTiLV：10 pg/µL 
		注意：如果样本和对照总数为10个，并以三复孔进行，则qPCR主混合液总量为12 µL无核酸酶水、9 µL正向引物、9 µL反向引物和150 µL SYBR Green DNA聚合酶主混合液。市售的2x通用SYBR Green DNA聚合酶主混合液已包含qPCR反应所需的所有组分，即SYBR Green I染料、热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2以及被动参比染料。请避免SYBR Green主混合液暴露于光照下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将6 µL qPCR主混合液分装至与所用qPCR仪器兼容的qPCR条形管或96孔板中。</li>
	<li>向条形管或96孔板的各孔中加入4 µL cDNA模板、对照或系列稀释的TiLV标准品。</li>
	<li>使用与所用qPCR仪器匹配的封板膜或管盖封闭qPCR管或96孔板。
	<ol>
		<li>轻轻弹击qPCR管以混匀溶液，并使用离心机短暂离心qPCR管或96孔板，使所有液体沉降至容器底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将qPCR管或96孔板放入实时荧光定量PCR仪中。
	<ol>
		<li>设置qPCR程序：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒，60 °C退火与延伸30秒，最后进行熔解曲线分析，温度从65 °C升至95 °C，每5秒升高0.5 °C。</li>
		<li>选择SYBR作为荧光染料，样本类型选择“未知”，并在样本名称框中输入相应名称。</li>
		<li>打开实时荧光定量PCR仪的盖子，将qPCR条形管放入指定孔位后关闭盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照设定条件运行RT-qPCR检测。当仪器盖子达到设定温度后，反应将自动开始。在每个延伸步骤后收集各样本的荧光信号，以实时监测反应进程。 
	注意：qPCR仪器及其配套软件将自动计算所有检测参数，并实时显示扩增曲线，同时在qPCR循环结束后生成标准曲线和熔解曲线。</li>
	<li>进行数据分析与获取，首先确认每个样本和标准品的熔解曲线在预期温度处呈现单一且均一的峰。
	<ol>
		<li>评估样本和标准品的扩增曲线，并在所有cDNA扩增速率一致的区域设定阈值。此步骤通常由软件自动完成，但仍需仔细核查。</li>
		<li>利用标准曲线计算TiLV拷贝数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TiLV 首次于2014年在以色列被报道14，此后已在包括埃及、哥伦比亚、印度、马来西亚、乌干达、坦桑尼亚和泰国在内的多个国家被发现15,16,18,35,48。全球范围内，特别是在罗非鱼生产国，人们对该病毒的关注日益增加，各国政府机构已实施多项限制和控制措施，以防止 TiLV 的传播。本文详细阐述了在罗非鱼组织中检测 TiLV 的完整流程，涵盖样本采集、RNA 提取、cDNA 合成、PCR 和 qPCR 检测。这些方法的多个方面值得特别讨论。迄今为止，TiLV 已在多种体型和种类的罗非鱼中被发现9,12,14,15,49，包括养殖的杂交罗非鱼（O. niloticus x O. aureus）11,14、尼罗罗非鱼（O. niloticus）9,10,14,15,16,33,35,36,49,50 和红罗非鱼（Oreochromis sp.）16,33,48,51，以及野生尼罗罗非鱼9,12、黑罗非鱼51、T. zilli14,15、S. galilaeus、O. aureus 和 T. simonis intermedia14；最近还发现野生鲤鱼（Barbonymus schwanenfeldii）感染 TiLV52。可从健康或濒死的罗非鱼（无论年龄、体型或种类）中采集内部器官（鳃、脾脏、肝脏、心脏、头肾）或黏液37组织样本，并用于 RNA 提取。本文所述的总 RNA 提取方法采用含苯酚和硫氰酸胍的单相溶液，其中硫氰酸胍是一种变性剂。组织可直接在此溶液中匀浆，随后加入氯仿并离心，实现相分离，形成含有 RNA 的上层清晰水相、中间相和下层有机相。RNA 通过异丙醇沉淀从水相中析出，再经洗涤去除杂质。该 RNA 提取方法由 Piotr Chomczynski 和 Nicoletta Sacchi 首创，被称为硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法53,54。用于 RNA 提取的此类试剂可直接购买或在实验室自行配制（详见材料表）。该方法耗时略长于基于柱法（如硅胶膜纯化）的方法，但总体成本更低，且 RNA 产量更高。
在本方案中，通过 A260 值对 RNA 进行定量，其中分光光度法测定值可反映 RNA 的纯度（A260/A280 = 1.9 - 2.1）。尽管该方法可较好地指示样本纯度，但无法绝对判断所提取 RNA 的质量。为准确判断 RNA 是否完整或部分降解，可通过琼脂糖凝胶电泳对样本进行分离，若经溴化乙锭（EtBr）染色后 18S 和 28S rRNA 条带出现弥散现象，则表明 RNA 已发生降解。进一步验证 RNA 质量的方法还可包括使用芯片实验室（lab-on-a-chip）仪器。此外，使用 DNase I 对纯化的 RNA 进行消化以去除污染的宿主基因组 DNA 也十分重要，否则根据后续实验应用的不同，可能导致假阳性结果。若 RNA 样本中仍存在大量宿主基因组 DNA 污染，可在 RNA 提取流程结束时额外进行一次 DNase I 处理（参见材料表）。
互补DNA（cDNA）的合成会显著影响整体qPCR结果，是该方法中可能引入变异的一个环节。本文推荐的cDNA合成方案采用单一组分体系，使用寡核苷酸（oligo）(dT)引物，因此仅转录含有polyA尾的mRNA。该方法允许使用者精确控制逆转录反应中所用的组分，且该cDNA合成模式已被证明在TiLV检测中有效32。&#160;另一种替代方案是使用市售的预混液（master-mix），其中包含逆转录反应所需的所有组分，操作快速简便，无需常规的多步骤移液和多温度程序。这种方法的优势在于可最大限度减少操作步骤，并提高所有样本之间的一致性。此类预混液通常同时包含oligo(dT)&#160;和随机引物，因此适用于多种RNA模板，能够生成代表整个RNA群体（包括病毒RNA和罗非鱼宿主mRNA）全长序列的cDNA拷贝。理论上，由此类样本可通过常规PCR或qPCR检测每一种目标RNA。这种灵活性是两步法RT-PCR的主要优势；它可提供一个长期可用的cDNA库，适用于多种不同的实验。在结果部分，展示了一种一步法RT-PCR方案，其中使用了序列特异性引物（表1），逆转录（RT）和PCR在同一管中进行（见材料清单）。通常情况下，与使用随机引物相比，序列特异性引物可实现更高的目标RNA逆转录效率，但此类cDNA样本中仅能定量该特定目标RNA，而这可能正是某些实验室的唯一目的（有关cDNA合成产品的建议，请参见材料表&#160;）。
尽管常规RT-PCR目前在TiLV诊断中应用较为广泛9,13,14,15,16,17,18,33,35,48,55，但RT-qPCR已被证明是检测和定量鱼类组织或黏液中微量TiLV的更强大工具32,37。总体而言，由于其高灵敏度、高特异性、良好的可重复性、宽动态范围和快速性，qPCR在临床病毒学诊断实验室中被广泛应用21。虽然qPCR的初始实施成本可能高于常规RT-PCR，但它具备诸多重要优势：从样本到结果的周转时间更短，且无需任何PCR后步骤。后者意味着实验室污染风险极低，并可更轻松地适用于高通量场景，例如疫情暴发期间。此外，其固有的灵敏度高于常规RT-PCR，这对于检测亚临床感染中的低病毒载量至关重要21。若使用常规方法实现同等灵敏度，则需采用巢式PCR策略，包括逆转录、两次PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。这些多个步骤耗时较长，并增加了出错或污染的可能性。然而，由于RT-qPCR具有高灵敏度，其对实验设计的严谨性以及对定量技术的深入理解提出了更高要求，以确保获得精确的结果56,57。
本方案中使用了DNA结合荧光染料SYBR Green I。它是一种对双链DNA非特异性结合的染料，因此该检测的特异性完全依赖于引物组，而引物可能产生假阳性结果58。因此，每次PCR结束后进行的双链DNA熔解曲线分析是PCR反应中尤为重要的步骤，因为它可确认仅生成了单一、具有正确Tm值的PCR扩增子（在新检测方法建立时，也应通过凝胶电泳实现这一验证）。DNA片段的Tm值取决于多种因素，包括其长度、GC含量、序列、链互补性、浓度，以及缓冲液成分和PCR增强剂。两个实验室展示的代表性结果中的熔解曲线分析未发现引物二聚体或其他非特异性PCR产物；但如果在其他样本和/或实验条件下观察到此类现象，则应对检测条件重新优化。更先进的qPCR技术无需进行熔解曲线分析，事实上，自本方法学论文发表以来，已开发出基于TaqMan探针的TiLV RT-qPCR检测方法，该方法使用两条引物和一条探针，对TiLV具有高度特异性34。
毫无疑问，为RT-qPCR检测所设计的引物是检测成功的关键，此处的引物是基于当时公开可获取的TiLV基因组数据设计的32。然而，RNA病毒以高突变率著称，可能会出现逃逸当前诊断检测的毒株，正如在ISAV中所观察到的情况59。对于此类病毒，开发一种通用的全型TiLV RT-qPCR检测方法始终具有挑战性，只有在获得更多来自广泛地域和不同时间点的TiLV基因组数据后，此类检测方法才能持续得到改进。
最后，&#160;在进行qPCR检测时，必须对每个样本设置复孔，条件允许时应设置三复孔，包括孔内和孔间qPCR实验均需如此。如果Ct 如果数值非常高，则使用重复样本尤为重要，以确保PCR反应的可靠性和可重复性。通常情况下，若重复反应的数据差异超过0.5个循环数，应重复进行反应；若Ct 数值持续变化 &#62; 若重复样本间出现0.5个循环的差异，则应重新优化实验。使用集成式qPCR移液机器人可极大缓解这一问题，但该设备属于高端工具。与任何实验一样，设置充分且适当的对照对于建立可靠的分子检测方法至关重要，尤其是在需要认证检测方法的诊断实验室中。对照应包括阳性对照（阳性TiLV样本、TiLV质粒标准品）和阴性对照（NTC和-RT样本），以及内源性罗非鱼看家基因的检测。这些对照的重要性不容低估，每次实验均应包含，以准确评估检测各步骤的质量并正确解读结果。

2014年，全球人均鱼类供应量达到创纪录的20千克，这得益于水产养殖业的迅猛发展。水产养殖业仍然是全球增长最快的动物性食品生产领域之一，也是唯一一个增速超过人口增长的动物性食品生产部门1。罗非鱼（Tilapiine cichlids）是全球养殖量第二大的淡水鱼类，2015年全球总产量达640万吨（MT），估计价值为98亿美元2。全球十大罗非鱼生产国依次为中国（178万吨）、印度尼西亚（112万吨）和埃及（88万吨），随后是孟加拉国、越南、菲律宾、巴西、泰国、哥伦比亚和乌干达2。预计到2030年，全球罗非鱼产量将达到约730万吨3。罗非鱼之所以成为重要的全球食物来源，不仅因为其是一种廉价的蛋白质来源4，还因其在多种水质和气候条件下均易于大规模繁殖5,6。仅仅几十年前，人们还认为对罗非鱼养殖构成商业威胁的重大疾病很少，但这一观点已不再成立。一种名为罗非鱼湖病毒病（tilapia lake virus disease, TiLVD）的新兴病毒性疾病，是迄今为止在罗非鱼中发现的首例严重疫情，整个产业正面临威胁。该病具有严重的社会经济影响，并对非洲7、亚洲和南美洲数百万人口的粮食安全构成直接威胁。2018年初，世界动物卫生组织（OIE）报告称，该病的病原体TiLV已在三大洲的八个国家被正式检出8；此后，坦桑尼亚、乌干达9、印度尼西亚10、中国台湾11和秘鲁12也相继报告了TiLV的出现。TiLV是一种新型单链RNA病毒，被描述为一种类似正粘病毒（orthomyxo-like virus）的病毒，因其具有多种与其他正粘病毒相似的特征，例如流感病毒或传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）13。该病毒最初是在以色列加利利湖野生和养殖罗非鱼发生大规模死亡事件后首次被鉴定出来的14。此后，埃及的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中报告了与TiLV感染相关的“夏季死亡”疫情15，而泰国的尼罗罗非鱼和红罗非鱼杂交种（Oreochromis spp.）中也报告了“一个月死亡综合征”16。历史上，水生动物病毒的检测通常通过细胞培养进行病毒增殖与分离。已有多种细胞系被用于TiLV的增殖与分离，包括源自蛇头鱼（Ophiocephalus striatus）的E-11细胞17,18，源自莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）的OmB和TmB细胞18，以及源自尼罗罗非鱼（O. niloticus）的OnlB和OnlL细胞19。尽管病毒培养的优势在于可提供用于后续实验的材料，但其缺点是至少需要4至7天才能观察到细胞病变效应（CPE），更重要的是，其他更适合复制的鱼类病毒也可能被扩增并产生类似的CPE。
近几十年来，人们逐渐摒弃了传统的、通常耗时较长的诊断方法（如细胞培养、血清学和抗原检测），转而采用更快、更灵敏的基于核酸的检测技术20,21。这一点在水生动物多种病毒性疾病的诊断中尤为明显，目前已开发出许多qPCR检测方法，用于诊断传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）22,23、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）24,25、贝塔诺达病毒（betanodavirus）26,27、鲑鱼α病毒（salmonid alphavirus）28、鱼类虹彩病毒（fish iridovirus）29、鳗鲡疱疹病毒1型（Anguillid herpesvirus 1, AngHV1）30以及淋巴囊肿病病毒（Lymphocystis disease virus, LCDV）31等。为遏制TiLV的传播，迫切需要建立可靠的诊断和病原监测方法。这些方法应能够在临床症状出现之前实现早期感染检测，并能够检出低病毒载量。迄今为止，已开发出多种用于鱼类组织中TiLV检测的PCR方案，包括RT-PCR14,32、巢式RT-PCR18、半巢式RT-PCR33以及RT-qPCR32,34。将RT-qPCR与易感细胞系中的病毒分离法进行比较发现，RT-qPCR的灵敏度比病毒分离法高出1000倍32。尽管已发表的每种PCR方案报告的TiLV检测灵敏度各不相同，但大多数检测方法均具有高度灵敏性，其检测限可低至每反应7.5个病毒拷贝33、7个病毒拷贝18或2个病毒拷贝32。
本文旨在详细说明如何开展罗非鱼湖病毒（TiLV）检测实验，内容涵盖从罗非鱼组织采集、总核糖核酸（RNA）提取、互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成，到针对TiLV的特异性聚合酶链式反应（PCR）检测。具体描述了常规逆转录PCR（RT-PCR）和基于SYBR Green I染料的定量逆转录PCR（RT-qPCR）两种全面的实验方案，以满足不同科研人员对TiLV检测的需求。前者灵敏度较低，但通常检测成本更为低廉；后者则需要更复杂的设备（如定量PCR仪）和价格较高的试剂，但具备可定量、快速且高度灵敏的优势，因此可用于亚临床感染鱼类中TiLV的检测。RT-PCR与RT-qPCR实验分别在两个不同实验室中进行，所用TiLV毒株来自不同地理区域，实验结果充分展示了本研究所述检测方法的灵敏性和可重复性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;组织采集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>步骤 1</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>丁香油的一种替代品。&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 步骤 1.1</td></tr><tr><td>RNAlater 稳定溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp; AM7020</td><td>若无法立即处理组织样本，可用于储存组织&lt;br/&gt; 步骤 1.3</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA提取&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>步骤 2</td></tr><tr><td>TRIreagent</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>赛默飞世尔科技（英坦科技）</td><td>15596026</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>GENEzol</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>Trisure</td><td>Bioline</td><td>BIO-38032</td><td>步骤 2.1</td></tr><tr><td>自制溶液</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>94.53 g/L（800 mM）硫氰酸胍&lt;br/&gt; 30.45 g/L&amp;nbsp; (400 mM) 硫氰酸铵&lt;br/&gt; 8.20 g/L&amp;nbsp; (100 mM) 乙酸钠&lt;br/&gt; 380 mL/L&amp;nbsp; (38 % v/v) 苯酚&lt;br/&gt; 50 mL/L（5% v/v）甘油&lt;br/&gt; 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-喹啉醇，pH 5.0&lt;br/&gt; 4℃下可保存长达2年&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C&lt;br/&gt; 步骤 2.1</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Green Beads</td><td>罗氏</td><td>3358941001</td><td>一种与下述组织裂解仪联合使用的替代性组织匀浆方法&lt;br/&gt; 步骤 2.2</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D，2 mL 管</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116913050</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>步骤 2.3</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1027E-G2.5L</td><td>步骤 2.3</td></tr><tr><td>1-溴-3-氯丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td>一种毒性较低的氯仿替代品&lt;br/&gt; 步骤 2.3</td></tr><tr><td>异丙醇（GC） &amp;ge; 99.8 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59300</td><td>步骤 2.6</td></tr><tr><td>异丙醇（ACS，ISO试剂，Ph Eur）</td><td>默克股份公司（EMSURE）</td><td>1.09634.2500</td><td>步骤 2.6</td></tr><tr><td>糖原，分子生物学级（例如，Sigma，货号 G1767）</td><td>赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）</td><td>R0551</td><td>若起始组织材料较少，此步骤有助于最大化RNA沉淀&lt;br/&gt; 可选</td></tr><tr><td>乙醇（气相色谱纯度） &amp;ge; 99.9 %</td><td>Sigma-Aldrich（EMD Millipore）</td><td>1.00983</td><td>步骤 2.9</td></tr><tr><td>乙醇（ACS，ISO试剂，Ph Eur）</td><td>默克（EMSURE）</td><td>1.00983.2500</td><td>步骤 2.9</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td>步骤 2.13</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>多细胞</td><td>809-115-CL</td><td>步骤 2.13</td></tr><tr><td>Ambion TURBO DNA-free 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（英坦吉）</td><td>AM1907</td><td>可在RNA提取方案结束时进行&lt;br/&gt; 可选</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;cDNA合成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>步骤 4</td></tr><tr><td>Viva cDNA合成试剂盒</td><td>Vivantis</td><td>cDSK01</td><td>步骤 4.1 &amp;& 4.3</td></tr><tr><td>含gDNA去除剂的ReverTra Ace qPCR RT MasterMix</td><td>Toyobo</td><td>A1172K</td><td>另一种选择&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 参见讨论部分</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT试剂盒</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td>另一种选择&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 参见讨论部分</td></tr><tr><td>AffinityScript 多温逆转录酶&amp;nbsp;</td><td>安捷伦科技</td><td>600107</td><td>另一种选择&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>第5步</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;DNA聚合酶系统：&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（英坦吉）&amp;nbsp;</td><td>14001012a</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; - GoTaq预混液</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;分离PCR反应混合物组分：&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>10 mM dNTP混合物</td><td>Vivantis</td><td>NP2409</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0971</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>含 KCl 的 10X Taq 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>00348114</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Vivantis</td><td>PL1202</td><td>步骤 5.2</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Verso 1步法 RT-PCR ReddyMix 配 ThermoPrime Taq</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>AB1454</td><td>一步法 RT-PCR，如图 3B 所示</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;凝胶电泳：&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>用于观察步骤 5.1-5.4 的 PCR 产物</td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液（10 mg/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17898</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>Tris/乙酸/EDTA（TAE）缓冲液：</td><td></td><td></td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Vivantis</td><td>PR0612-1KG</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 冰醋酸（ACS，ISO，Reag. Ph Eur）</td><td>默克股份公司（EMSURE）</td><td>1.00063.2500</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0729</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Vivantis</td><td>PC0701-100G</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>DNA 标准品与标记物</td><td>Vivantis</td><td>NL1405</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>DNA加样缓冲液（6X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>步骤 5.5</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;qPCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>第6步</td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技（应用生物系统）</td><td>A25779</td><td>如图4-6B所示&lt;br/&gt; 步骤 6.2</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>1725120</td><td>在视频以及图4-6A中示例展示&lt;br/&gt; 步骤 6.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1110</td><td>方案2</td></tr><tr><td>MagNA Lyser 仪器</td><td>罗氏</td><td>3358976001</td><td>方案2中与上述裂解珠联合使用的另一种组织匀浆方法&lt;br/&gt; 步骤 2.2</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G 匀浆仪</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>冷藏微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5427R</td><td>方案2&lt;br/&gt; 步骤&amp;nbsp;2.4, 2.7 &amp;和 2.10</td></tr><tr><td>冷藏微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5418R</td><td></td></tr><tr><td>加热箱</td><td>Labnet</td><td>AccuBlock 数字干浴器</td><td>方案2&lt;br/&gt; 步骤 2.13</td></tr><tr><td>微量分光光度计&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技（应用生物系统）</td><td>Nanodrop 2000</td><td>方案3&lt;br/&gt; 步骤 3.1 - 3.4</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>BIO-RAD</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td>方案5&lt;br/&gt; 步骤 5.4</td></tr><tr><td>电源</td><td>BIO-RAD</td><td>PowerPac HC</td><td>方案 5&lt;br/&gt; 步骤 5.5</td></tr><tr><td>水平凝胶电泳</td><td>BIO-RAD</td><td>Mini ReadySub-Cell GT 电泳槽 #1704487edu</td><td>方案5&lt;br/&gt; 步骤 5.5</td></tr><tr><td>微型微量离心机</td><td>康宁</td><td>LSE 6766</td><td>在第4、5步实验方案中，可用于快速离心PCR反应管 &amp;和 6&lt;br/&gt; 步骤 6.5.1</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>LioFuge</td><td>LM-60</td><td>步骤 6.5.1</td></tr><tr><td>qPCR 仪器及软件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统，配备 7500 软件 v2.0</td><td>方案6&lt;br/&gt; 步骤 6.6–6.8</td></tr><tr><td>qPCR 仪器及软件</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统配 CFX Manager 软件</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用材料&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>梅氏剪刀</td><td></td><td></td><td>步骤 1.1–1.2</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>步骤 1.1–1.2</td></tr><tr><td>移液器</td><td>瑞宁</td><td>Pipette-Lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶阻隔移液器吸头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z333328, Z333336, Z333344</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶的 1.5 ml 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用常规rt-pcr和sybr green rt-qpcr检测罗非鱼湖病毒

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

该方法旨在实现对罗非鱼组织中罗非鱼湖病毒（Tilapia Lake Virus, TiLV）的快速、高灵敏度和特异性检测。本方案可用于监测项目、生物安全措施以及TiLV基础研究实验室。病毒诊断的金标准通常包括病毒分离，随后采用逆转录聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）等互补技术进行进一步验证。该流程可能较为繁琐、耗时较长，且通常需要病毒含量较高的组织样本。采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测病毒具有诸多优势，包括定量能力、高灵敏度、高特异性、可扩展性以及快速获得结果。本文详细描述了基于PCR技术的TiLV检测全流程，包括罗非鱼器官切片、使用硫氰酸胍-酚-氯仿溶液提取总核糖核酸（RNA）、RNA定量，随后进行两步PCR操作，即互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成，并通过常规PCR或基于SYBR Green I染料的qPCR实现TiLV的定性检测或定量鉴定。 通过 使用SYBR Green I染料进行qPCR。常规PCR需要在PCR后进行额外步骤，仅能提示病毒的存在。后一种方法可实现对TiLV的绝对定量，灵敏度可达低至2个拷贝，因此在亚临床病例的TiLV诊断中具有极高的应用价值。本文对两种PCR方法进行了详细描述，提供了来自两个实验室的代表性结果，并深入讨论了两种方法的关键参数，以确保研究人员和诊断人员能够选择最适合且最适用的TiLV检测方法。

按照第1节所述方案，对表现出TiLV感染临床症状的濒死红罗非鱼（图1A）采用高浓度丁香油浴进行安乐死，丁香油具有麻醉作用。已报道的临床症状存在差异，但常见症状包括精神萎靡、皮肤糜烂和变色、眼球突出、鳞片脱落、开放性伤口/病灶以及异常行为15,16,33,35,36，其中部分症状在图1A中可清晰观察到。通过移除腹壁以采集肝脏、脾脏或头肾等内脏器官（图1B）。同时在此阶段使用盖玻片或手术刀从鱼体前部向后部轻轻刮取皮肤，收集黏液样本37。
<img alt="鱼类解剖解剖学分析；解剖前后图像，显示内脏器官暴露。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 罗非鱼解剖与样本采集。A. 感染TiLV的红色杂交罗非鱼，表现为皮肤病变、口部及鳃盖周围发红、皮肤糜烂以及角膜混浊。B. 解剖后的红色杂交罗非鱼，以便从肝脏（蓝色箭头所指位置）、脾脏或头肾器官采集组织样本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58596/58596fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
随后，按照第2节所述的硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取总RNA，并依照第3节所述进行RNA定量，通过计算纯度比值并分析光谱图谱来评估样品纯度（图2）。图2A展示了一次成功的总RNA提取的代表性结果，而图2B则代表一次质量较差的RNA制备。核酸在260 nm处有最大吸收峰，而蛋白质的吸收峰在280 nm处。260 nm与280 nm处吸光度的比值可反映各样品的纯度，比值在1.9至2.1之间表明RNA纯度较高，如图2A中的样品所示。在图2B中观察到较低的A260/280比值，提示可能存在蛋白质或苯酚残留污染。230 nm处的吸光度可能由样品污染引起，因此也需计算A260/230比值。对于纯RNA样品，该比值应在2.0–2.2范围内，如图2A中样品的比值为2.03所示；而图2B中A260/230比值较低，为1.07，且光谱图显示230 nm处的吸收谷向240 nm偏移，提示样品中可能存在残留的胍或苯酚。对于图2B所示的样品，可通过RNA重新沉淀以去除污染，从而提高样品纯度。
<img alt="RNA吸收光谱图，10mm吸光度与波长；数据表比较，RNA质量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 从患病罗非鱼组织中提取的总RNA的分光光度法定量分析。A. 成功RNA制备的纯度比值及光谱特征。B. 同A，但代表一次失败的RNA提取过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58596/58596fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为通过RT-PCR检测TiLV，将如图2A所示的纯样品进行反转录（方案4），生成cDNA，并将其作为模板用于第5节所述的PCR检测，代表性结果见图3A。表1中以粗体显示的引物用于扩增TiLV基因组第3节段长度为491 bp的片段14。PCR产物通过凝胶电泳分离，并用EtBr染色以进行观察。图3A展示了使用4个cDNA样品（S1-S4）进行的两步法RT-PCR结果，这些样品来源于泰国分离的患病罗非鱼肝脏；在每个样品中均可观察到一条清晰的单一条带，大小约为500 bp，因此样品1-4为TiLV阳性。阳性对照样品（包含克隆至质粒中的TiLV第3节段cDNA32）也获得了相同的PCR产物，而无模板对照（NTC）未产生任何PCR产物。图3B中的检测使用了与图3A相同的引物，但在不同实验室进行，采用一步法RT-PCR，并使用了5个来源于埃及养殖罗非鱼头肾组织的RNA样品15。通过该检测方法确定，样品1、3和5为TiLV阳性，而样品2和4为TiLV阴性，因为在正确大小位置未检测到PCR产物。阴性对照（包括两个未加反转录酶的对照和两个NTC）均未产生任何PCR产物。同时，还针对罗非鱼ActinB基因进行了一步法RT-PCR检测。如预期所示，每个样品（S1-S5）均扩增出大小为217 bp的产物38。该检测用作RNA样品完整性的对照，同时也可用于对TiLV阳性样品进行半定量分析。由于所扩增的罗非鱼ActB产物量相对均一，因此TiLV特异性PCR产物量的差异可真实反映特定组织样品中TiLV的含量。
<img alt="凝胶电泳结果；DNA 条带、大小标记物、样品 S1-S5、对照 C1-C4。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. TiLV RT-PCR 检测。A. 对来自泰国病死罗非鱼肝脏组织的 cDNA 样品，使用针对 TiLV 第 3 节段（见表 1中加粗序列）的特异性引物，通过两步法 RT-PCR 检测 TiLV 感染。M = 以碱基对表示的标记物；S1-S4 = 样品 1-4；C1 = 以 pTiLV 作为 PCR 模板的阳性对照；C2 = 无模板对照（NTC）。B. 使用与 A 相同的引物，对来自埃及病死罗非鱼头肾组织的样品进行一步法 RT-PCR15。M = 以碱基对表示的标记物；S1-S5 = 样品 1-5。对照 C1-C2 为未加逆转录酶的对照，C3-C4 为无模板对照（NTC）。下图显示使用针对罗非鱼 ActinB38 的引物（详见正文）进行一步法 RT-PCR，扩增出 217 个碱基对的 PCR 产物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58596/58596fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
与图3所示的终点PCR不同，第6个方案中介绍的qPCR检测可在每一轮PCR循环后测定PCR产物的量。目标DNA的扩增通过与每轮反应生成的DNA相互作用的荧光分子进行检测。本实验中使用了SYBR Green I染料，该染料可嵌入双链DNA中。在反应过程中持续监测荧光信号，其强度与生成的产物量相关39,40,41,42,43。TiLV的qPCR检测按照第6个方案在不同实验室中进行，使用了不同的SYBR Green试剂、qPCR仪器以及来自不同国家的样本。所得扩增曲线如图4A和4B所示。可以看出，每个检测实验的过程均包含四个阶段：线性基线期、早期指数增长期、晚期指数增长期和平台期。线性基线期出现在早期循环阶段，由于DNA量产生的信号/背景比不足，尚无法识别DNA的复制情况。此阶段用于计算基线荧光值。随后，目标DNA的浓度在每个循环中开始翻倍，使信号超过背景水平并呈指数增长。一个优化良好的qPCR检测在反应初期扩增效率（E）非常高（接近100%），并在扩增的早期指数增长阶段保持稳定，此时反应效率仍恒定，定量分析即在此阶段进行。在后续循环中，信号开始进入平台期，荧光强度不再与初始模板拷贝数相关，因为反应组分已被耗尽44。饱和现象也可能由复性反应的竞争、各组分浓度比例的变化，或酶单位与DNA底物分子数量的比例变化引起。这些因素可能解释了图4A和4B所示不同检测之间扩增曲线的差异。所包含的对照未产生这些特征性的扩增曲线。
<img alt="qPCR扩增曲线图，显示用于DNA定量的相对荧光单位（RFU）与扩增循环数的关系；该图突出展示扩增效率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 扩增曲线图，用于显示实时荧光定量 PCR 检测过程中产物随时间的累积情况。 A. 利用SYBR Green I两步法qPCR检测来自泰国的TiLV阳性样本、NTC及阳性质粒对照的扩增曲线。该图表通过绘制相对荧光单位（RFU）生成 与 循环数 B埃及来源的TiLV阳性样本扩增曲线，如 图3B 以及一个NTC。扩增曲线是报告荧光信号相对于检测中加入的被动ROX染料荧光的归一化值（Rn） 与 循环次数 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58596/58596fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
在各实验室不同仪器上完成qPCR热循环后，对数据进行采集和分析。 图5A 和 5B 显示各实验室所进行实验的代表性熔解曲线。每台qPCR仪器均设置在反应结束后进行熔解曲线分析，通过逐步升高温度并监测荧光信号随温度的变化来实现。当温度升高至足以使双链DNA（dsDNA）变性时，由于荧光分子被释放，荧光信号显著下降。各qPCR仪器的软件据此计算退火温度（Tm) 通过绘制负的一阶导数相对于温度的曲线，从熔解曲线数据中获得图5）。可以看出，在 图 5A 和 5B 不同样本组中形成的产物在约预期温度下具有均一的熔解转变 80 °C 用于检测。在较低温度下未观察到其他峰。由于尺寸较小，Tm 引物二聚体的产量通常低于目标DNA序列的产量。因此，两者之间的Tm使其易于识别潜在的引物二聚体或其他非特异性扩增产物。对照组未产生类似TiLV阳性样本和标准品的熔解曲线，在图表底部呈现为几乎水平的直线 图 5A 和 5B.
<img alt="熔解曲线分析图；绘制DNA变性研究的ΔRFU/dT、-Rn与温度的关系曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5。 熔解曲线分析用于确认检测的特异性，并可通过其熔解特征区分不同的PCR产物。A. 来自泰国的TiLV阳性样本、阴性对照和阳性质粒对照的熔解曲线分析。B。 来自埃及的TiLV阳性样本、pTiLV标准品和NTC的熔解曲线分析。A和B中的图表均显示了荧光变化量与温度变化量之比（ΔRFU/dT）随温度变化的曲线，从而清晰呈现熔解动力学特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58596/58596fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
大多数qPCR仪器都配有软件，可辅助进一步分析qPCR运行结果，并通过自动绘制循环阈值（Ct) 对 pTiLV 标准品模板拷贝数的对数值作图，如图所示 图6A 和 6B 对于两个独立实验室。简言之，Ct 是用于评估qPCR结果的单位。Ct 值表示达到设定阈值荧光信号水平所需的循环次数。起始模板量越大，达到可检测荧光水平所需的循环数越少。实际上，TiLV 载量高的样本其 C 值将更低t 高于TiLV载量较低的样本（如亚临床感染的鱼类）的值。为了确定Ct 数值，首先从原始数据中扣除背景荧光水平。接着，qPCR 仪器配套软件将通过搜索每个样本的数据曲线并结合 Ct 表示样品穿过阈值的位置。每个检测需单独进行此操作，且每个阈值都应仔细评估，确保阈值设定在扩增曲线的对数增长阶段，并位于所有曲线相互平行的区域。因此，特定的 Ct 获得的值是相对值，其相对于起始模板拷贝数而言45，但也特异于所使用的qPCR仪器和试剂、PCR扩增效率以及检测灵敏度。这些参数导致了相同检测方法在应用中观察到的差异 图6.
根据图6中的标准曲线，进行了回归分析，包括计算标准曲线的斜率（m）和截距、扩增效率（100 × (101/m - 1)）46以及反应的线性度。标准曲线分析还用于确认检测方法的灵敏度（检出限）、重复性和重现性。理论上，DNA在每轮PCR循环中数量翻倍，即扩增效率（E）为100%。然而在实际中，由于DNA聚合酶抑制、污染物、cDNA过量以及移液误差等非最佳PCR条件的影响，通常难以达到如此理想的效率47。通常情况下，优质检测的扩增效率（E）范围为90–110%；在图6A中，使用8个连续稀释的pTiLV样品计算得到的效率为94.5%；而在图6B所示检测中，使用7个连续稀释的pTiLV样品计算得到的效率为101.2%。扩增效率超过100%通常表明反应体系中存在PCR抑制物。对标准曲线进行线性回归分析还可用于计算每个样品中TiLV的拷贝数41,42,45，例如在图6B中以红色显示的三个TiLV样品所示结果，这与图3B中样品S1、S3和S5的结果一致。
<img alt="PCR循环阈值图；DNA拷贝数对数值与循环阈值关系图；定量分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58596/58596fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. RT-qPCR 标准曲线。对 pTiLV 进行 10 倍系列稀释，作为两家实验室共同使用标准品进行实时 PCR 扩增。 A. 检测了8个连续稀释的pTiLV样本，所有样本浓度已知，并与每反应中TiLV拷贝数相关联。标准曲线通过绘制log拷贝数生成 与 循环阈值（Ct）。斜率 = -3.462，R2 = 0.9992，扩增效率为94.47%。 B与A图相同，但检测了7个连续稀释的pTiLV样本（绿色），图表中y轴显示扩增反应的阈值循环数，x轴显示TiLV的拷贝数（数量）。y轴截距 = 32.327，斜率 = -3.292，R2 = 0.98，扩增效率为101.2%。A和B中的两条标准曲线，其斜率、y轴截距及相关系数（R）2) 用于评估检测方法的性能。重要的是，R2 其值应接近1，因为这是标准曲线线性度的衡量指标。斜率用于计算PCR扩增效率，其中100%的扩增效率对应斜率为-3.32，具体公式及详细信息见正文。一次良好的qPCR反应，其扩增效率通常在90%-110%之间，对应的斜率范围为-3.58至-3.10。标准曲线用于对未知的TiLV阳性样本进行绝对定量，以确定每个反应中TiLV拷贝的确切数量，如图B中以红色标注的三个TiLV阳性样本所示。

本方案采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，对罗非鱼组织中的罗非鱼湖病毒（TiLV）进行诊断。整个方法从组织解剖开始，直至总RNA提取、cDNA合成，并通过常规PCR或利用双链DNA结合型荧光染料的定量PCR检测TiLV。

利用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR检测罗非鱼湖病毒

本方法旨在实现对罗非鱼组织中罗非鱼湖病毒（Tilapia Lake Virus, TiLV）的快速、灵敏和特异性检测。该方案可用于监测项目、生物安全措施以及TiLV基础研究实验室。病毒诊断的金标准通常包括病毒分离，随后采用互补技术（如逆转录聚合酶链式反应，RT-PCR）进行进一步验证。该流程可能较为繁琐、耗时较长，且通常需要病毒含量较高的组织样本。采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测病毒具有诸多优势，包括可定量、高灵敏度、高特异性、可扩展性强以及结果出具迅速。本文详细描述了基于PCR的TiLV检测全流程，包括罗非鱼器官取样、使用硫氰酸胍-酚-氯仿溶液提取总核糖核酸（RNA）、RNA定量，随后进行两步PCR操作：首先合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），再通过常规PCR或基于SYBR Green I染料的qPCR对TiLV进行检测。常规PCR需进行扩增后步骤，仅可判断病毒是否存在；而后者可实现TiLV的绝对定量，检测下限低至2个拷贝，因此在亚临床病例的TiLV诊断中尤为有用。本文还详细描述了两种PCR方法的操作流程、两个实验室的代表性结果，并深入讨论了两种方法的关键参数，以帮助研究人员和诊断人员选择最适合且可应用的TiLV检测方法。

大家好。我叫 Win Surachetpong，是泰国 Kasetsart 大学兽医学院兽医微生物学与免疫学系的助理教授。我和我的团队专注于罗非鱼的新兴病毒性疾病研究。目前我们正在研究罗非鱼湖病毒（tilapia lake virus），该病毒可导致罗非鱼高死亡率。由于罗非鱼是全球养殖量第二大的鱼类物种，为数百万人提供了蛋白质来源，在粮食安全中发挥着重要作用。因此，罗非鱼湖病毒的近期暴发造成了社会经济影响，促使许多科学家致力于寻找解决这一问题的方法。迄今为止，我们亟需一种高度敏感、快速且准确的病毒检测方法。在本视频中，我们将逐步展示如何从样本采集、样本处理到实时PCR分析，检测鱼类组织中的罗非鱼湖病毒。首先，将过量的麻醉剂溶于水中以处死鱼类。将死亡的鱼置于托盘上，使用95%乙醇对器械进行消毒，然后用酒精灯灼烧灭菌。从腹部下方开始，自下而上缓慢切开鱼体，以采集肝脏。取部分肝脏组织放入1.5毫升离心管中。RNA提取的第一步应在超净工作台中进行，并佩戴防护装备。向管中加入1毫升RNA提取试剂。使用组织研杵将肝脏研磨成均一的匀浆。向离心管中加入 200 微升氯仿，然后通过反复倒置离心管轻轻混匀。室温静置三分钟。在 4 °C 条件下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。小心从离心机中取出离心管。将500微升无色的上层水相轻柔转移至新离心管中。向管中加入等体积的异丙醇。在负20摄氏度下孵育2小时或过夜，以沉淀RNA。孵育结束后，在相同的离心条件下离心溶液。从离心机中取出离心管，弃去上清液。RNA沉淀可见，如箭头所指。加入一毫升75%乙醇至管中以洗涤RNA沉淀，并颠倒混匀数次。在4°C、10,000 RCF条件下离心15分钟。从离心机中取出管子，弃去上清液。使用自动移液器吸出残留的乙醇，并在室温下晾干5至10分钟。加入30至60微升经预热至55至60摄氏度的无RNase水，以溶解RNA沉淀。取1至2微升RNA溶液，使用微量分光光度计测定其浓度。结果将显示在屏幕上。使用无RNase的水将浓度稀释至200纳克每微升。使用下列所列的试剂和条件进行cDNA合成。使用热循环仪，按照建议条件将RNA逆转录为cDNA。以下为使用实时PCR测定TiLV载量所用的试剂和条件。将六毫升qPCR预混液加入每个白色qPCR八联管的管中。随后，将 4 毫升 cDNA 样品加入反应孔中。在此步骤中，每个孔必须更换新的吸头，以避免样品间的交叉污染。使用透明的 qPCR 条形管盖紧密封 qPCR 条板。轻轻弹击条带末端，使溶液混匀。然后使用微量离心机离心，将所有液体收集至容器底部。按照视频中所示的两步条件操作，选择将要使用的96孔板中的孔位。选择 cyber green 作为染料的荧光染料。将样本类型设为未知，然后在样本名称框中输入名称。打开实时 PCR 仪的盖子，将 qPCR 条带放入指定的孔中。然后关闭盖子。根据所选条件运行仪器。当盖子达到设定温度后，仪器将自动启动并开始运行。qPCR反应条件结束后，会显示扩增曲线。此处，速率箭头指示阈值线在指数扩增阶段与线性阶段之间的截断位置，由此得到CT值。随后，根据标准曲线将CT值外推为病毒拷贝数的对数值，以计算病毒的拷贝数量。熔解峰也会被显示出来，以确认通过qPCR检测到的病毒是否确实为TiLV，其熔解峰通常在79.5至80.5摄氏度之间。因此，我们希望该方法能成为全球各地农民和相关机构的重要工具，帮助他们实施控制措施，限制TiLV感染的传播。

detection-tilapia-lake-virus-using-conventional-rt-pcr-sybr-green-rt

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

常规 rt-pcr 和 sybr 绿色 rt-qpcr 检测罗非鱼

本文描述了一种一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，用于检测儿童粪便样本中的诺如病毒分离株并进行基因组别鉴定，该方法采用针对诺如病毒基因组中最保守区域——开放读码框1（ORF1）与开放读码框2（ORF2）连接区的特异性引物和TaqMan探针。同时详细介绍了一种非商业化的、经济高效的RNA提取方法。...

通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

来源：Gulla, S.，等．通过多重PCR和毛细管电泳对鱼类致病性细菌Yersinia ruckeri进行多位点可变数目串联重复序列分析．J. Vis.

利用可变数目串联重复序列（VNTR）分析检测鱼类病原体

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。...

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

实时定量聚合酶链式反应结合逆转录（RT-qPCR）已广泛用于检测RNA病毒感染水平。本文介绍一种直接RT-qPCR检测方法，该方法无需RNA纯化步骤，可用于包括登革病毒在内的多种RNA病毒的定量分析。...

通过实时定量聚合酶链式反应检测感染细胞培养上清液中的登革病毒RNA

这种使用双链DNA嵌 intercalating...

泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断

我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。...

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

我们介绍一种使用简单仪器在较短时间内检测罗非鱼中TiLV的RT-LAMP检测方法，相较于传统的RT-PCR技术更为快速。该方案可能有助于控制TiLVD的流行传播，特别是在发展中国家。...

用于特异性快速检测罗非鱼湖病毒的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法

本文提供了一套完整的实验方案，用于标准化和实施通过逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术检测人源样本中SARS-CoV-2病毒的方法。该方法可在60分钟内完成，成本低廉，仅需使用价格较低的设备，可适用于任何实验室或基层检测场所。...

通过逆转录-环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2病毒

我们提供了两种基于探针的自主研发一步法RT-qPCR试剂盒，用于检测常见呼吸道病毒。第一种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）、甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及乙型流感病毒。第二种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，靶标为UpE和ORF1a）。这些检测方法可在任何专业实验室中成功实施。...

SARS-CoV-2、流感病毒A/B型和MERS-CoV多重实时RT-qPCR检测方法的建立

学习使用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR技术检测罗非鱼湖病毒（TiLV）的方法。本方案涵盖从组织取样、RNA提取、cDNA合成到病毒定量分析的完整流程，为水产养殖疾病防控提供高灵敏度检测手段。

利用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR检测罗非鱼湖病毒

探索更多视频