Name: 单壁碳纳米管 (sscnt) (mallat1 反义寡 3号) 抑制多骨髓瘤细胞在体内的生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解利用单壁碳纳米管递送反义寡核苷酸治疗多发性骨髓瘤的方法。该技术通过SWCNT-anti-MALAT1偶联物实现高效体内药物递送，为核酸药物开发提供新策略。

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作者感谢Lerner研究所的蛋白质组学、基因组学和成像核心提供的协助与支持。资助：本研究由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）R00 CA172292基金（资助J.J.Z.）、启动资金（资助J.J.Z.）以及凯斯西储大学临床与转化科学协作中心（CTSC）核心使用试点基金（资助J.J.Z.）提供经费支持。本研究使用了Leica SP8共聚焦显微镜，该设备由美国国立卫生研究院SIG基金1S10OD019972-01资助购置。

所有涉及动物的实验均事先获得克利夫兰诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 功能化单壁碳纳米管的合成
<ol>
	<li>在20 mL玻璃闪烁瓶中，加入1 mg SWCNTs、5 mg DSPE-PEG2000-Amine和5 mL无菌无核酸酶水，充分振荡以完全溶解所有试剂。</li>
	<li>将闪烁瓶置于水浴超声仪中，在室温（RT）下以40 W功率超声处理1小时（20分钟×3次，每20分钟更换一次水以防止过热）。随后在24,000 × g 条件下离心6小时，收集上清液。该功能化SWCNT溶液可在4 °C保存2个月。</li>
	<li>取1.2步骤中的SWCNT溶液1 mL，加入100 kDa分子量截留值（MWCO）的离心过滤装置中，再加入4 mL无菌无核酸酶水。在室温下以4,000 × g 离心10分钟，以去除多余的DSPE-PEG2000-amine。重复加4 mL水并离心，共5次。每次离心后，滤膜上残留的SWCNT溶液将超过0.5 mL。</li>
	<li>最后一次洗涤后，使用紫外/可见光分光光度计在808 nm处测定滤膜中残留SWCNT溶液的浓度。最终浓度通常约为50 mg/L（根据Kam等人建立的方法计算18）。 
	注意：确保在1.4步骤后，DSPE-PEG功能化的SWCNTs具有水溶性，并在数周内于不同生物溶液中保持稳定，无可见聚集现象。</li>
</ol>
2. 将两侧带有2'-O修饰RNA的抗MALAT1间隔序列DNA与功能化单壁碳纳米管（SWCNT）偶联
<ol>
	<li>将 0.5 mg Sulfo-LC-SPDP 加入 450 µL DSPE-PEG2000-胺基功能化的 SWCNT 中。加入 50 µL 10x PBS，然后在室温下孵育 2 小时。</li>
	<li>为去除多余的 Sulfo-LC-SPDP，将步骤 2.1 的反应液加入 100 kDa 截留分子量的离心过滤装置中，随后加入 4 mL 无核酸酶水。在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟。重复加入 4 mL 水及离心操作共 5 次。</li>
	<li>将 200 nM 巯基修饰的 anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA 加入 1.5 mL 商业 DTT 溶液中，在室温下孵育 90 分钟。按照制造商的说明，使用 NAP-5 柱纯化产物。用 500 µL 无菌无核酸酶的 1x PBS 洗脱 anti-MALAT1-Cy3。 
	注意： 功能化 SWCNT 可在添加 DTT 的条件下储存，这可能裂解硫醇化 anti-MALAT1 gapmer DNA 储存期间形成的二硫键。在与 SWCNT 偶联前，可通过 NAP-5 柱去除所添加的 DTT。</li>
	<li>收集滤膜上残留的经 sulfo-LC-SPDP 处理的 DSPE-PEG2000-胺基 SWCNT 溶液，并用 500 µL anti-MALAT1-Cy3 溶液稀释。然后在 4 °C 下孵育 24 小时。偶联产物 SWCNT-anti-MALAT1 可在 4 °C 下保存 3 周。&#160;按照相同步骤，可合成与随机反义寡核苷酸偶联的 SWCNT，作为 SWCNT 对照使用。</li>
</ol>
3. 尾静脉注射 SWCNT-Anti-MALAT1
<ol>
	<li>构建多发性骨髓瘤（MM）弥散性小鼠模型。
	<ol>
		<li>为获得最佳比较效果，将14只8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/J小鼠随机分配至实验组或对照组（每组7只），并保持两组间性别比例一致。</li>
		<li>清洁操作台，并用70%酒精进行消毒。</li>
		<li>使用加热灯对小鼠进行加温，以促进尾静脉显现；使用尾部注射固定器妥善固定小鼠。</li>
		<li>通过尾静脉向小鼠注射50 µL PBS中含5 x 106&#160;MM.1S-Luc-mCherry细胞，无需麻醉。注射后用酒精棉片按压注射部位30秒。标记已注射小鼠，并将其放回清洁的笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在MM.1S细胞注射后的第7天开始治疗。
	<ol>
		<li>通过尾静脉向小鼠注射含SWCNT-anti-MALAT1的PBS溶液50 µL。对照组使用含SWCNT-control的PBS溶液。</li>
		<li>注射后用酒精棉片按压注射部位30秒。</li>
		<li>观察小鼠尾部局部出血情况及整体行为1分钟，随后将其放回清洁笼具中。在将笼具放回动物架之前，再次观察所有注射过的小鼠，以确保其耐受性良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔7天重复注射一次，直至实验终止。
	<ol>
		<li>当小鼠整体健康状况恶化时终止实验：如出现拒食或拒饮、足部苍白、皮下出血、呼吸急促、活动减少、下肢瘫痪和/或腹部可触及肿块等情况时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 疾病进展的评估
<ol>
	<li>在注射 MM.1S-Luc-mCherry 细胞后，每天评估小鼠的一般状态。若小鼠出现下肢瘫痪，需特别关注。</li>
	<li>在注射 SWCNT-anti-MALAT1 前，每周使用活体成像系统评估一次肿瘤生长情况。
	<ol>
		<li>用 1× PBS 配制新鲜的 15 mg/mL D-荧光素酶底物（D-Luciferin）。</li>
		<li>使用异氟烷蒸发器对小鼠进行麻醉（诱导浓度为 3–5%，维持浓度为 1–3%，根据小鼠状态调整）。</li>
		<li>成像前 5 分钟，每只小鼠腹腔注射 150 mg/kg 的 D-Luciferin；随后将小鼠置于俯卧位，使用光谱成像系统进行成像。</li>
		<li>每 2 分钟采集一次小鼠的连续图像，直至荧光信号达到饱和。根据 D-Luciferin 的吸收/信号情况调整采集时间间隔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验终点到达后，使用 CO2 处死小鼠。</li>
	<li>由于本实验为多发性骨髓瘤（MM）弥散模型，按以下步骤处理小鼠。
	<ol>
		<li>解剖前称量小鼠体重。</li>
		<li>从心脏采集外周血，使用血细胞计数仪进行全血细胞计数（CBC）检测。白细胞和红细胞计数以及淋巴细胞比例为主要指标。</li>
		<li>分离脾脏并称重。计算脾脏/体重比值；若比值&#62;0.5%，视为脾脏肿大。</li>
		<li>采集骨髓、脾脏、淋巴结、肾脏以及可见转移病灶的组织。</li>
		<li>若小鼠出现下肢瘫痪，需采集脊柱组织。</li>
		<li>从骨髓样本中提取 RNA 和蛋白质。</li>
		<li>将所有剩余组织用福尔马林固定。</li>
		<li>固定 24 小时后，将骨组织样本浸入 0.25 M EDTA 溶液（pH 8.0）中脱钙 5 天。</li>
		<li>所有样本浸入 75% 乙醇中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较两组小鼠在相同时间点的荧光素酶信号强度。记录两组中每只小鼠的处死日期，并使用软件绘制生存曲线。 
	注意：所有操作步骤总结于图 1中。</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+non-sensitive+and+endocytosis+independent+siRNA+delivery+system%3A+delivery+of+siRNA+into+tumor+cells+and+high+efficiency+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis.</a> Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).</li>
<li>Murakami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-dispersed+single-wall+carbon+nanohorns+as+drug+carriers+for+local+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy.</a> Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).</li>
<li>Kam, N. W., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+intracellular+protein+transporters%3A+generality+and+biological+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).</li>
<li>Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+carbon+nanotubes+via.+cleavable+disulfide+bonds+for+efficient+intracellular+delivery+of+siRNA+and+potent+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).</li>
<li>Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+intracellular+transporters+for+proteins+and+DNA%3A+an+investigation+of+the+uptake+mechanism+and+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).</li>
<li>Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+of+epigenetic+dysregulation+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies.</a> Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).</li>
<li>Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bright+side+of+dark+matter%3A+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).</li>
<li>Ronchetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+lncRNA+transcriptional+fingerprints+characterize+progressive+stages+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma.</a> Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).</li>
<li>Wong, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+a+long+non-coding+RNA+KIAA0495+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma.</a> Molecular Cancer. 14, 175(2015).</li>
<li>Schmidt, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+noncoding+MALAT-1+RNA+indicates+a+poor+prognosis+in+non-small+cell+lung+cancer+and+induces+migration+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth.</a> Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALAT-1%2C+a+novel+noncoding+RNA%2C+and+thymosin+beta4+predict+metastasis+and+survival+in+early-stage+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).</li>
<li>Luo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+genomic+analysis+of+human+hepatocellular+carcinomas+and+hepatoblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas.</a> Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).</li>
<li>Guffanti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+sketch+of+a+primary+human+breast+cancer+by+454+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 163(2009).</li>
<li>Cho, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALAT1+long+non-coding+RNA+is+overexpressed+in+multiple+myeloma+and+may+serve+as+a+marker+to+predict+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression.</a> BMC Cancer. 14, 809(2014).</li>
<li>Handa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+MALAT1+is+an+inducible+stress+response+gene+associated+with+extramedullary+spread+and+poor+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma.</a> British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MALAT1%2FPARP1%2FLIG3+complex+induces+DNA+damage+and+apoptosis+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Lennox, K. A., Behlke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+long+non-coding+RNAs+affects+silencing+by+RNAi+more+than+by+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).</li>
<li>Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+multifunctional+biological+transporters+and+near-infrared+agents+for+selective+cancer+cell+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).</li>
<li>Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+polyethylene+glycol+integrity+in+specific+receptor+targeting+of+carbon+nanotubes+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells.</a> Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).</li>
<li>Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+in+multiple+myeloma%3A+recent+advances+on+the+role+of+DNA+and+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).</li>
<li>Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+theragnostics+for+the+clinical+management+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma.</a> Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).</li>
<li>Amodio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+lncRNA+MALAT1+via.+LNA+gapmeR+ASO+inhibits+gene+expression+of+proteasome+subunits+and+triggers+anti-multiple+myeloma+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Highleyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+fomivirsen%2C+famciclovir%2C+and+Thalidomide.+Food+and+Drug+Administration%5BTitle%5D)+AND+%22BETA%22%5BJournal%5D)">FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration.</a> BETA. 5, (1998).</li>
<li>Smith, R. J., Hiatt, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+drugs+for+homozygous+familial+hypercholesterolemia%3A+managing+benefits+and+risks+in+a+rare+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder.</a> JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).</li>
<li>Aartsma-Rus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Nusinersen+for+Spinal+Muscular+Atrophy+Makes+2016+the+Year+of+Splice+Modulating+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).</li>
<li>Nelson, S. F., Miceli, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28399245">FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy.</a> The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480(2017).</li>
<li>Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+chemistry+on+water-soluble+carbon+nanotubes+for+drug+loading+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery.</a> American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).</li>
<li>Ali-Boucetta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiwalled+carbon+nanotube-doxorubicin+supramolecular+complexes+for+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics.</a> Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).</li>
<li>Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15672140">Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes.</a> Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).</li>
<li>Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single-walled+carbon+nanotube+solubility+by+noncovalent+PEGylation+using+experimental+design+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).</li>
<li>Padilla-Parra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+endosome+acidification+and+single+retrovirus+fusion+with+distinct+pools+of+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).</li>
<li>Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+poly%28histidine%29-PEG%2FDSPE-PEG+co-polymer+micelles+for+cytosolic+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery.</a> Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).</li>
<li>Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+polyion+complex+micelles+for+targeted+intracellular+delivery+of+PEGylated+antisense+oligonucleotides+containing+acid-labile+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages.</a> Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).</li>
<li>Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+polyethylenimine-grafted+graphene+nanoribbon+for+cellular+delivery+of+locked+nucleic+acid+modified+molecular+beacon+for+recognition+of+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA.</a> Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).</li>
<li>Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+reduction+of+disulfide+bonds+in+lysosomes%3A+characterization+of+a+gamma-interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).</li>
<li>Lelimousin, M., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+carbon+nanotube+insertion%3A+pathways+to+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization.</a> Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).</li>
<li>Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+mechanism+and+stability+of+boron+nitride+nanotubes+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers.</a> J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+endocytosis+and+exocytosis+of+single-walled+carbon+nanotubes+in+NIH-3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells.</a> Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cellular+uptake+and+expulsion+of+single-walled+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).</li>
<li>Ruggiero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+glomerular+filtration+of+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）参与调控多种癌症中的生理及病理生理过程，包括多发性骨髓瘤（MM）7,8,9；它们具有作为癌症治疗靶点的潜力，可通过反义寡核苷酸实现靶向干预20,21,22。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准多种反义寡核苷酸药物，包括用于巨细胞病毒性视网膜炎的fomivirsen23、用于纯合子家族性高胆固醇血症的mipomersen24、用于脊髓性肌萎缩症的nusinersen25，以及用于杜氏肌营养不良症的eteplirsen26。在本研究中，...

单壁碳纳米管（SWCNT）是一种新型纳米材料，可在体外1和体内2以理想的耐受性和最低毒性，稳定高效地递送多种类型的药物，如蛋白质、小分子和核酸。经过功能化的SWCNT具有良好的生物相容性和水溶性，可作为小分子的载体，并携带这些分子穿透细胞膜3,4,5。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类从基因组转录为mRNA但不能翻译成蛋白质的RNA分子（&#62;200 nt）。越来越多的证据表明，lncRNA参与基因表达的调控6，并涉及包括多发性骨髓瘤（MM）在内的大多数癌症的起始与进展过程7,8,9。MALAT1是一种核富集型非编码转录本2（NEAT2），属于高度保守的lncRNA10。MALAT1最初在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中被发现11，但随后发现其在多种肿瘤中均呈过表达状态5,12,13；它是表达水平最高的lncRNA之一，并且与MM患者的不良预后相关8,14。在病程危重的髓外多发性骨髓瘤患者中，MALAT1的表达水平显著高于仅诊断为MM的患者15。
在之前的一项研究中，我们已证实，通过在多发性骨髓瘤（MM）细胞中使用靶向MALAT1的缺口型DNA反义寡核苷酸（anti-MALAT1），anti-MALAT1寡核苷酸可显著诱导MM细胞发生DNA损伤和凋亡16。这种缺口型DNA由反义DNA序列组成，两端连接2'-OMe-RNA，一旦与靶标结合，可借助RNase H活性促进MALAT1的降解17。然而，反义寡核苷酸在体内的递送效率仍限制了其临床应用。
为了检测SWCNT递送抗MALAT1间隔寡核苷酸的效果，将抗MALAT1间隔寡核苷酸DNA与DSPE-PEG2000-胺功能化的SWCNT偶联。随后将SWCNT-抗MALAT1通过静脉注射注入多发性骨髓瘤（MM）弥散型小鼠模型；经过四次治疗后，观察到显著的抑制效果。

<table><tbody><tr><td>单壁碳纳米管（SWCNTs）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>704113</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000-胺</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td></td></tr><tr><td>超声水浴仪</td><td>VWR</td><td>97043-992</td><td></td></tr><tr><td>4 mL 离心过滤器</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Z740208-8EA</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>accuSkan GO UV/Vis 微孔板分光光度计</td><td>在 808 nm 处的消光系数为 0.0465 L/mg/cm</td></tr><tr><td>Sulfo-LC-SPDP</td><td>ProteoChem</td><td>c1118</td><td></td></tr><tr><td>DTT 溶液</td><td>Millipore-Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>NAP-5 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>活体成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdcscid/J 小鼠</td><td>Charles River 实验室</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine2000</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>MALAT1-QF：</td><td>由 IDT 公司合成</td><td></td><td>5&amp;rsquo;- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>MALAT1-QR：</td><td>由 IDT 公司合成</td><td></td><td>5&amp;rsquo;- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>GAPDH-QF：</td><td>由 IDT 公司合成</td><td></td><td>5&amp;rsquo;- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>GAPDH-QR：</td><td>由 IDT 公司合成</td><td></td><td>5&amp;rsquo;- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>使用 SYBR Green PCR 主混合液进行定量 PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>抗 MALAT1</td><td>由 IDT 公司合成</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T&lt;br/&gt; *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega Corporation</td><td>G7570</td><td>CellTiter-Glo 发光法细胞活力检测试剂盒</td></tr><tr><td>accuSkan GO UV/Vis 微孔板分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心过滤器</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>SPSS 软件</td><td>IBM</td><td>版本 24.0</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr></tbody></table>

单壁碳纳米管递送 malat1 反义寡核苷酸在体内抑制多发性骨髓瘤细胞生长

Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos

单壁碳纳米管（SWCNT）是一种新型纳米颗粒，已被用于将多种药物递送至细胞内，例如蛋白质、寡核苷酸和合成的小分子药物。SWCNT具有可调控的尺寸、较大的比表面积，并可通过其表面的不同修饰灵活地与药物结合，因此是一种理想的细胞内药物递送系统。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不能翻译为蛋白质，但在生物学和病理生理过程中发挥重要作用。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）是一种高度保守的lncRNA。研究表明，MALAT1表达水平升高与多种癌症的不良预后相关，包括多发性骨髓瘤（MM）。我们已发现MALAT1可调控MM中的DNA修复和细胞死亡过程，因此可将MALAT1视为MM治疗的潜在靶点。然而，如何高效地将反义寡核苷酸递送至体内以抑制或敲低MALAT1表达仍是当前面临的问题。在本研究中，我们使用PEG-2000修饰SWCNT，并将抗MALAT1寡核苷酸偶联至其上，在体外测试该复合物的递送效果，随后将其通过静脉注射给予弥散性MM小鼠模型，观察到MM进展显著受到抑制，表明SWCNT是递送抗MALAT1缺口寡核苷酸DNA的理想载体。

为了验证抗MALAT1间隔DNA在多发性骨髓瘤（MM）中的抑制作用，我们敲低了MALAT1的表达，并将其应用于H929和MM.1S细胞。48小时后，收集细胞以分析转染抗MALAT1间隔DNA或对照DNA后的敲低效率及细胞凋亡状态。qRT-PCR结果显示，抗MALAT1间隔DNA能有效降低H929和MM.1S细胞中MALAT1的表达水平（图2A）。通过流式细胞术检测细胞凋亡状态，结果表明MALAT1表达下调可显著诱导细胞凋亡（图2B）。
这些结果表明，抗MALAT1寡核苷酸在体外可有效抑制多发性骨髓瘤（MM）。然而，抗MALAT1寡核苷酸在体内仍需开发一种高效的递送方法或载体，这也是反义寡核苷酸在临床应用中的主要障碍；因此我们关注单壁碳纳米管（SWCNT）。SWCNT是...

本文描述了一种单壁碳纳米管（SWCNT）偶联的MALAT1反义间隔子DNA寡核苷酸（SWCNT-anti-MALAT1）的合成方法，该复合物在体外和体内均表现出可靠的SWCNT递送效果以及anti-MALAT1的显著治疗作用。文中详细介绍了SWCNT-anti-MALAT1的合成、修饰、偶联及注射所采用的方法。

单壁碳纳米管递送 MALAT1 反义寡核苷酸在体内抑制多发性骨髓瘤细胞生长

单壁碳纳米管（SWCNT）是一种新型纳米颗粒，已被用于将多种药物递送至细胞内，例如……

我们在此使用的方法可用于将寡核苷酸与单壁碳纳米管进行包装，后者是一种用于药物递送的新型纳米颗粒。该技术的主要优势在于能够更高效地将寡核苷酸药物递送至体内细胞。该技术的应用意义延伸至多发性骨髓瘤的研究，因为它引入了纳米颗粒以改善寡核苷酸药物的递送效果。通过该方法可为多发性骨髓瘤的治疗提供思路。该方法也可应用于其他疾病，并可与其他载荷（如蛋白质和小分子）偶联。首先，将一毫克单壁碳纳米管、五毫克DSPE-PEG 2000 胺以及五毫升无菌无核酸酶水加入一个20毫升的玻璃闪烁瓶中混合。将样品管置于水浴超声仪中，在90瓦功率下于室温超声处理一小时。超声处理后，在24,000 ×g离心六小时，然后收集上清液。将1毫升单壁碳纳米管溶液加入100千道尔顿分子量截断的离心过滤装置中，随后加入4毫升无菌无核酸酶水。在室温下以4,000 × g离心10分钟，以去除过量的胺。将0.5毫克Sulfo-LC-SPDP加入450微升胺功能化的单壁碳纳米管中。然后加入 50 µL 的 10x PBS，室温孵育 2 小时。接着将反应混合物加入 100 kDa 分子量截留的离心过滤装置中，再加入 4 mL 无核酸酶水。在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟，以去除过量的 Sulfo-LC-SPDP。收集滤膜中剩余的经 Sulfo-LC-SPDP 处理的氨基单壁碳纳米管溶液，并用 500 微升预先配制的抗 MALAT1-Cy3 溶液稀释。然后将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。为获得最佳比较效果，将 14 只小鼠随机分为实验组和对照组，每组各 7 只，且每组中雄性和雌性比例相同。接下来，清洁操作台并用70%乙醇消毒。使用加热灯加热其中一只小鼠，以帮助尾静脉显现。使用尾静脉注射固定器正确固定小鼠。通过尾静脉注射50 µL PBS中的MM.1S-luc/mCherry细胞。用酒精棉片按压注射部位30秒。然后标记已注射的小鼠，并将其放回清洁的笼子中。在第7天，MM1S细胞注射后，向小鼠尾静脉注射50微升含有单壁碳纳米管抗MALAT1的PBS溶液。然后用酒精棉片按压注射部位30秒。观察尾部局部出血情况及小鼠的一般行为1分钟，随后将其放回清洁的笼子中。在将鼠笼放回架台之前，再次观察所有注射后的小鼠，以确保注射耐受良好。解剖前称量每只小鼠的体重。从心脏采集外周血，用于血细胞计数仪进行全血细胞计数检测。接下来，采集骨髓、脾脏、淋巴结、肾脏以及可见转移病灶的组织。从骨髓样本中提取RNA和蛋白质。将所有剩余组织用甲醛固定。固定24小时后，将骨样本浸入0.5摩尔的EDTA溶液中脱钙5天。然后将所有样本浸入75%乙醇中长期保存。qRT-PCR结果表明，抗MALAT1 gapmeR DNA在H929和MM.1S细胞中显著降低了MALAT1的表达并诱导了细胞凋亡。将单壁碳纳米管抗MALAT1-Cy3递送至多发性骨髓瘤细胞的细胞核内，显著抑制了H929和MM.1S细胞中内源性MALAT1的表达水平。在不同剂量和时间点，经单壁碳纳米管抗MALAT1-Cy3或对照处理后，BMEC-1细胞的活力无显著差异。这表明，即使在高剂量下，单壁碳纳米管抗MALAT1-Cy3对正常细胞的毒性有限且可接受。建立人多发性骨髓瘤（MM）弥散性小鼠模型，以评估单壁碳纳米管抗MALAT1在体内的治疗效果。经21天治疗后，单壁碳纳米管抗MALAT1治疗组小鼠的荧光素酶信号显著低于对照组。根据这些结果可得出结论：通过静脉注射单壁碳纳米管抗MALAT1能够有效地将抗MALAT1寡核苷酸递送至肿瘤细胞。未观察到治疗相关的显著副作用，表明单壁碳纳米管-抗MALAT1注射对小鼠是一种安全的治疗方法。在实施该操作时，需注意细胞分子组成会影响寡核苷酸药物的递送、效率及治疗效果。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如蛋白质或小分子的偶联，以回答更多科学问题。类似于使用单壁碳纳米管递送其他药物。

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癌症研究

单壁碳纳米管 (sscnt) (mallat1 反义寡 3号) 抑制多骨髓瘤细胞在体内的生长

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建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

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在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.

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本研究描述了一种基于泊马度胺的双功能同源PROTAC分子的合成与表征，该分子作为一种新策略，可诱导E3泛素连接酶cereblon（CRBN）——沙利度胺类似物的作用靶点——发生泛素化并降解。...

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了解利用单壁碳纳米管递送反义寡核苷酸治疗多发性骨髓瘤的方法。该技术通过SWCNT-anti-MALAT1偶联物实现高效体内药物递送，为核酸药物开发提供新策略。

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