测量与解读完整果蝇头部组织的耗氧率

该方法有助于回答代谢研究领域中的关键问题，例如，在衰老过程中代谢活性如何发生变化。该技术的主要优势在于使用完整的身体节段，其数据与传统的线粒体分离方法相比，更接近自然生理状态。本实验操作将由我实验室的研究生Anuroop和Annika进行演示。

开始实验前，提前一小时打开仪器，以确保有充足的时间达到设定温度并保持稳定。然后，在软件设置的管理模式下，选择色谱柱校准的长度和所需的温度。接着，输入以下程序：根据实验设计，在选定的测量步骤之后，从 A 到 D 端口添加进样步骤。

为检测质量并确定基础耗氧率（OCR），在通过A孔注入第一种药物之前，应至少进行三个测量循环以优化实验方案。测试前一日或至少提前四小时对传感器 cartridge 进行预校准，在每个孔中加入1.0毫升校准液，并将传感器 cartridge 置于培养板上方。若计划水化超过24小时，需用Parafilm封膜覆盖 cartridge 以防止蒸发。将 cartridge 置于37摄氏度、无CO2环境中过夜孵育。

接下来，确保实验药物充分溶解于新鲜培养基中，并加入2.5%葡萄糖。在目标温度下测量并调节药物溶液的pH值，使其与对照溶剂的pH值一致。将药物溶液用移液器加入指定的注射端口。

然后将 cartridge 装入仪器并开始校准。用 1 N HCl 将新配制的培养基（含 2.5% 葡萄糖）调节至所需 pH 值。接着准备一个冰盒，并将金属板放在冰上。

打开眼孔板包装。将网置于16毫米的培养皿中浸入培养基。用植入器收集一张网，并将植入器竖立放置在显微镜旁。

在插入器上附着的滤网上添加一滴少量培养基。随后，将果蝇置于冰冷的金属板上以进行麻醉。使用镊子夹住果蝇的腹部，并在显微镜下将其浸入培养皿中的培养基内。

使用另一把镊子，轻轻取下果蝇的头部。将头部置于固定在插入器上的网膜中央，并确认头部已浸入培养液中。在将头部居中之前，去除多余的液体，以避免放置于孔中时丢失样本。

当网片上有16个头时，将其居中。使用植入器将网片放入孔板中。确保头部被网片压住，然后缓慢加入700 µL培养基和2.5%葡萄糖。

确保用于背景检测的空孔中也含有一个网，网中加入700微升缓冲液和2.5%葡萄糖。通过显微镜检查网下方的孔中是否存在气泡。使用1毫升移液器轻轻吹打，以去除任何气泡。

保持微孔板居中，以确保光学字符识别（OCR）读取的可靠性。然后将微孔板放入仪器中并开始测量。在程序结束时，取出卡盒。

目视确认端口填充物中无可见残留物。接下来，如果磁头不用于蛋白质提取，则丢弃 cartridge 和板。请务必检查氧气和 pH 水平，以便在分析前检测是否存在任何异常的孔。

此外，根据氧浓度水平选择合适的耗氧率计算方法非常重要。在执行该方案时观察到，中年果蝇头部的氧浓度下降速度比年轻果蝇头部更快。当不同条件之间的氧浓度变化范围相似时，最好使用AKOS算法自动计算耗氧率（OCR），该方法能够可靠地反映年轻与中年果蝇头部在测量过程中氧浓度变化的差异。

添加丁酸钠（SB），一种KDAC抑制剂，会短暂改变氧水平的动态变化。在对照组中，第一和最后一个检测点的氧水平保持稳定；而加入SB后，这两个检测点的氧水平出现显著但短暂的下降。由于AKOS计算方法考虑了所有检测点并忽略缺氧状态，因此会产生误导性的耗氧率（OCR）结果，这在未归一化的基于AKOS的OCR水平中可见：在A孔注射后，OCR几乎无变化。而固定算法更准确地模拟和反映了OCR及氧水平的变化，在SB处理后显示出OCR的增加。

进行此操作时，重要的是要两人协作，以确保单个培养板的制备时间相对较短。完成此步骤后，可进一步采用其他生物化学方法，如蛋白质印迹（Western Blot）和质谱分析，以探究与分子机制相关的问题，例如调控代谢改变的机制。