光漂白可实现对聚球藻Prochlorococcus中FtsZ环的超分辨率成像

该方法有助于解答关于光合生物中蛋白质定位及其动态变化的关键问题。通过将光漂白方法与超分辨率显微镜相结合，我们能够以极高的细节水平检测光合生物中蛋白质的动态行为。该方法不仅为集胞藻（Prochlorococcus）的蛋白质动态研究提供了深入见解。

该方法还可应用于其他多种含有放射性重掺杂和细菌叶绿素的生物体。演示本实验步骤的是我实验室的研究生 Yanxin Liu。首先，向培养瓶中加入 5 毫升海水型 Pro99 培养基，并接种 1 毫升的集胞藻 MED4（Prochlorococcus MED4）。

在光照强度为35微摩尔光子每平方米的条件下，将集胞藻（Prochlorococcus）于23摄氏度培养五天。随后，取一毫升培养物加入1.5毫升离心管中。向管中加入100微升新配制的甲醛溶液，以固定培养物。

室温避光孵育20分钟。然后以13,500 × g离心1分钟。弃上清，将细胞重悬于100 µL Pro99培养基中。

将样品置于 4°C 避光保存，直至准备进行免疫染色。首先，涡旋混匀聚苯乙烯微球小瓶。使用 50% 乙醇制备 1:20,000 稀释度的工作悬浮液。

打开电热板并将温度设置为 120 摄氏度。接着，将盖玻片放置在电热板上。在每张盖玻片上加入 100 微升工作悬浮液，并在电热板上孵育 10 分钟。

然后小心地将盖玻片转移至培养皿中，确保珠面朝上，并在室温下保存。当准备包被盖玻片时，取出一个盖玻片，确保其珠面朝上。在盖玻片中央加入 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的多聚-L-赖氨酸溶液，在室温下静置 30 分钟。

此后，使用移液器小心吸除未结合的多聚-L-赖氨酸，并将其转移至一个 1.5 毫升离心管中。将该多聚-L-赖氨酸于 4 摄氏度保存，以备后续使用。在 60 毫米培养皿中用 10 毫升超滤水冲洗盖玻片，然后用纸巾短暂吸干。

将包被的盖玻片转移至一个新的底部铺有Parafilm的培养皿中，该培养皿将用作染色皿。在盖玻片上加入100 µL固定后的样品，静置30分钟，以使细胞贴附。接着，用纸巾吸去残留液体，然后将盖玻片转移至12孔板中的一个孔内进行洗涤。

加入 1 毫升 PBS 缓冲液至孔中，以洗涤盖玻片。随后吸除 PBS，并加入 1 毫升新鲜 PBS 对盖玻片进行第二次洗涤。使用移液器吸去 PBS，再加入 1 毫升 freshly prepared permeabilization buffer（透化缓冲液）进行替换。

将洗涤皿在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。然后移除通透化缓冲液。通过加入一毫升新鲜 PBS 缓冲液开始洗涤过程。

将清洗皿置于摇床上，轻轻振荡5分钟。随后吸除PBS，并重复清洗步骤三次。将清洗后的盖玻片转移至染色皿中。

在盖玻片上加入 50 微升封闭缓冲液。将整个染色皿置于冰上，然后移至氙灯光源下进行光漂白，至少持续 60 分钟。光漂白和封闭结束后，用纸巾边缘吸除封闭缓冲液。

首先，将一微升抗 FtsZ 抗体加入 99 微升封闭缓冲液中稀释。取 50 微升稀释后的一抗溶液滴加到盖玻片上，室温孵育 30 分钟。将盖玻片转移至洗涤板的孔中。

开始洗涤时，加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将洗涤皿置于摇床，轻轻振荡五分钟。吸除PBS，并重复整个洗涤过程三次。

接下来，将盖玻片转移至染色皿中。在盖玻片上加入50 µL稀释后的二抗，避光、室温孵育30分钟。然后将盖玻片重新转移回洗涤皿中。

开始洗涤时，加入一毫升 PBS。用铝箔纸包裹洗涤皿，以避免光照。将培养板转移至摇床，轻轻振荡五分钟。

移除 PBS，并重复整个洗涤过程三次。在进行 STORM 成像前，立即按照文本方案制备一毫升成像缓冲液。将盖玻片装入加载室中。

加入新配制的成像缓冲液，操作要轻柔，避免冲走蓝藻细胞。随后，在成像缓冲液上放置一块矩形盖玻片，以防止其与空气中的氧气发生反应。打开相机、LED 光源和激光器，并启动 STORM 软件。

在物镜上添加半滴浸油。加载样品腔室，确保物镜与盖玻片接触。使用750纳米激光检测信号。

选择一个包含细胞和标记物的样本区域。然后启动样本漂移校正软件。使用相机电子倍增增益为300、曝光时间为30毫秒的条件，采集一幅宽场图像作为参考图像。

将750纳米激发激光强度增加至约4.5千瓦每平方厘米。当荧光染料转变为稀疏闪烁模式后，以33赫兹采集10,000帧图像，获取一幅超分辨率图像。随后根据文本方案中所述步骤，从原始数据重建超分辨率图像。

本研究中，STORM 通过随机激活单个光可切换荧光染料实现超分辨率成像。记录每个荧光染料的位置，并基于这些位置构建超分辨率图像。尽管原绿球藻的吸收光谱在 447 和 680 纳米处达到峰值，且在 700 纳米以上吸收最低，但当暴露于 STORM 成像所需的高强度 750 纳米激光时，原绿球藻 MED4 细胞仍会发出强烈的自发荧光。

使用此处所述的光漂白方法处理30分钟后，细胞的自发荧光明显减弱，尽管仍可检测到部分具有自发荧光的细胞。将光漂白时间延长至60分钟，大多数细胞的自发荧光均消失。这些结果表明，所开发的光漂白方法能够显著降低光合生物的自发荧光。

光漂白后，采用STORM技术对细胞中的细胞分裂蛋白FtsZ进行可视化观察。利用STORM技术，可揭示FtsZ环的精细形态。通过对3D STORM图像进行旋转观察，共鉴定出四种不同形态：簇状结构、不完整环、完整环以及双环结构。

需要注意的是，不同生物体的光漂白光照强度和持续时间可能有所不同。该方法建立后，将为希望深入研究光合细胞中蛋白质组织结构及其潜在功能的研究人员提供重要途径。