Name: 转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解循环微RNA检测方法在转移性结直肠癌患者血浆样本中的应用。该技术使用24种miRNA自定义面板进行分析，可为治疗决策和预后评估提供可靠的生物标志物信息。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究部分由罗氏制药有限公司（Roche S.p.A.）和意大利药品管理局（AIFA）资助。

注意：所有以下步骤均须在符合优良实验室规范（GLP）的无菌通风橱中进行。
1. 血浆采集与保存
<ol>
	<li>在K3E EDTA管中采集3 mL外周血样本。</li>
	<li>在室温下以1,880 × g离心15分钟。</li>
	<li>将上清液血浆分装为每份450 µL。</li>
	<li>将样本储存于-80 °C直至使用。 
	注意：采集后2小时内处理外周血样本。收集血浆时，避免扰动淋巴细胞层。</li>
</ol>
2. 从血浆样本中提取循环miRNA（材料表）
<ol>
	<li>准备提取步骤所需的所有溶液，并将样品解冻。
	<ol>
		<li>向2倍变性溶液中加入375 µL的2-巯基乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>向miRNA洗涤溶液I中加入21 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>向洗涤溶液2/3中加入40 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>将一份血浆样品在室温下解冻，随后开始提取步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有机提取
	<ol>
		<li>将400 µL血浆样品转移至无RNase的2 mL离心管中。</li>
		<li>加入400 µL 2倍变性溶液，涡旋混匀后短暂离心。</li>
		<li>加入4 µL 1 nM的外参 spike-in，涡旋混匀后短暂离心。</li>
		<li>加入800 µL酸性酚-氯仿溶液。</li>
		<li>涡旋振荡60秒，然后以最大速度（≥10,000 × g）离心15分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至新离心管中，注意不要扰动中间相。记录回收体积，并丢弃含有非水相的离心管。 
		注意：2倍变性溶液储存于4 °C，可能在此温度下发生凝固。使用前需将其在37 °C水浴中加热10–15分钟，期间偶尔摇动使其溶解。吸取下层含酸性酚-氯仿的相时需小心，避免吸取位于混合物上层的水相缓冲液。将洗脱液或无核酸酶水预热至95 °C。注意加热足够体积的溶液（每份样品100 µL + 10%过量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小RNA富集
	<ol>
		<li>向第2.2.6步所得水相中加入1/3体积的100%乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>为每个样品将一个滤芯放入新的收集管中。</li>
		<li>将最多700 µL第2.3.1步的裂解液与乙醇混合物转移至滤芯中，于10,000 × g离心30秒。</li>
		<li>若剩余混合物体积&#62;700 µL，将滤过液转移至新离心管中，并重复第2.3.3步；重复操作直至全部混合物通过滤芯。</li>
		<li>测量滤过液的总体积。</li>
		<li>向滤过液中加入2/3体积的100%乙醇，并充分混匀。</li>
		<li>将第二个滤芯放入新的收集管中。</li>
		<li>将最多700 µL样品体积转移至滤芯中，于10,000 × g离心30秒，弃去滤过液。</li>
		<li>重复第2.3.8步，直至全部混合物通过滤芯。</li>
		<li>向滤芯中加入700 µL miRNA洗涤溶液1，将滤芯与收集管一起于10,000 × g离心15秒，弃去滤过液。将滤芯放回同一收集管中。</li>
		<li>向滤芯中加入500 µL洗涤溶液2/3，将滤芯与收集管一起于10,000 × g离心15秒，弃去滤过液。将滤芯转移至新的收集管中。</li>
		<li>将滤芯放入新的收集管中，用500 µL洗涤溶液2/3重复第2.3.11步。弃去滤过液，并将滤芯转移至另一新的收集管中。</li>
		<li>将装有滤芯的收集管于10,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将滤芯转移至新的1.5 mL收集管中，加入100 µL预热（95 °C）的洗脱液或无核酸酶水。</li>
		<li>于10,000 × g离心30秒以回收miRNA，并于-80 °C保存。 
		注意：洗涤溶液2/3中可能出现白色沉淀，此为溶液中析出的过量EDTA。在移液操作中应避免吸入这些晶体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 进行逆转录和miRNA预扩增（材料表）
<ol>
	<li>进行多聚腺苷酸化反应
	<ol>
		<li>将所有试剂在冰上解冻，短暂涡旋并离心，使管内物质沉至管底。同时将50% PEG 8000解冻至室温。</li>
		<li>在0.5 mL离心管中配制反应体系，每份样品最终反应体积为3 µL。各试剂用量应额外增加10%的过量体积。</li>
		<li>加入1.7 µL无RNase水、0.5 µL 10x Poly(A)缓冲液、0.5 µL 10 mM ATP，最后加入0.3 µL 5 U/µL PolyA酶。</li>
		<li>短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。</li>
		<li>将2 µL样品转移至反应板或反应管的每个孔中，加入3 µL反应混合物。短暂涡旋并离心，使管内物质沉至管底。</li>
		<li>将反应板或反应管放入热循环仪中，执行以下步骤。</li>
		<li>在37 °C孵育45分钟（多聚腺苷酸化步骤）。</li>
		<li>在65 °C孵育10分钟（终止反应），随后在4 °C保持。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行连接反应。
	<ol>
		<li>在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。</li>
		<li>加入0.4 µL无RNase水、3 µL 5x DNA连接酶缓冲液、0.6 µL 25x连接接头、4.5 µL 50% PEG 8000，最后加入1.5 µL RNA连接酶。</li>
		<li>短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。</li>
		<li>向每孔或反应管中含有多聚(A)尾产物的样品中加入10 µL混合液。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。</li>
		<li>将反应板或反应管放入热循环仪，设置如下程序：在60 °C孵育60分钟，随后在4 °C保持。 
		注意：50% PEG 8000黏度较高，使用时应保持室温，吸液和排液需缓慢进行。每次吸液和排液后，保持移液器活塞按压状态10秒，以使试剂充分上下流动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行逆转录反应。
	<ol>
		<li>在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。</li>
		<li>加入3.3 µL无RNase水、6 µL 5x RT缓冲液、1.2 µL dNTP混合液（各25 mM）、1.5 µL 20x通用RT引物，最后加入3 µL 10x RT酶混合液。</li>
		<li>短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。</li>
		<li>向每孔或反应管中含连接产物的样品中加入15 µL混合液。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。</li>
		<li>将反应板或反应管放入热循环仪，设置如下程序。</li>
		<li>在42 °C孵育15分钟（逆转录）。</li>
		<li>在85 °C孵育5分钟（终止反应），随后在4 °C保持。 
		注意：逆转录产物现可于-20 °C保存，可稳定保存长达2个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行miR-Amp反应（见材料表）。
	<ol>
		<li>在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。</li>
		<li>加入17.5 µL无RNase水、25 µL 2x miR-Amp预混液，以及2.5 µL 20x miR-Amp引物混合液。</li>
		<li>短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。</li>
		<li>每份样品中，将45 µL反应混合物转移至新的反应板或反应管的每个孔中。向每孔或反应管中加入5 µL逆转录产物。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。</li>
		<li>将反应板或反应管放入热循环仪，按表1所示程序运行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 进行实时荧光定量 PCR
<ol>
	<li>用0.1x TE缓冲液将每个cDNA样品稀释1:10。</li>
	<li>计算每个样品所需的孔数/重复数。在离心管中配制反应体系，每个样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。</li>
	<li>加入4 µL无RNase的水、10 µL 2x快速高级预混液（材料表），最后加入5 µL稀释后的cDNA。</li>
	<li>涡旋混匀，短暂离心以收集管壁液体。</li>
	<li>将19 µL反应体系转移至每个孔中，密封反应板并短暂离心。</li>
	<li>在RT-PCR系统上运行热循环程序（表2）。</li>
</ol>

<ol><li>Luo, H. -Y., Xu, R. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li>
<li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li>
<li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li>
<li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li>
<li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer%3A+Analysis+and+verification+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+laboratory%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li>
<li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430(2015).</li>
<li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+%28REMARK%29%3A+explanation+and+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li>
<li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li>
<li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443(2014).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

miRNA是一类小分子非编码RNA（长度为18-25个核苷酸），能够与其靶标信使RNA的3'非翻译区（3' UTR）结合，从而抑制和/或降解该mRNA。因此，miRNA可被视为在翻译水平上调控基因表达的因子。在过去十年中，多种miRNA被发现与肿瘤的发生和发展相关，使其成为用于诊断、预后评估和治疗的潜在临床生物标志物。由于受到核糖核酸酶（RNase）的保护，miRNA在血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物体液中以稳定的形式存在，这使其在临床实践中的应用潜力日益受到关注10。
尽管如此，循环miRNA的评估仍是一项具有挑战性的工作，有关样本采集、靶标提取、平台选择以及全局标准化等方面的问题在科学界仍存在广泛争议。
在样本采集与储存过程中，分析前变量与血浆的处理和制备密切相关。我们选择血浆而非血清样本，因为已有充分证据表明后者中miRNA浓度更高，这可能是由于凝血过程中这些分子的释放所致10,<sup class="...

结直肠癌（CRC）是全球范围内第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因。迄今为止，已批准贝伐珠单抗（B）——一种靶向血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，以及西妥昔单抗（C）或帕尼单抗（P）——两种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体，与化疗（CT）方案联合用于一线治疗。
K-RAS 和 N-RAS 基因的突变是目前唯一具有临床实用性的生物标志物，可用于识别那些最不可能从抗EGFR为基础的化疗（CT）中获益的患者。尽管已有若干研究致力于寻找可预测患者对B为基础的化疗（CT）反应的生物标志物，但在临床实践中仍严重缺乏可靠且有效的药物1。
miRNA 是一类小分子 RNA（长度为 18-25 个核苷酸），可调控靶基因的翻译，在包括胚胎发生和癌变在内的多种生理病理过程中发挥关键作用。这些分子在血浆/血清、尿液和痰液等生物体液中具有高度稳定性，因此可作为非侵入性取样的可靠生物标志物2。通过采用一组参与血管生成通路的 miRNA，我们旨在鉴定新的循环生物标志物，以预测接受以 B 为基础的化疗方案治疗的转移性结直肠癌（mCRC）患者的临床结局。
我们分析了在一项前瞻性多中心随机Ⅲ期临床试验中接受基于B的化疗的52例mCRC患者 &#34;晚期结直肠癌意大利临床试验&#34; （ITACa）。本方案已获得当地伦理委员会（Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori（IRST）IRCCS，编号674）于19日批准th 2007年9月。所有患者在采集血样前均签署知情同意书。对每位患者，在治疗前及首次临床评估时（治疗8周后）采集静脉血样本，以评估基线miRNA表达水平及其在治疗期间的调控变化，并分析其与患者临床转归的关系。
通过文献检索，我们筛选出21种与血管生成过程相关且已知可在人血浆中检测到的miRNA：hsa-miR-107、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-17-5p和hsa-miR-155-5p。此外，我们选择hsa-miR-223-3p和hsa-mir-484用于内源性标准化3,4,5,6，并选用来自C. elegans的cel-miR-39作为外源性标准化的加标对照。所有数据标准化均采用2 ̂ ̄(ΔΔCt)法进行。
循环miRNA的检测存在一定的技术难点，因为这些分子在血浆中的含量极低，且由于其序列较短，扩增过程在化学上具有挑战性。基于这些原因，我们选择了一种结合苯酚有机提取与玻璃纤维柱纯化技术的方法。循环miRNA的提取是液体活检领域的一个研究热点，我们选用了一款商业试剂盒，该试剂盒在回收得率的数量和质量方面已被证明是目前最可靠的方法之一7,8。我们采用了一种在成熟miRNA的5'端添加接头、3'端添加poly(A)尾的逆转录方案，以提高反应的选择性和特异性。
鉴于该方法的稳健性，我们设计了带有预点样探针的定制板，用于RT-PCR，以对每个样本进行双份检测，并在每块板中分析2名患者，如图1所示。

<table><tbody><tr><td>无RNase安全锁1.5 mL离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>无RNase安全锁2 mL离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 20 &amp;micro;L吸头</td><td>Starlab</td><td>S1123-1810</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 200 &amp;micro;L吸头</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 1,000 &amp;micro;L吸头</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>mirVana PARIS RNA与天然蛋白纯化试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>A28007</td><td></td></tr><tr><td>100%无水乙醇（ACS级）</td><td>Carlo Erba Reagents</td><td>414605</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced预混液</td><td>Thermo Fisher</td><td>4444558</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA检测引物探针组</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>7500实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>0.2–2、1–10、2–20、20–200、100–1,000 &amp;micro;L移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式加热模块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

转移性结直肠癌患者循环microrna定制 panel 的检测

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

人们对液体活检在癌症诊断、预后评估及治疗监测中的应用兴趣日益增加，这促使临床实践中需要可靠且具有实用价值的生物标志物。本文介绍了一种从结直肠癌（CRC）患者血浆样本中提取、逆转录并检测循环miRNA表达水平的实验方案。microRNA（miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的非编码RNA，可在翻译水平调控靶基因的表达，在多种器官的生理病理过程中发挥重要作用，包括促血管生成和抗血管生成功能。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为理想的循环生物标志物，可用于癌症的诊断、预后判断以及治疗决策与疗效监测。循环miRNA的提取采用了一种快速且高效的方法，结合了有机溶剂法和柱式法。对于miRNA的逆转录，我们采用了一种多步骤流程，包括在成熟miRNA的3'端进行多聚腺苷酸化、5'端连接接头，随后进行随机miRNA预扩增。我们选用了一个包含24种miRNA的定制面板，通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行检测，并将miRNA探针点样于定制的阵列板上。qRT-PCR反应在实时PCR系统上运行。使用GeNorm软件（v. 3.2）筛选用于数据归一化的看家miRNA。数据采用Expression Suite软件（v 1.1）进行分析，并进行了统计学处理。该方法具有良好的可靠性与技术稳健性，可用于血浆和/或血清等液体样本中生物标志物水平的评估。

我们分析了一组与血管生成相关的循环miRNA，探讨其与52例接受B为基础的化疗（B-based CT）治疗的转移性结直肠癌（mCRC）患者无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）及客观缓解率（ORR）之间的关系。由于技术上的困难，对血浆样本中此类生物标志物的评估具有挑战性。我们采用了已建立的方法，从患者血浆样本中提取miRNA，并进行逆转录和预扩增。根据制造商的说明，仅需少量修改（特别是在提取步骤中），我们成功地在患者群体中检测到了所有目标miRNA（图 2）。
具体而言，我们分析了每位患者 2 个血浆样本，将基线水平和治疗后改变的 miRNA 表达与患者的临床结局相关联。
我们在800 µL血浆样本（400 µL血浆加400 µL 2倍变性溶液）中对cel-miR-39进行了一系列稀释，浓度分别为...

我们介绍了一种用于评估癌症患者血浆样本中循环微小RNA（miRNA）表达水平的实验方案。具体而言，我们采用了一种市售的试剂盒进行循环miRNA的提取和逆转录。最后，利用实时荧光定量PCR预点样探针定制板，对24种选定的miRNA进行了检测分析。

转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

人们对液体活检在癌症诊断、预后评估及治疗监测中的应用日益关注，由此产生了对可靠且实用的……的需求

该方法有助于回答转化研究领域中的关键问题，例如循环生物标志物与患者预后之间的关系。该技术的主要优势在于能够利用少量输入材料，通过简便且可靠的实验方法，检测一组循环生物标志物的表达水平。该技术的应用前景广泛，尤其在癌症患者的治疗方面，因为它可能识别出对临床决策和治疗监测具有重要意义的循环生物标志物。此外，该方法可为循环生物标志物分析提供参考，也可应用于其他系统，例如用于疾病分子特征分析的组织生物标志物表达分析。由于提取步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。首先，将400微升血浆样本转移至一个无RNase的2毫升离心管中。然后，向管中加入400微升变性液。再加入4微升1纳摩尔的外源添加物（spike-in）。混合溶液后，加入800 µL酸性酚-氯仿溶液。涡旋振荡溶液60秒，然后以最大速度离心15分钟。接着，将上层水相中的裂解液小心转移至新的洁净离心管中，注意不要扰动中间相。测量回收的水相体积，并向裂解液中加入1/3体积的乙醇。然后，将过滤柱放入新的收集管中。将最多700 µL的乙醇-裂解液混合物转移至过滤柱中。将滤 cartridge 在 10,000 ×g 条件下离心 30 秒。接着，测量流穿液的总体积。然后，向滤液中加入等体积 2/3 的乙醇，并充分混匀。将第二个滤芯放入新的收集管中。然后，转移最多700微升样品至滤芯中，在10,000 × g条件下离心30秒，弃去滤过液。向滤芯中加入700微升microRNA洗涤液，将滤芯与收集管一起在10,000 × g条件下离心15秒。弃去穿流液，将滤芯放回原来的离心管中。随后，将滤芯转移至新的收集管中。然后，向滤芯中加入100 µL预热的洗脱液。以10,000 × g离心过滤柱30秒，以回收microRNA。根据文本方案配制多聚腺苷酸化反应混合液。将2 µL样品转移至反应板的每个孔中。然后，向每个孔中加入三微升反应混合液。充分涡旋震荡并短暂离心酶标板，使孔内液体沉降至底部。接着，将酶标板放入热循环仪中，并按照文本方案中所述步骤进行操作。在离心管中配制连接反应混合液。然后，向反应板的每个孔中加入10微升该混合液。接着，将反应板置于摇床上，以1,900 rpm振荡1分钟，随后对反应板进行短暂离心。此后，将反应板放入热循环仪中，并按照文本方案中所述的步骤进行操作。为进行逆转录反应，根据文本方案在离心管中配制反应混合液。然后，向含有连接产物的各孔中加入15 µL该混合液。将培养板中的内容物在摇床中以1,900 rpm振荡混合1分钟，随后对培养板进行短暂离心。接着，将培养板放入热循环仪中，按照文本方案中所述步骤进行操作。然后，配制miR-Amp反应混合液，并向新的反应板的每个孔中加入45 µL该混合液。此后，将 5 µL 反转录产物加入反应板的每个孔中。在振荡器上以 1,900 rpm 混匀反应板 1 分钟，随后短暂离心。然后将反应板放入热循环仪中，并按照文本方案中表一列出的程序进行操作。首先，用TE缓冲液稀释每个cDNA样品。然后，在离心管中配制PCR反应混合液，额外加入总体积10%的过量试剂。将19微升反应混合液转移至板的每个孔中。密封反应板，并短暂离心。最后，按照文本方案中表二所述，在RT-PCR系统上执行热循环程序。进行外源性对照的系列稀释，以确定在此特定病例系列的所有血浆样本中添加的最佳浓度。通过该方案，可对每位患者的所有生物标志物以及整个病例系列中单一生物标志物进行评估。在本方案中，分析了接受化疗方案治疗的结直肠癌患者中一组与血管生成相关的循环miRNA，及其与无进展生存期、总生存期和客观缓解率的关系。比较基线水平与首次临床评估时的miRNA表达水平，发现hsa-miR-155-5p表达升高。该升高与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关。在进行该操作时，需注意在通风橱内使用苯酚-氯仿进行步骤操作。完成本方案后，可进一步采用其他方法，如分离和分析循环蛋白或编码RNA，以回答更多科学问题，例如对更全面的循环生物标志物组合进行评估。该技术问世后，为液体活检领域的研究人员探索癌症患者循环生物标志物的表达铺平了道路。请务必注意，操作血液和化学试剂可能具有极高危险性，在进行该实验时，应始终采取佩戴手套和穿着实验服等防护措施。

detection-circulating-microrna-custom-panel-patients-with-metastatic

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测

本视频介绍了使用有机提取法结合玻璃纤维柱富集技术，从结直肠癌患者血浆样本中提取循环microRNA的方法。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为癌症诊断、预后评估以及治疗决策与监测的理想循环生物标志物。该方法将有助于发现能够预测患者临床结局的新型循环生物标志物。...

循环miRNA提取：通过有机提取和小RNA富集从血浆样本中分离miRNA的方法

本方案描述了利用商业化的外泌体分离试剂盒，结合蛋白酶K和RNase处理，从非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中释放的外泌体进行miRNA谱分析的可行性，以避免游离miRNA的污染，并评估其在NSCLC中的生物标志物特征。...

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

本文介绍了一种利用miRNA检测乳腺癌患者样本中miRNA表达水平的实验方案 原位...

利用miRNA对乳腺癌组织进行临床病理学分析 原位 杂交

本文介绍了一种利用染料化学法和液滴数字PCR技术对无细胞microRNA进行高灵敏度和高准确度定量的检测方法。...

利用DNA结合染料化学法和液滴数字PCR定量循环微小RNA

我们介绍了一种多重高通量基因表达检测平台的使用方法，该平台通过在生物样本中对分子进行条形码标记和计数来定量基因表达，无需扩增步骤。我们利用该平台对肠易激综合征患者和健康对照者全血中的微小RNA（miRNA）表达水平进行了定量分析。...

利用多重高通量基因表达平台检测肠易激综合征患者循环miRNA的异常变化

本文介绍了BioMILD筛查试验中采用的详细方案，用于进行循环microRNA特征分类检测，以实现肺癌的早期检测。...

基于微小RNA的液体活检：血浆微小RNA特征分类器（MSC）在肺癌筛查中的应用经验

为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。...

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

了解循环微RNA检测方法在转移性结直肠癌患者血浆样本中的应用。该技术使用24种miRNA自定义面板进行分析，可为治疗决策和预后评估提供可靠的生物标志物信息。

转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

探索更多视频