转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

该方法有助于回答转化研究领域中的关键问题，例如循环生物标志物与患者预后之间的关系。该技术的主要优势在于能够利用少量输入材料，通过简便且可靠的实验方法，检测一组循环生物标志物的表达水平。该技术的应用前景广泛，尤其在癌症患者的治疗方面，因为它可能识别出对临床决策和治疗监测具有重要意义的循环生物标志物。

此外，该方法可为循环生物标志物分析提供参考，也可应用于其他系统，例如用于疾病分子特征分析的组织生物标志物表达分析。由于提取步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。

首先，将400微升血浆样本转移至一个无RNase的2毫升离心管中。然后，向管中加入400微升变性液。再加入4微升1纳摩尔的外源添加物（spike-in）。

混合溶液后，加入800 µL酸性酚-氯仿溶液。涡旋振荡溶液60秒，然后以最大速度离心15分钟。接着，将上层水相中的裂解液小心转移至新的洁净离心管中，注意不要扰动中间相。

测量回收的水相体积，并向裂解液中加入1/3体积的乙醇。然后，将过滤柱放入新的收集管中。将最多700 µL的乙醇-裂解液混合物转移至过滤柱中。

将滤 cartridge 在 10,000 ×g 条件下离心 30 秒。接着，测量流穿液的总体积。然后，向滤液中加入等体积 2/3 的乙醇，并充分混匀。

将第二个滤芯放入新的收集管中。然后，转移最多700微升样品至滤芯中，在10,000 × g条件下离心30秒，弃去滤过液。向滤芯中加入700微升microRNA洗涤液，将滤芯与收集管一起在10,000 × g条件下离心15秒。

弃去穿流液，将滤芯放回原来的离心管中。随后，将滤芯转移至新的收集管中。然后，向滤芯中加入100 µL预热的洗脱液。

以10,000 × g离心过滤柱30秒，以回收microRNA。根据文本方案配制多聚腺苷酸化反应混合液。将2 µL样品转移至反应板的每个孔中。

然后，向每个孔中加入三微升反应混合液。充分涡旋震荡并短暂离心酶标板，使孔内液体沉降至底部。接着，将酶标板放入热循环仪中，并按照文本方案中所述步骤进行操作。

在离心管中配制连接反应混合液。然后，向反应板的每个孔中加入10微升该混合液。接着，将反应板置于摇床上，以1,900 rpm振荡1分钟，随后对反应板进行短暂离心。

此后，将反应板放入热循环仪中，并按照文本方案中所述的步骤进行操作。为进行逆转录反应，根据文本方案在离心管中配制反应混合液。然后，向含有连接产物的各孔中加入15 µL该混合液。

将培养板中的内容物在摇床中以1,900 rpm振荡混合1分钟，随后对培养板进行短暂离心。接着，将培养板放入热循环仪中，按照文本方案中所述步骤进行操作。然后，配制miR-Amp反应混合液，并向新的反应板的每个孔中加入45 µL该混合液。

此后，将 5 µL 反转录产物加入反应板的每个孔中。在振荡器上以 1,900 rpm 混匀反应板 1 分钟，随后短暂离心。然后将反应板放入热循环仪中，并按照文本方案中表一列出的程序进行操作。

首先，用TE缓冲液稀释每个cDNA样品。然后，在离心管中配制PCR反应混合液，额外加入总体积10%的过量试剂。

将19微升反应混合液转移至板的每个孔中。密封反应板，并短暂离心。最后，按照文本方案中表二所述，在RT-PCR系统上执行热循环程序。

进行外源性对照的系列稀释，以确定在此特定病例系列的所有血浆样本中添加的最佳浓度。通过该方案，可对每位患者的所有生物标志物以及整个病例系列中单一生物标志物进行评估。在本方案中，分析了接受化疗方案治疗的结直肠癌患者中一组与血管生成相关的循环miRNA，及其与无进展生存期、总生存期和客观缓解率的关系。

比较基线水平与首次临床评估时的miRNA表达水平，发现hsa-miR-155-5p表达升高。该升高与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关。在进行该操作时，需注意在通风橱内使用苯酚-氯仿进行步骤操作。完成本方案后，可进一步采用其他方法，如分离和分析循环蛋白或编码RNA，以回答更多科学问题，例如对更全面的循环生物标志物组合进行评估。

该技术问世后，为液体活检领域的研究人员探索癌症患者循环生物标志物的表达铺平了道路。请务必注意，操作血液和化学试剂可能具有极高危险性，在进行该实验时，应始终采取佩戴手套和穿着实验服等防护措施。