转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测
March 14th, 2019
我们提出了一个评估循环微 rna (mirna) 在癌症患者血浆样本中的表达水平的方案。特别是, 我们使用了商业上可用的循环 mirna 提取和逆转录酶试剂盒。最后, 我们使用实时预斑探针自定义板分析了一个由24个选定 mirna 组成的面板。
该方法有助于回答转化研究领域的一些关键问题，如循环生物标志物与患者预后的关系。该技术的主要优点是有机会评估循环生物标志物面板的表达，该方法简单可靠，投入材料量小。这种技术的影响延伸到癌症患者的治疗，因为它可以识别循环生物标志物，在患者的决策和治疗监测中有用。
此外，该方法还可以提供循环生物标志物分析的见解。它也可以应用于其他系统，如组织生物标志物表达分析，用于疾病的分子表征。此方法的可视化演示至关重要，因为提取步骤很难学习。
首先，将 400 微升的血浆样品转移到无 RNase 的两毫升管中。然后，在管中加入400微升变性溶液。添加四个微升的一纳米摩尔尖峰。
混合溶液后，加入800微升的酸酚-氯仿。旋转溶液60秒，以最大速度离心15分钟。接下来，将上水相中所含的利酸盐转移到干净的管中，注意不要干扰相间。
测量回收的水相的体积，并在酸盐中加入1/3体积的乙醇。然后，将滤芯放入新的收集管中。将多达 700 微升乙醇-分离混合物转移到滤芯中。
在重力为 10，000 倍时将滤芯离心 30 秒。接下来，测量流经的总量。然后，将2/3的乙醇体积加入过滤中，并混合好。
将第二个滤芯放入新的收集管中。然后，将多达 700 微升的样品转移到墨盒中，并在 10，000 倍重力下离心 30 秒，然后丢弃流经。在滤芯中加入700微升微RNA清洗溶液，并在10000倍重力下用收集管将其离心15秒。
丢弃流式，将滤芯放回同一管中。在此之后，将滤芯移动到新的收集管。然后，向墨盒添加 100 微升预热洗脱溶液。
将滤芯在重力为 10，000 倍的离心 30 秒，以回收微RNA。根据文本协议准备聚亚二聚二聚反应混合鸡尾酒。将样品的两微升转移到反应板的每个井中。
然后，在每井中加入三个反应鸡尾酒的微升。漩涡和离心板短暂旋转的内容。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。
在离心管中准备结扎反应混合鸡尾酒。接下来，在反应板的每个井中加入10微升的鸡尾酒。然后，在转速为 1，900 rpm 的摇床上混合反应板的内容，持续一分钟，然后短暂离心板。
在此之后，将反应板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。要执行逆转录反应，请根据文本协议在离心管中准备反应混合物。然后，在含有结扎产品的板的每个井中加入15微升混合物。
以 1，900 rpm 的转速将板的内容混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。然后，准备 miR-Amp 反应混合物，并在新反应板的每个井中加入 45 微升混合。
在此之后，在反应板的每个井中加入五微升RT产品。以 1，900 rpm 的转速将板混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。然后，将板放在热循环器中，并遵循文本协议表之一中概述的步骤。
首先，稀释TE缓冲液中的每个cDNA样品。然后，在离心管中准备PCR反应混合物。增加超过10%的体积。
将 19 微升的反应混合物转移到板的每个井中。密封板，并短暂离心。最后，在RT-PCR系统上执行热协议，如文本协议表2所示。
进行尖峰控制序列稀释，以选择在此特定案例系列的所有等离子体样品中添加的最佳浓度。得益于此协议，可以评估每个患者的所有生物标志物，以及整个病例系列中的单一生物标志物。在该协议中，对用化疗方案治疗的结直肠癌患者进行了与无进展生存、整体存活率和客观反应率相关的血管生成相关循环miRNA的小组分析。
比较基线和首次临床评价之间的miRNA表达水平，观察到有miR-155-5p的增加。这一增加与较短的PFS和操作系统有关。在尝试此过程时，重要的是要记住在烟罩下使用苯酚氯仿执行步骤。按照这个程序，可以执行其他方法，如分离和分析循环蛋白或编码RNA，以回答其他问题，如评估一个更详尽的循环生物标志物面板。
该技术开发后，为液体活检领域的研究人员探索癌症患者循环生物标志物的表达铺平了道路。不要忘记，使用血液和化学试剂可能极其危险，执行此程序时应始终采取手套和实验室外套等预防措施。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种评估癌症患者血浆样本中循环microRNA（miRNA）表达水平的方法。该技术利用市场上可购买的miRNA提取和逆转录试剂盒，然后分析24种选定的miRNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物标志物
- 癌症研究
背景
- 循环生物标志物可以提供有关患者预后的洞察。
- 评估miRNA水平可能有助于治疗决策。
- 该方法允许在输入材料最小的情况下进行分析。
- 视觉演示对理解提取过程至关重要。
研究目的
- 评估癌症患者中循环miRNA的表达。
- 识别用于监测治疗的潜在生物标志物。
- 增进对生物标志物与预后之间关系的理解。
使用的方法
- 从血浆样本中提取循环miRNA。
- 逆转录提取的miRNA。
- 分析24种选定的miRNA。
- 利用实时预先点斑探针定制板。
主要结果
- 该方法以低输入材料提供可靠的结果。
- 它能够同时评估多个循环生物标志物。
- 获得的见解可用于治疗监测和决策。
- 潜在应用范围扩展到组织生物标志物分析。
结论
- 这种技术对癌症转化研究很有价值。
- 它可能通过更好的生物标志物识别改善患者预后。
- 视觉辅助对于掌握提取方法至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Liquid biopsy approaches using circulating microRNAs offer a minimally invasive strategy for monitoring metastatic colorectal cancer progression and therapeutic response. This method enables quantitative assessment of biomarker panels from limited plasma volumes, supporting early detection of resistance mechanisms and informing treatment adjustments. By providing reproducible, quantitative miRNA expression data, the technique contributes to biomarker-driven decision-making in oncology drug development and clinical trial design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of circulating biomarker dynamics to support hypothesis generation in angiogenesis-related pathways.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for miRNA extraction and quantification from plasma, reducing variability in early biomarker screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated plasma samples for downstream qRT-PCR analysis of multi-miRNA panels.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined extraction, retrotranscription, and normalization steps using GeNorm and Expression Suite software.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links circulating miRNA expression changes (e.g., hsa-miR-155-5p) to clinical outcomes such as progression-free and overall survival, enabling prognostic biomarker evaluation.
- Operational Value: Establishes a technically robust method suitable for longitudinal monitoring in preclinical and clinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling biomarker analysis that informs target validation, assay readiness, and translational bridging from discovery to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding the role of circulating miRNAs in cancer progression and therapeutic response.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs from plasma samples, enabling reliable compound or biomarker effect assessment.
- Analytics: Generates normalized expression data suitable for statistical analysis and correlation with clinical endpoints.
- Translational Research: Connects molecular measurements to patient outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for circulating biomarker analysis across multiple oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in biomarker-disease relationships through quantitative, reproducible measurements.
- Operational Value: Delivers a low-input, technically robust workflow suitable for high-throughput biomarker screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early identification of prognostic biomarkers linked to survival outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on biomarker modulation and clinical correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and qRT-PCR to prevent degradation and ensure accurate quantification.
- Depends on access to phenol-chloroform extraction systems, thermal cyclers, and real-time PCR instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of extraction and normalization protocols for reproducible results across sites.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different biofluid types or disease models.
- Includes practical limitations related to hazardous reagent handling and the need for fume hood use during phenol-chloroform steps.
