Name: 高频超声在胎儿和胎盘发育分析中的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学习使用高频超声技术对小鼠胎儿进行无创活体成像，实时监测胎盘参数及母胎血流动力学变化。该方法无痛、快速，适用于生殖医学与发育生物学研究。

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我们非常感谢成像仪器公司（特别是 Magdalena Steiner、Katrin Suppelt 和 Sandra Meyer）提供的愉快而迅速的支持，以及他们对我们关于成像系统及其使用方面所有问题的及时且全面的解答。我们感谢德国海德堡 DKFZ 的 Hans-Reimer Rodewald 教授和 Thorsten Feyerabend 博士提供了 Cpa3 品系。此外，我们感谢 Stefanie Langwisch 负责小鼠品系的管理，并生成了图 1 中的图片。
本工作及成像系统由德国研究基金会（DFG）向 A.C.Z. 提供的资助（ZE526/6-1 和 AZ526/6-2）支持，这些项目隶属于 DFG 优先计划 1394 &#34;健康与疾病中的肥大细胞&#34;。

本文所述所有方法均已获得“萨克森-安哈尔特州行政管理局：42502-2-1296UniMD”的批准。
1. 实验步骤
<ol>
	<li>将6至8周龄的雌性肥大细胞缺乏型C57BL/6J-Cpa3Cre/+ (Cpa3Cre/+)小鼠与肥大细胞正常型C57BL/6J-Cpa3+/+（品系对照；Cpa3+/+）小鼠分别与BALB/c雄性小鼠交配。</li>
	<li>在确认阴道栓后定义妊娠第0天（gd 0），并在确认阴道栓后立即对雌鼠进行处理。 
	注：阴道栓是雄鼠精子在雌鼠阴道口形成的栓状物。
	<ol>
		<li>对对照组Cpa3+/+ 雌鼠腹腔注射250 µL PBS。</li>
		<li>对肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠腹腔注射250 µL抗CD122抗体（0.25 mg）。 
		注：如先前研究所述22，注射0.25 mg抗CD122抗体可耗竭肥大细胞缺乏型Cpa3Cre/+ 雌鼠外周及子宫自然杀伤细胞（NKs和uNKs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待至妊娠第5天（gd5）。 
	注：在gd5时，最早可进行着床分析。
	<ol>
		<li>按照步骤2-5进行超声分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在妊娠第5、8、10、12和14天（gd5、8、10、12、14）进行超声成像。</li>
</ol>
2. 超声系统的准备
<ol>
	<li>打开系统（图1A；后部主电源和左侧计算机待机按钮）、加热平台（图1B；控制面板上）和凝胶加热器（图1C）。 
	注意：超声耦合剂需预热约 0.5 h。</li>
	<li>确保异氟烷装置已充分填充（图1D）。</li>
	<li>在浏览器中打开一个新研究或在现有研究中创建新序列。在研究信息窗口中填写所有必要信息（负责人、研究名称、序列名称、动物数据）。点击确定。</li>
	<li>点击确定后，确认B模式成像窗口已出现，并且B模式成像自动开始。</li>
</ol>
3. 小鼠操作
<ol>
	<li>小鼠麻醉
	<ol>
		<li>将小鼠放入击倒箱中（图1E），关闭箱盖，打开异氟烷管路至击倒箱，并开启异氟烷（浓度为3.5%）。</li>
		<li>当小鼠进入麻醉状态后，降低异氟烷浓度至1.5%，并通过打开通向加热平台方向的管路，将气流重定向至加热平台，同时关闭通往击倒箱的气流。 
		注意：为达到充分麻醉，应在小鼠不再活动后继续等待10秒。</li>
		<li>迅速将小鼠从击倒箱转移至加热平台（图1F），保持其处于仰卧位，并轻轻将其鼻部置于平台顶部的麻醉鼻管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定、脱毛及测量前准备
	<ol>
		<li>在小鼠双眼各滴涂一层眼用保护膏，以防止角膜干燥。</li>
		<li>在加热平台上的四个铜电极区域（图1F）各滴加一滴导电胶。</li>
		<li>使用手术胶带将小鼠四肢的足掌固定在加热平台涂有导电胶的电极区域。</li>
		<li>持续监测心电图[理想值 = 450–550 次/分钟（BPM）]和呼吸生理状态。 
		注意：可通过直肠探头测量体温，但此步骤非必需。</li>
		<li>将脱毛膏涂抹于小鼠腹部，用棉签轻轻擦拭，并静置约1分钟。使用浸水纱布擦除脱毛膏。若毛发未完全去除，可重复此步骤。</li>
		<li>在脱毛后的皮肤上涂抹预热的超声耦合剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像与视频的测量与采集
<ol>
	<li>握住换能器（图1G）用手握住或将样本固定在固定装置中（图1H建议使用固定装置。</li>
	<li>使用探头识别膀胱，并以其作为参考点。将探头移至腹部左右区域，追踪种植部位。</li>
	<li>B型超声用于二维灰阶图像中解剖结构的可视化
	<ol>
		<li>移动换能器或固定小鼠的加热平台，直至屏幕上显示的第一个植入位置达到最大尺寸且清晰可见。
		<ol>
			<li>选择 图像标签 并输入名称，或 帧存储 （无名称存储）用于存储单帧图像，或 Cine Store 用于存储整个植入过程的动态影像序列以进行测量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移动探头或检查床，使胎盘处于可观察到脐动脉（UmA）血流的位置。存储单帧图像或动态影像循环（见步骤 4.3.1.1），用于胎盘测量。 
		注意：胎盘测量可从妊娠第10天（gd10）开始进行。</li>
		<li>使用相同方法继续完成所有植入操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>彩色多普勒模式用于观察和确定血流方向
	<ol>
		<li>按压 颜色 按钮。</li>
		<li>使用轨迹球将彩色框（此区域内的信号可见）移动至所需位置。如有必要，通过按压来调整框的大小 更新 向右/向上移动轨迹球可放大，向左/向下移动轨迹球可缩小。当方框大小合适时，按下 选择.</li>
		<li>按照4.3.1.1步骤所述，保存单帧图像或动态图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脉冲波（PW）多普勒模式用于定量分析血流通过血管的情况 子宫动脉 （子宫动脉，UA）和UmA
	<ol>
		<li>在彩色多普勒采集图像中定位感兴趣区域。 
		注意：脐动脉（UA）位于膀胱尾侧，而脐膜动脉（UmA）位于胎儿与胎盘之间。</li>
		<li>按压 PW，将出现一条虚线。移动该线至目标血管，并使用“Doppler Angle”旋钮调整线的角度，使其与血流方向一致。按下 更新. 
		注意：在所有动物中，血流方向与换能器之间的角度必须保持一致，尤其是在使用大于60°的角度时（本实验中，脐动脉采用70°，脐中动脉采用45°）。</li>
		<li>在脉冲多普勒（PW Doppler）采集窗口中存储多普勒频谱线出现的动态图像序列（cineloop）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 审核并完成数据采集以及保存序列
<ol>
	<li>要查看数据，请点击 研究管理。滚动至感兴趣的缩略图，然后双击 更新。</li>
	<li>首先点击 研究管理，然后在浏览器窗口中点击 关闭，以完成数据采集并保存已记录的序列。 
	注意：关闭序列后，将无法再向该序列中存储帧或动态图像。</li>
</ol>
6. 数据采集后的小鼠处理
<ol>
	<li>使用干燥的纱布从麻醉动物身上移除凝胶。</li>
	<li>小心地从动物足部去除手术胶带。</li>
	<li>关闭异氟烷气管（浓度为0%）。</li>
	<li>在妊娠第5、8、10和12天进行以下超声分析。
	<ol>
		<li>将动物单独放置于笼中至少5分钟，使其有时间苏醒并恢复方向感。</li>
		<li>将小鼠放回原始笼中。 
		注意：在移除凝胶和手术胶带之前，切勿关闭异氟烷气源，因为小鼠在关闭异氟烷后约20秒内会迅速苏醒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在妊娠第14天进行以下超声分析。
	<ol>
		<li>在雌鼠尚未苏醒前，通过颈椎脱位法将其处死。打开动物体腔，取出子宫，分离胚胎和胎盘，并测量胎儿和胎盘的重量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 复制并导入数据
<ol>
	<li>通过点击导出至并选择存储空间，将数据复制到硬盘上，以标记一个或多个序列。</li>
	<li>在计算机上打开软件，点击从…复制，然后从硬盘中选择要导入软件的研究/序列。</li>
	<li>使用软件分析数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用我们的超声系统，我们证实了从妊娠第10天（gd10）开始，MC/NK缺陷型母鼠出现胎儿生长受限。此外，在gd10和gd12时，我们观察到胎盘尺寸减小；在gd14时，部分uMC/uNK缺陷型小鼠胎儿的脐动脉（UmAs）出现舒张末期血流缺失或反向。这一血管化不良的征象与动脉显著增高的阻力指数相关，提示存在宫内生长受限（IUGR）。结果证实了uMCs和uNKs在妊娠维持、胎儿健康以及理解IUGR发展过程中的重要作用。
该方案适用于妊娠第5天（gd5）及之后的每一天（着床后）。方案中有一些关键步骤必须加以考虑。首先，脱毛操作必须谨慎进行。例如，脱毛膏与皮肤接触过度可能引起皮肤刺激；然而，脱毛不彻底会导致信号干扰，在屏幕上表现为阴影。信号不足（如出现阴影或图像颗粒感）的另一个原因可能是小鼠与超声波束之间使用的耦合胶用量过少。根据我们的经验，为获得足够的信号可见性，需要使用相对大量的耦合胶（约10 mL）。其次，二维测量在某种程度上容易产生误差。为了尽量减少不同着床部位之间的测量差异，建议在环绕着床部位测量时采用可达到的最大尺寸。为精确测量胎盘，所有着床部位均应调整至能够观察到脐动脉（Um...

超声波是指频率高于人耳可听范围的声波，通常高于约20 kHz1。蝙蝠、鲸类、海豚2，3、小鼠4、大鼠5以及鼠狐猴6等动物均利用超声波进行定位或交流。人类则将超声波应用于多种技术和医学领域。超声设备能够产生声波，并对信号进行发射和显示。当超声波遇到障碍物时，声波会被反射、吸收或穿透该物体。将超声波作为成像手段的应用称为超声成像（sonography），广泛用于人医或兽医领域中对有机组织的分析，例如心脏（超声心动图）7，8、肺部9、甲状腺10、肾脏11以及泌尿和生殖道12，13；用于检测胆结石14和肿瘤15；以及评估血管或器官的灌注情况16，17。超声检查是孕期产前护理的标准方法，可早期发现胎儿发育异常或缺陷。特别是通过定期监测胎儿生长情况，以识别可能存在的宫内生长受限（IUGR）。此外，还可监测胎儿血流，因为血流变化可提示生长受限情况18，19，20，21。
与放射成像等其他方法相比，超声成像的一个主要优势在于其声波对被分析组织无害。该方法简便、快速，具有非侵入性、无痛性，可多次重复使用。超声设备的初期投入成本较高，但所需耗材价格低廉。本论文所使用的超声系统适用于多种动物模型。 即， 小鼠和鱼类）对于人类，超声设备所需的频率为3-15 MHz，而对于小鼠，则需要15-70 MHz的频率。
本文描述了一种使用B型、彩色多普勒及脉冲波多普勒模式的实验方案。内容包括小鼠的准备、操作步骤、数据采集与存储。该方法已成功应用于不同品系小鼠的各个妊娠阶段，可用于研究胎儿和胎盘发育以及母体与胎儿的血液参数。本文基于我们对妊娠期MC/NK缺陷型小鼠及对照小鼠的研究，详细说明了所有应用方法。

<table><tbody><tr><td>LEAF 抗小鼠 CD122（IL-2Rb）</td><td>BioLegend</td><td>123204</td><td>克隆 TM-&amp;beta;1；500 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>Vevo 2100 系统</td><td>&amp;nbsp;FujiFilm VisualSonics Inc.</td><td></td><td>换能器&amp;nbsp;MS550D-0421</td></tr><tr><td>Vevo LAB 软件</td><td>&amp;nbsp;FujiFilm VisualSonics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>PZN: 6497131</td><td></td></tr><tr><td>电极凝胶</td><td>Parker</td><td>12_8</td><td></td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>3M Transpore</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Bayer</td><td>PZN: 1578675</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Raucotupf</td><td>11969</td><td>100 支</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>2077626</td><td></td></tr><tr><td>敷料</td><td>Nobamed Paul Danz AG</td><td>856110</td><td>10 x 10 cm</td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Gello GmbH</td><td>246000</td><td></td></tr></tbody></table>

高频超声用于体内胎儿和胎盘发育的分析 in vivo

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

超声成像是一种广泛用于检测人体和动物组织中器官异常及肿瘤的方法。该方法具有无创、无害、无痛的特点，操作简便、快速，且可在任何地点进行，甚至可使用移动设备完成。在妊娠期间，超声成像被常规用于密切监测胎儿发育情况。该技术对于评估宫内生长受限（IUGR）至关重要，IUGR是一种对母亲和胎儿均可能造成短期和长期健康影响的妊娠并发症。深入了解IUGR的发生机制，对于制定有效的治疗策略不可或缺。
本研究中使用的超声系统是一种专为小型动物分析而设计的超声设备，可应用于包括妊娠研究在内的多个研究领域。本文描述了该系统用于对自然杀伤（NK）细胞/肥大细胞（MC）缺陷型母鼠所孕育的宫内生长受限胎鼠进行in vivo（活体）分析的操作方法。该实验方案包括系统的准备、小鼠在测量前及测量过程中的处理，以及B模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式的使用。检测指标包括胎儿大小、胎盘大小以及胎儿血供情况。我们发现，从妊娠中期开始，NK/MC缺陷型小鼠的着床部位尺寸减小，胎盘体积更小。此外，MC/NK缺陷与胎儿脐动脉（Arteria umbilicalis, UmA）舒张末期血流缺失或反向以及阻力指数升高相关。本方案所述方法可便捷地应用于相关或非相关的研究课题中。

本论文所用超声系统的各个组成部分如图1所示。图2展示了在妊娠第5、8、10和12天（gd5、8、10和12）以B模式获取的代表性超声图像(B)以及相应的着床区域测量结果(A)，显示从gd10开始，经抗CD122处理的Cpa3Cre/+ 小鼠的着床区域显著减小。
图3展示了在B模式下获取的植入部位各组成部分（底蜕膜、胎盘、胚胎）图像（图3A），以及进行的胎盘测量（面积、厚度、直径）（图3B）。与对照组WT小鼠相比，抗CD122处理的Cpa3Cre/+ </sup...

本文介绍了利用高频超声对小鼠胎鼠进行活体分析的技术。该方法可在整个妊娠过程中对胎鼠进行追踪，并分析胎盘参数以及母体和胎儿的血流情况。

高频超声用于体内胎儿和胎盘发育的分析 In Vivo

超声成像是一种广泛用于检测人体和动物组织中器官异常及肿瘤的方法。该方法具有无创、无害等特点，且……

该方法对于肿瘤学、神经生物学、心脏病学和胎儿发育等领域的关键问题研究具有重要意义，当然在生殖研究领域也同样重要。该技术的主要优点在于其无创性、无痛、操作简便、快速，并可在整个妊娠期间对胎儿在关键的妊娠时间点进行随访观察。在成像操作前至少半小时，开启超声系统、加热平台和耦合剂加热器。在浏览器中打开一个新研究项目，或在现有研究项目中新建一个系列。在研究信息窗口中输入所有必需的信息。点击“确定”，并确认B模式成像窗口已出现。超声设备准备就绪后，确认麻醉小鼠对脚趾夹捏无反应，并在动物眼睛上涂抹眼膏。在加热平台的4个铜质区域上各滴加一滴导电凝胶，然后将动物的四肢固定在涂有导电凝胶的平台区域上。使用脱毛膏和棉签去除动物腹部的毛发，并在脱毛后一分钟后，用浸水的敷布清洗脱毛部位的皮肤以去除残留的脱毛膏。然后将预热的超声耦合剂涂抹于暴露的区域。信号强度低的一个原因是小鼠与超声束之间使用的耦合剂数量不足。根据我们的经验，要获得良好的信号质量，需要使用较大量的耦合剂。当动物准备就绪后，将探头置于膀胱上方作为参考点，并移动加热平台至腹部左右两侧，以二维B模式追踪胎体着床位置；根据需要调整探头或平台位置，直至屏幕上显示出最大截面的第一处着床部位。选择“图像标签”，并为图像文件输入名称。调整图像位置，使胎盘脐动脉内的血流清晰可见，然后存储单帧图像或动态影像循环，用于胎盘测量。为了通过彩色多普勒成像确定血流方向，请按下 Color 按钮，使用轨迹球将彩色框移动至适当位置，并根据需要点击 Update 调整框的大小。当框的大小合适后，点击 Select 并根据实验需求存储图像。为了对血管内血流进行脉冲波多普勒定量分析，请在彩色多普勒采集模式下定位感兴趣区域，然后点击 Pulse Wave。将出现一条虚线。移动该线至目标血管，并使用多普勒角度旋钮调整线的角度，使其与血流方向对齐。对于脉冲波多普勒测量，需注意观察血流方向与超声束之间的夹角。过高的角度，或同一实验中不同动物之间的角度差异，可能导致速度测量不准确。然后，点击“更新”，并在脉冲波多普勒采集窗口中存储出现的多普勒谱线动态图像。要查看数据，请点击“研究管理”，滚动至感兴趣的小图图像，双击“更新”，然后再次点击“研究管理”，再点击“关闭”以关闭浏览器窗口，完成数据采集并保存已记录的序列。要导出数据，请连接硬盘，单击“导出至”，选择一个或多个数据序列，并指定将数据复制到硬盘的存储位置。此处展示了在妊娠第5、8、10和12天以B型模式获取的代表性超声图像及其相应的着床区域测量结果，显示从妊娠第10天开始，经抗CD122处理的肥大细胞缺陷型小鼠的着床区域显著减小。B型成像有助于对单个着床部位进行成像和测量。例如，在妊娠第10天和第12天，经抗CD122处理的肥大细胞缺陷型动物与未经处理的小鼠相比，胎盘面积、厚度和直径均显著减小。相反，在妊娠第14天，两组之间的胎盘面积和直径相似，而胎盘厚度在经抗CD122处理的转基因动物中相较于未经处理的小鼠显著增加。对子宫动脉进行脉冲波多普勒成像，以测量收缩期峰值流速和舒张期流速，并计算阻力指数，结果显示处理组与未处理组动物之间的数值相似。然而，经抗 CD122 治疗的肥大细胞缺陷型动物，其脐动脉阻力指数较未经治疗的小鼠显著升高。在进行该操作时，需注意应每隔一天进行一次，而非每天进行，以避免给动物带来应激以及反复麻醉的风险。完成该操作后，可进一步开展其他测量，如三维测量、随时间推移对组织运动的可视化与定量分析、血压测量，以及超声引导下的注射等操作。该方法问世后，为产科和产前护理领域的医生和研究人员开辟了道路，因为可以在妊娠期间监测胎儿发育情况，并识别可能存在的异常。

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科研

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发育生物学

高频超声在胎儿和胎盘发育分析中的影响

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基于高频超声成像的早期妊娠表征技术：用于研究妊娠小鼠模型中胚胎着床及妊娠进展的方法

宫内生长受限兔模型中的胎儿超声心动图与脉冲波多普勒超声检查

超高频超声是一种强大的活体成像工具，可用于检测小型动物的心脏异常。其非侵入性特点有助于维持胚胎的生理状态。本文展示了利用M型超声在E18.5阶段测量胚胎心率的方法。 在子宫内.

in utero 通过无创M型超声心动图测量小鼠心率

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利用高频超声对小鼠胚胎进行对比成像

小鼠被广泛用于妊娠生物学的研究。然而，此类研究需要终止妊娠，从而无法进行纵向观察，并且需要使用大量动物。因此，我们描述了一种无创的高频超声成像技术，用于在妊娠小鼠中早期检测和监测着床后的事件。...

一种利用三维高频超声成像对小鼠早期妊娠进行表征的新方法

高频超声成像技术显著提高了胎鼠心脏的成像分辨率，可实现对心脏发育过程及结构缺陷的精确、无创性表征。本文所述方案旨在进行实时胎鼠超声心动图检测 体内.

利用高频超声（30/45 MHz）系统对胎鼠心血管成像

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。...

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

学习使用高频超声技术对小鼠胎儿进行无创活体成像，实时监测胎盘参数及母胎血流动力学变化。该方法无痛、快速，适用于生殖医学与发育生物学研究。

高频超声用于体内胎儿和胎盘发育的分析 In Vivo

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