Name: 大鼠甲基 Seq 平台识别与应力接触相关的表观变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解Methyl-Seq甲基化测序平台在大鼠模型中的应用，用于识别慢性应激暴露引起的DNA甲基化变化。该方法可定量评估表观遗传改变，为研究环境因素影响提供全面工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH101392（RSL）以及以下奖项和基金会的支持：NARSAD 青年研究者奖、Margaret Ann Price 研究员基金、通过 Charles T. Bauer 基金会设立的 James Wah 情绪障碍学者基金、Baker 基金会和 Project Match 基金会（RSL）。

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<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li>
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<li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li>
<li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339(2014).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li>
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<li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26(2013).</li>
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<li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li>
<li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li>
<li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li>
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<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSmooth%3A+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83(2012).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li>
<li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+obesity%3A+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li>
<li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%2C+coronary+heart+disease%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li>
<li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition%3A+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li>
<li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((methylKit%3A+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87(2012).</li>
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<li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low%2Fbinge+from+heavy+alcohol+drinking%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li>
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该手稿是安捷伦科技公司竞赛奖项的一部分。

在本研究中，我们设计并实现了针对大鼠基因组的Methyl-Seq平台。通过在应激大鼠模型中验证其应用价值，我们证明该实验与分析流程能够鉴定出两个比较组之间的差异甲基化区域。
为确保该平台的成功实施，需遵循若干关键步骤。首先，初始DNA的质量和数量对最终Methyl-Seq文库的质量和数量具有显著影响。我们采用荧光计而非分光光度计进行测量，以确保所测得的DNA量能准确反映双链DNA的实际含量。在DNA片段化后以及接头连接后，使用生物分析仪（Bioanalyzer）检测DNA的分子大小和数量。验证这两个步骤之间分子大小的&#34;偏移&#34;至关重要，以确认每个DNA片段末端均成功连接了接头，从而保证后续步骤中可进行接头介导的PCR扩增。接头连接步骤结束时剩余DNA的量同样重要，因为此阶段至少需要100 ng的文库产物，以确保在靶向富集和亚硫酸氢盐转化步骤后仍有足够量的DNA可供使用。对构建完成的Methyl-Seq文库进行最终的高灵敏度检测，以便将其准确稀释至适合在下一代测序仪上进行簇生成的浓度。最后，采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序法作为高定量性的独立方法，评估分析流程的准确性。使用原始样本进行最终验证，并利用额外动物样本进行重复实验，是确保本实验能够检测到DNA甲基化中具有生物学意义变化的关键步骤。
若在实验过程中出现偏离方案或遇到问题，我们还提供了一些应对建议。首先，在末端修复、接头连接或磁珠纯化步骤中，可能会损失过多的 DNA。此外，由于组织或 DNA 量有限，或采用了如荧光激活细胞分选等富集方法，起始 DNA 量可能较少（&#60;200 ng）。在此情况下，可适当增加文库扩增步骤中的循环次数，以弥补 DNA 损失过多或起始量偏低的问题。但建议额外增加的循环数不超过 2–3 个，因为过度扩增模板可能导致测序中重复序列读段（duplicate reads）数量上升。这些重复读段在比对步骤中会被剔除，以避免对甲基化百分比计算造成偏差。其次，若 DNA 平均片段长度增加未超过 30 bp，应检查所用试剂是否新鲜，因为 T4 DNA 聚合酶、Klenow 酶和/或 T4 连接酶可能已失活。此时可使用商业化的替代试剂。
此外，预测的差异甲基化区域（DMRs）可能在焦磷酸测序验证中无法成立，即DNA甲基化差异实际上并不存在，或显著小于分析所预测的差异。候选区域验证率低是许多全基因组分析中常见的问题，例如焦磷酸测序结果未能证实存在差异甲基化，或效应量远小于分析预测值。BSmooth 是一种分析工具包， &#34;平滑&#34; 多个CpG位点窗口内的甲基化水平。在本实验中，BSmooth鉴定出一个差异甲基化区域（DMR），其甲基化水平通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序得到验证。然而，BSmooth预测的甲基化水平与焦磷酸测序验证结果之间可能存在差异。这些差异源于BSmooth的平滑函数，该函数对DMR内所有CpG位点的甲基化值进行平均估计，包括那些DNA甲基化差异可能超过50%的连续CpG位点，或因测序深度低于阈值而被排除的CpG位点。类似MethylKit的R软件包24 可用于鉴定较小的CpG区域，甚至单个CpG位点，其甲基化水平与焦磷酸测序验证的结果高度相关。通过采用不同的分析软件包，并利用焦磷酸测序检测其预测的差异甲基化区域或CpG位点，可确保数据的稳健性。 alternatively，原始的Methyl-Seq文库可重新测序，并将新增的测序数据合并至原有的reads文件中，以提高测序深度。由于甲基化水平的测定属于半定量性质，其数值由reads数量决定［即（CpG数量）/（TpG数量 + CpG数量）］，因此增加特定CpG位点的测序深度将提高其甲基化百分比值的准确性。在本研究中，我们仅纳入那些甲基化水平由至少10条reads确定的CpG位点，并实现了每个CpG位点平均19倍的测序覆盖深度。
大鼠 Methyl-Seq 平台并非没有局限性。虽然它比全基因组重亚硫酸盐测序更具成本效益，但其成本明显高于其他方法。然而，大部分费用来自测序仪的测序通道租用，而非捕获系统本身。根据所需的测序深度，由于不同组织间的DNA甲基化差异较大（25–70%）12，在进行跨组织比较时所需深度较低，因此可通过每通道多重化更多样本并使用更高通量的测序平台来降低成本。此外，样本制备过程比其他方法更耗时。尽管该方法与其他结合了下一代测序的下拉（pulldown）技术类似，但额外的重亚硫酸盐转化和纯化步骤增加了工作量。总体而言，Methyl-Seq 平台是一种相较于全基因组测序更具成本效益的替代方案，能够以单碱基对分辨率检测超过230万个CpG位点，远多于基于微阵列平台所能检测的数量。迄今为止，商业化的人和小鼠 Methyl-Seq 平台已被用于记录酒精依赖对猕猴脑部的影响25,26、小鼠脑中神经发育相关基因的变化9，以及糖皮质激素在血液与脑部作用靶点的研究10。此外，该平台能够靶向特定区域，而不受限制性内切酶序列识别的限制，因此非常适合跨物种比较研究。在本研究中，我们针对大鼠设计了 Methyl-Seq 平台，因为目前大量药理学、代谢和行为学实验均在大鼠中开展，却缺乏全基因组甲基化组学工具的支持。我们的数据表明，该平台可用于检测应激大鼠模型中的差异甲基化区域（DMRs），并可将这些区域与血浆皮质酮（CORT）水平等其他生理参数相关联。
Methyl-Seq 平台非常适合对已测序基因组但缺乏足够实验证据来记录调控区域的动物进行表观遗传学研究。当这些调控区域的信息可获得时，可针对当前版本自定义设计并添加额外的区域。此外，该平台也适用于比较基因组学研究，因为目标富集不受限制性内切酶识别位点的限制。例如，无论某个感兴趣基因的启动子区域是否含有特定的限制性位点，均可对其进行捕获。同样，任何在目标基因组中保守的调控区域（例如在小鼠或人类中已鉴定出的调控区域）也可以被成功捕获。

高通量测序技术的进步已为模式生物和非模式生物提供了大量基因组序列。这些序列的可获取性极大地推动了遗传学、比较基因组学和转录组学的研究。例如，现有的基因组序列对于比对染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）实验中的测序数据非常有用，该实验通过富集与组蛋白修饰相关的DNA片段来进行分析1；此外，也可用于亚硫酸氢盐测序，后者通过检测由未甲基化胞嘧啶经亚硫酸氢盐转化形成的尿嘧啶来测定DNA甲基化水平2。然而，由于缺乏对物种特异性调控序列的功能注释数据，这些调控序列可能影响基因功能，因此在设计中整合现有基因组测序数据的表观基因组研究平台的发展受到了延迟。
特别是，DNA甲基化是DNA上研究最广泛的表观遗传修饰之一，可利用现有的基因组数据构建甲基化组学平台。一个典型的例子是基于芯片的人类甲基化组平台3，该平台已广泛应用于从肿瘤学到精神病学等多个研究领域4,5。然而，针对非人类动物模型的类似平台却十分匮乏，因为在这些平台的初始设计中，几乎没有任何广泛使用的平台充分利用了基因组序列信息。
评估非人类动物模型甲基化组景观的常用方法是简化基因组重亚硫酸盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）6。该方法克服了全基因组重亚硫酸盐测序的成本问题；尽管后者可提供全面的甲基化组图谱，但由于成本高昂以及基因组中大片基因贫乏区域的功能信息有限，其测序读长深度较低2。RRBS 通过限制性酶切和基因组 DNA 的片段大小筛选，富集高 GC 含量序列（例如通常位于基因启动子附近且被认为参与基因调控的 CpG 岛）7。尽管 RRBS 方法已在多项重要研究中得到应用，但其对限制性内切酶的依赖也存在显著的挑战和局限性。例如，RRBS 中对 GC 富集序列的富集完全依赖于限制性内切酶识别的特定序列的存在，以及后续通过电泳进行的片段大小筛选。这意味着在基因组中不含这些限制性酶切位点的区域将在大小筛选过程中被排除。此外，除非不同物种在相同基因座上具有相同的限制性酶切位点，否则跨物种比较将十分困难。
克服RRBS局限性的一种方法是采用富集技术，该技术在平台设计中利用已发表的基因组序列。基于芯片的人类研究平台使用针对特定CpG位点设计的引物探针，实现等位基因特异性（亚硫酸氢盐转化后CG与TG）靶向杂交和引物延伸。其设计不仅基于已知的人类基因组序列，还整合了来自ENCODE和ENSEMBL等多条研究途径实验验证的调控区域信息8。尽管该平台已广泛应用于人类甲基化组研究，但目前尚无适用于模式动物的类似平台。此外，基于芯片的格式对探针排布可用的表面积有显著限制。近年来，研究人员致力于结合捕获探针设计带来的靶向特异性与新一代测序的高通量优势。这一努力促成了针对小鼠基因组的基于测序的靶向富集系统（mouse Methyl-Seq）的开发，并已被用于鉴定脑特异性或糖皮质激素诱导的甲基化差异9,10。为了推动这些动物中的表观基因组学研究，尚需开发适用于其他模式及非模式动物的类似平台。
本文展示了利用这一新型平台对大鼠进行甲基化组分析的方法。大鼠在药理学、代谢、神经内分泌学和行为学研究中一直作为重要的动物模型。例如，目前迫切需要深入了解导致药物毒性、肥胖、应激反应或药物成瘾的潜在机制。若能建立一个可高效捕获与这些病理状态相关甲基化组变化的高通量平台，将有助于加深我们对相关机制的理解。由于大鼠基因组中仍缺乏对调控区域的注释，我们在大鼠Methyl-Seq平台中整合了非冗余启动子、CpG岛、CpG岛岸11以及先前鉴定的富含GC序列12。
为了评估SureSelect靶向富集（通常称为Methyl-Seq）平台在大鼠基因组中的成功设计与实施，我们采用了一种慢性可变应激（CVS）的大鼠模型13，以鉴定未应激与应激动物之间的差异甲基化区域。我们的平台设计、实验方案及实施方法可能对希望在基因组序列已知但注释尚不完善的大鼠中开展全面且无偏倚的表观遗传学研究的研究人员具有参考价值。

<table><tbody><tr><td>放射免疫分析法（RIA）</td><td>MP Biomedicals</td><td>7120126</td><td>皮质酮，125I 标记</td></tr><tr><td>Master Pure DNA 纯化试剂盒</td><td>Epicentre/Illumina</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-LOK 2-位干式恒温加热器</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1102</td><td>适用于 1.5 mL 离心管</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td>涡旋混合器</td></tr><tr><td>乙醇，纯级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>100% 乙醇，分子生物学级</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>必须能够达到 20,000 x &lt;em&gt;g&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>荧光计</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>高灵敏度 DNA 检测试剂</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>SureSelectXT 大鼠 Methyl-Seq 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>G9651A</td><td>用于构建 Methyl-Seq 文库的试剂</td></tr><tr><td>SureSelect 大鼠 Methyl-Seq 捕获文库</td><td>Agilent Technologies</td><td>931143</td><td>用于富集大鼠靶序列的 RNA 探针</td></tr><tr><td>IDTE，pH 8.0</td><td>IDT DNA</td><td>11-05-01-09</td><td>10 mM TE，0.1 mM EDTA</td></tr><tr><td>DNA LoBind 1.5 mL 管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Covaris E 系列或 S 系列</td><td>Covaris</td><td>-</td><td>等温超声破碎仪</td></tr><tr><td>microTUBE AFA 纤维预切带卡口盖 6x16mm (25)</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>超纯水（分子生物学级）</td><td>Quality Biological</td><td>351-029-721</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 孔热循环仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA 结合磁珠</td></tr><tr><td>96S 超强磁板</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td>用于纯化步骤的磁力板</td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>基于电泳的生物分析仪</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape 高灵敏度</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>D1000 试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 高灵敏度试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>DNA110 SpeedVac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>-</td><td>真空浓缩仪</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>链霉亲和素磁珠</td></tr><tr><td>Labquake 试管旋转仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>415110Q</td><td>也可使用摇摆式混合器</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5006</td><td>亚硫酸氢盐转化试剂盒，包含结合缓冲液、洗涤缓冲液、脱磺酸缓冲液和洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2500</td><td>Illumina</td><td>-</td><td>下一代测序仪</td></tr><tr><td>PCR 和焦磷酸测序引物</td><td>IDT DNA</td><td>Variable</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶（含 ThermoPol 缓冲液）- 2,000 单位</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark MD96</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>焦磷酸测序仪</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>70% 乙醇溶液</td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>0.2 M NaOH 变性缓冲液</td></tr><tr><td>J.T. Baker 的 Tris（碱基）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-508</td><td>10 mM 醋酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤液</td></tr><tr><td>PyroMark Gold Q96 试剂（50×96）</td><td>QIAGEN</td><td>972807</td><td>焦磷酸测序所需试剂</td></tr><tr><td>PyroMark 退火缓冲液</td><td>QIAGEN</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 结合缓冲液（200 mL）</td><td>QIAGEN</td><td>979006</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 Sepharose 高性能磁珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-01</td><td>包被链霉亲和素的 Sepharose 磁珠</td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS 板</td><td>QIAGEN</td><td>979101</td><td>焦磷酸测序分析板</td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-205</td><td>板式混合器，96 孔模块需单独购买（货号 05-400-207）</td></tr><tr><td>SureDesign 网站</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td>靶标捕获设计软件（https://earray.chem.agilent.com/suredesign/）</td></tr><tr><td>UCSC 基因组浏览器</td><td>加州大学圣克鲁兹分校</td><td>-</td><td>大鼠 Nov 2004 rn4 基因组组装版本</td></tr><tr><td>Agilent Methyl-Seq 实验方案</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td></tr></tbody></table>

一种用于识别与应激暴露相关表观遗传变化的大鼠甲基化测序平台

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

随着越来越多动物的基因组被测序完成，人们迫切需要能够捕捉这些动物模型中动态表观遗传变化的工具。大鼠是一种特别重要的模式动物，引入表观遗传学工具可为大量药理学和行为学研究提供深入的机制性信息。为此，我们针对大鼠优化了SureSelect靶向捕获系统（称为Methyl-Seq），该系统可用于评估大鼠基因组范围内的DNA甲基化水平。该大鼠设计覆盖了所有RefSeq基因的启动子区域、CpG岛、CpG岛岸区以及GC富集区域。
为了在大鼠实验中实施该平台，雄性Sprague Dawley大鼠接受了为期3周的慢性可变应激处理，随后采集血液样本用于基因组DNA提取。通过片段化、接头连接、靶向富集、亚硫酸氢盐转化和多重化等步骤，从大鼠DNA样本构建甲基化测序文库。文库在下一代测序平台上进行测序，对测序得到的读段进行分析，以鉴定应激大鼠与非应激大鼠之间DNA的差异甲基化区域（DMRs）。通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序对排名靠前的候选DMRs进行独立验证，以确认该平台的可靠性。
结果表明，大鼠甲基化测序平台是一种有效的表观遗传学工具，能够捕获由应激暴露所诱导的甲基化变化。

大鼠甲基化测序平台的成功实施依赖于多个标准。图1展示了本研究的整体工作流程，并强调了在进入下一步之前所需的关键质量控制（QC）步骤。首先需要考虑的因素之一是动物模型和应激方案的可靠性，这些因素决定了甲基化组范围内表观遗传变化的程度。由于我们的动物实验基于先前的观察结果，即皮质酮（CORT）暴露可导致DNA甲基化发生变化19,20，因此我们所采用的慢性可变应激（CVS）方案必须具有足够的强度，以产生血浆CORT水平升高的应激大鼠。典型的每周CVS方案见表1，包括每天上午、下午和夜间持续变换的应激刺激，以防止动物产生适应性并减弱应激反应。在为期3周的应激过程中，应激组动物的平均血浆CORT水平显著高于未应激的对照组动物[第4–21天，对照组：32.7 ± 3.7 ng/mL，应激组：103.0 ± 11.9 ng/mL（均值±标准误），P = 2.2 × 10-4，图2A]。一致地，这些动物在高架十字迷宫（EPM）测试中也表现出更强的焦虑样行为，表现为在闭臂中停留的时间显著更长，而在开臂中停留的时间更短（图2B）。这些结果表明，CVS暴露引起了显著的内分泌和行为改变，促使我们进一步探究这些变化是否与特定的DNA甲基化特征相关。
我们强调几个对于成功构建 Methyl-Seq 文库至关重要的关键步骤。起始 DNA 量必须充足，因为超声处理、多次洗涤/纯化、靶标富集以及亚硫酸氢盐转化等步骤会逐步减少最终文库中的 DNA 量。尽管多个 PCR 扩增步骤可缓解 DNA 模板的损失，但过多的 PCR 循环次数可能导致重复序列读数增加。在本项大鼠 Methyl-Seq 研究中，每只大鼠使用了 2 μg 血液基因组 DNA。需要注意的是，Methyl-Seq 文库的起始 DNA 量可低至 500 ng。使用较少起始材料可使研究人员利用 FACS（荧光激活细胞分选）或穿刺针获取的 DNA 制备文库，但存在产生文库量不足以进行后续测序的风险。通过在生物分析仪上对 1 μL 样品进行电泳来执行质量控制（QC），以获得 DNA 分子量、浓度和摩尔浓度。使用生物分析仪进行检测的三个关键步骤包括：1）超声处理后，确认 DNA 被充分打断（约 170 bp，红色，图 3）；2）接头连接后，观察到打断 DNA 的平均片段大小发生偏移（约 200 bp，蓝色，图 3），以确保其后续可通过 PCR 有效扩增；3）最终文库纯化后，确认文库的产量和片段大小是否满足测序要求。
使用 Bioconductor 中的 R 软件包 BSSeq 和 BSmooth 分析亚硫酸氢盐测序数据18。这些软件包包含用于序列比对、质量控制以及识别差异甲基化区域（DMRs）的工具和方法。BSmooth 软件调用 Bowtie 2.016,17 作为内部序列比对工具，通过将原始测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的基因组序列，获得 CpG 位点水平的测量汇总结果。比对后的读段需经过严格的质量控制流程进行过滤，以识别可能影响下游分析的系统性测序错误和碱基识别错误。该过程会生成一系列图表，用于辅助可视化过滤。同时还会生成测序指标，记录相关参数信息，如比对读段数量、目标区域百分比（% target）以及每个 CpG 位点的覆盖度等（表 2）。数据过滤完成后，将执行平滑/标准化算法，基于每个样本的所有质控后读段以及邻近 CpG 位点的估计值，为每个 CpG 位点分配一个估计的甲基化值，从而在测序覆盖度较低的情况下也能更准确地判断甲基化状态。该值提供了每个 CpG 位点甲基化概率的平滑估计。通过比较两组处理样本间平滑甲基化估计值的均值，并将基因组区域按差异显著性从高到低排序，即可生成差异甲基化区域列表（表 3）。
在应激组与非应激组之间，最显著的差异甲基化区域（DMR）位于大鼠主要组织相容性基因 Rt1-m4 的启动子区，所有CpG位点的甲基化水平在应激动物中均高于非应激动物（图4A）。为验证Methyl-Seq平台及其数据分析的成功实施，针对该DMR设计了引物，并通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序法检测了全部应激与非应激动物队列（8只经Methyl-Seq测序，8只未测序）的血液DNA甲基化水平。结果显示，在检测的12个CpG位点中的10个位点上，DNA甲基化水平显著升高（甲基化百分比变化为5.1–10.4，P &lt;0.037，图4B）。对所有名义上显著的DMR进行了KEGG通路分析，以鉴定与应激相关的通路。结果一致显示，与DMR相关的通路涉及长期应激暴露相关疾病，如糖尿病、心血管疾病和癌症（表4）。21,22,23 为证明表观遗传数据与应激暴露程度之间的关联，将CpG-10的甲基化水平与每只动物平均3周的皮质酮（CORT）水平进行比较。结果表明内分泌数据与甲基化数据之间存在适度相关性（R2=0.54，P=0.001，图5）。
<img alt="大鼠应激DNA分析流程图；甲基化测序、亚硫酸氢盐转化、测序、验证步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58617/58617fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：大鼠甲基化测序平台的整体示意图工作流程。 从应激组和对照组大鼠血液中提取的1 μg基因组DNA首先用于构建甲基化测序文库，以进行测序、分析和靶点鉴定。另外100 ng DNA用于通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序对鉴定出的表观遗传靶点进行独立验证。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58617/58617fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="对照组与应激组大鼠的血浆皮质酮水平、高架十字迷宫结果、图表、CVS 研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58617/58617fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：慢性可变应激（CVS）导致大鼠出现内分泌和行为改变。（A）多次检测皮质酮（CORT）水平表明为期 3 周的 CVS 方案具有显著效应。血液样本于每日应激处理前的早晨采集。（B）应激组动物在高架十字迷宫（EPM）的闭臂中停留时间更长，在开臂中停留时间更短。图中显示包含每只动物数据点的箱形图。采用 Student t 检验进行统计学分析。*P&lt;0.05，**P&lt;0.01，***P&lt;0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58617/58617fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="DNA荧光分析图，DNA片段大小分布，荧光单位与碱基对示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58617/58617fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：利用生物分析仪对剪切后并连接接头的鼠源DNA进行定量分析。 红色和蓝色曲线分别显示基因组DNA在等温超声破碎后以及连接接头后的数量和片段大小。每条曲线代表一个样本，红蓝曲线的变化反映了在末端修复、3'端腺苷化及样本纯化等多个步骤中DNA的损失，以及由于接头连接导致的碱基对长度增加。在25 bp和1500 bp处的尖锐峰为加入上样缓冲液中的标准标记物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58617/58617fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA甲基化分析；A) 趋势图，B) 柱状图；对照组与应激组中的CpG位点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58617/58617fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过大鼠Methyl-Seq检测到由CVS诱导的表观遗传改变。（A）大鼠Methyl-Seq数据分析表明，Rt1m4基因的启动子区在应激组（红色）与对照组（蓝色）大鼠之间为差异甲基化区域（DMR）。Rt1m4 DMR的图形输出（粉红色阴影区域）显示了每个CpG位点（垂直灰色线）、每组中的四个样本（红色或蓝色线）以及每只动物的甲基化百分比水平（红色或蓝色点）。（B）通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序验证了DMR内的12个CpG位点。柱状图以均值±标准误（SEM）表示，并采用Student's T检验进行统计学显著性分析。*P&lt;0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58617/58617fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA甲基化与血浆CORT散点图；线性相关性，R²=0.54，P=0.001。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58617/58617fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：线性回归分析显示，应激组和对照组动物（N=16）在Rt1m4基因CpG-10位点的DNA甲基化百分比与3周平均血浆CORT水平之间存在适度相关性。应激组动物的数据以红色圆圈表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58617/58617fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>周</td>
			<td>第1天</td>
			<td>第2天</td>
			<td>第3天</td>
			<td>第4天</td>
			<td>第5天</td>
			<td>第6天</td>
			<td>第7天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上午</td>
			<td>束缚</td>
			<td>游泳</td>
			<td>低温室</td>
			<td>游泳</td>
			<td>束缚</td>
			<td>摇床</td>
			<td>游泳</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>下午</td>
			<td>摇床</td>
			<td>笼具倾斜</td>
			<td>束缚</td>
			<td>摇床</td>
			<td>低温室</td>
			<td>束缚</td>
			<td>低温室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过夜</td>
			<td>食物限制</td>
			<td>潮湿垫料</td>
			<td>隔离</td>
			<td>光照开启</td>
			<td>拥挤</td>
			<td>光照开启</td>
			<td>潮湿垫料</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：慢性可变应激方案（CVS）的典型每周时间表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">测序指标</td>
			<td>应激1</td>
			<td>对照1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> (n = 4)</td>
			<td>(n = 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成对末端读段 (PER)</td>
			<td>89,290,397</td>
			<td>80,165,674</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>唯一比对的成对末端读段 (UMPER)</td>
			<td>39,200,255</td>
			<td>35,013,406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>比对率/比对效率 (UMPER/PER)</td>
			<td>44%</td>
			<td>44%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重复读段 (% of UMPER)</td>
			<td>73%</td>
			<td>65%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去重后的UMPER</td>
			<td>10,481,031</td>
			<td>12,306,018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)</td>
			<td>6x</td>
			<td>6x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG位点数量 (N)</td>
			<td>12,056,878</td>
			<td>12,056,878</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)</td>
			<td>2x</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>至少10条读段覆盖的CpG位点 (N)</td>
			<td>481,383</td>
			<td>595,850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>至少10条读段覆盖的CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上CpG位点（与探针靶区完全重叠）</td>
			<td>1,923,872</td>
			<td>2,007,638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)</td>
			<td>7x</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>至少10条读段覆盖的靶上CpG位点 (N)</td>
			<td>428,249</td>
			<td>531,419</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>至少10条读段覆盖的靶上CpG位点的平均读段深度覆盖度 (x)</td>
			<td>18x</td>
			<td>18x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上读段（与探针靶区至少1个碱基对重叠的PER）(UMPER)</td>
			<td>8,277,715</td>
			<td>9,369,523</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上比例（占去重后UMPER的比例）</td>
			<td>78%</td>
			<td>77%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上（比对的总碱基数）Mb</td>
			<td>125 Mb</td>
			<td>128 Mb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶上平均读段深度覆盖度 (x) (ARDC)</td>
			<td>9x</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1测序指标基于每组内个体的平均值计算</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：从大鼠甲基化测序平台获得的测序指标。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>染色体</td>
			<td>起始位置</td>
			<td>终止位置</td>
			<td>基因</td>
			<td>距离</td>
			<td>区域统计值</td>
			<td>平均差异</td>
			<td>胁迫组</td>
			<td>对照组</td>
			<td>方向</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr20</td>
			<td>1,644,246</td>
			<td>1,644,390</td>
			<td>RT1-M4</td>
			<td>in_gene</td>
			<td>93.03</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.33</td>
			<td>0.11</td>
			<td>获得</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr5</td>
			<td>160,361,352</td>
			<td>160,361,564</td>
			<td>LOC690911</td>
			<td>in_gene</td>
			<td>-70.75</td>
			<td>-0.19</td>
			<td>0.72</td>
			<td>0.91</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr3</td>
			<td>61,138,281</td>
			<td>61,138,330</td>
			<td>RGD1564319</td>
			<td>265569</td>
			<td>61.79</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.72</td>
			<td>获得</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr2</td>
			<td>143,064,811</td>
			<td>143,065,010</td>
			<td>Ufm1</td>
			<td>8569</td>
			<td>-59.48</td>
			<td>-0.11</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.24</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr7</td>
			<td>30,764,111</td>
			<td>30,764,284</td>
			<td>Ntn4</td>
			<td>in_gene</td>
			<td>57.04</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.73</td>
			<td>获得</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr17</td>
			<td>12,469,112</td>
			<td>12,469,218</td>
			<td>Idnk</td>
			<td>41996</td>
			<td>-50.91</td>
			<td>-0.13</td>
			<td>0.74</td>
			<td>0.88</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr7</td>
			<td>47,101,725</td>
			<td>47,101,930</td>
			<td>Pawr</td>
			<td>in_gene</td>
			<td>-50.54</td>
			<td>-0.12</td>
			<td>0.64</td>
			<td>0.76</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr5</td>
			<td>76,111,248</td>
			<td>76,111,822</td>
			<td>Txndc8</td>
			<td>151703</td>
			<td>-50.38</td>
			<td>-0.11</td>
			<td>0.85</td>
			<td>0.96</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr11</td>
			<td>80,640,132</td>
			<td>80,640,356</td>
			<td>Dgkg</td>
			<td>in_gene</td>
			<td>-50.07</td>
			<td>-0.16</td>
			<td>0.73</td>
			<td>0.89</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chr8</td>
			<td>71,759,248</td>
			<td>71,759,411</td>
			<td>Mir190</td>
			<td>210226</td>
			<td>-47.84</td>
			<td>-0.17</td>
			<td>0.58</td>
			<td>0.75</td>
			<td>丢失</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：前10个差异甲基化区域。 对于每个DMR，输出表格从左到右依次显示：染色体位置（chr）、坐标（起始/终止）、基因名称、与转录起始位点的距离、应激组与对照组之间的差异区域统计值（areaStat）、平均差异甲基化水平（meanDiff）、每个DMR在应激组和对照组中的平均甲基化水平（应激组/对照组），以及相对于对照组的甲基化变化方向。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KEGG 通路术语</td>
			<td>基因数</td>
			<td>%</td>
			<td>P 值</td>
			<td>Benjamini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">糖尿病</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 型糖尿病</td>
			<td>12</td>
			<td>0.1</td>
			<td>3.6 x 10-4</td>
			<td>9.8 x 10-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">心血管疾病</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血管平滑肌收缩</td>
			<td>18</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.6 x 10-3</td>
			<td>3.6 x 10-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>致心律失常性右室心肌病（ARVC）</td>
			<td>13</td>
			<td>0.1</td>
			<td>4.0 x 10-3</td>
			<td>7.1 x 10-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扩张型心肌病</td>
			<td>14</td>
			<td>0.1</td>
			<td>7.6 x 10-3</td>
			<td>1.2 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">神经元功能</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>长时程增强作用</td>
			<td>11</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5 x 10-2</td>
			<td>1.4 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">信号通路</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAPK 信号通路</td>
			<td>35</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2.4 x 10-4</td>
			<td>9.9 x 10-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钙信号通路</td>
			<td>22</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.2 x 10-2</td>
			<td>1.4 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>趋化因子信号通路</td>
			<td>21</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.2 x 10-2</td>
			<td>1.3 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">癌症</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>癌症中的通路</td>
			<td>42</td>
			<td>0.3</td>
			<td>4.1 x 10-5</td>
			<td>3.4 x 10-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶质瘤</td>
			<td>15</td>
			<td>0.1</td>
			<td>4.4 x 10-5</td>
			<td>2.4 x 10-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非小细胞肺癌</td>
			<td>10</td>
			<td>0.1</td>
			<td>7.9 x 10-3</td>
			<td>1.1 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>结直肠癌</td>
			<td>13</td>
			<td>0.1</td>
			<td>8.4 x 10-3</td>
			<td>1.1 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>慢性髓性白血病</td>
			<td>12</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.2 x 10-2</td>
			<td>1.3 x 10-1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：基于大鼠甲基化测序鉴定出的差异甲基化区域的KEGG通路分析。

本文描述了使用大鼠模型的Methyl-Seq（一种表观基因组学平台）的实验方案及实施方法，旨在鉴定与慢性应激暴露相关的表观遗传学改变。结果表明，大鼠Methyl-Seq平台能够检测出应激暴露引起的大鼠DNA甲基化差异。

随着更多种类动物基因组的相继获得，人们越来越需要能够捕捉这些生物体中动态表观遗传变化的工具……

该方法可通过展示如何设计和实施基于测序的技术来评估环境因素对DNA甲基化的影响，从而帮助解答表观基因组学领域的关键问题。该技术的主要优势在于，与基于芯片的平台相比，它能够提供一种更全面、更定量的方法来评估DNA甲基化水平。该技术的应用意义在于，可拓展用于识别在基因组序列数据可获得的任何生物体中，由不同类型生理过程引起的DNA甲基化变化。尽管该方法可用于研究应激对DNA甲基化的影响，但也同样适用于其他环境因素或生理状况，例如高脂饮食中环境毒物的暴露，以及糖尿病和心血管疾病等状况。在将DNA片段化并通过生物分析仪验证其片段大小后，向每个样本中加入180微升DNA结合磁珠，在室温下孵育5分钟。将磁珠置于磁力架上沉淀，弃去上清液。将沉淀重悬于200微升70%乙醇中。接着，使用磁力架沉淀磁珠，并尽可能吸除乙醇。将磁珠置于37摄氏度的加热块中干燥三至五分钟。然后，将沉淀重悬于44 µL无核酸酶的水中，并收集约42 µL上清液。连接接头后，通过生物分析仪验证连接效果，随后将样品转移至低DNA吸附的微量离心管中。接着，使用加热真空浓缩仪将样品体积浓缩至低于3.4 µL。此后，向每个样本中加入 5.6 µL 的 Methyl-Seq 阻断混合液，并在热循环仪中孵育。根据文本方案配制捕获文库杂交混合液。然后，向每个样本中加入 20 µL 捕获文库杂交混合液，在 65 °C 下孵育 16 小时。在孵育即将结束时，准备链霉亲和素磁珠：将每份样本50微升的链霉亲和素磁珠加入新的八联管中。用200微升Methyl-Seq结合缓冲液洗涤磁珠。将八联管置于磁力架上，移除磁珠上方的上清液。然后，将磁珠重悬于200微升Methyl-Seq结合缓冲液中。将样品加入经洗涤的链霉亲和素磁珠中，在室温下于旋转混合仪上孵育30分钟。在样品混合的同时，将200微升Methyl-Seq洗涤缓冲液二等分至96孔板的三个复孔中，并预热至65摄氏度。样本孵育后，使用磁力架沉淀磁珠并移除上清液。随后，将磁珠重悬于200 µL Methyl-Seq洗涤缓冲液一中。室温孵育15分钟，再用磁力架去除上清液。此后，将磁珠沉淀重悬于 200 µL 预热的洗涤缓冲液二中。然后，在使用磁力架沉淀磁珠前，将磁珠置于热循环仪中孵育。向洗涤后的磁珠中加入 20 µL 甲基化测序洗脱缓冲液，并在室温下孵育 20 分钟。使用磁力架沉淀磁珠，并将上清液转移至新的条形管中。首先，向先前收集的上清液中加入130微升亚硫酸氢盐转化试剂。将150微升的反应体系均分为两个孔。然后，将反应物置于热循环仪中孵育。使用600 µL结合缓冲液将样品与离心柱结合，并用100 µL洗涤缓冲液洗涤离心柱。随后离心离心柱，并弃去穿流液。此后，向各柱中加入 200 µL 脱磺化缓冲液。将柱子在室温下孵育 15 至 20 分钟。用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤柱子两次。然后，向柱中加入 10 µL 洗脱缓冲液。在室温下孵育，并进行离心。根据文本方案配制 PCR 反应主混合液。然后，向每个样品中加入82微升的预混液，并将样品放入热循环仪中孵育。首先，根据文本方案在冰上配制PCR预混液二。然后，向每个样品中加入25.5微升PCR预混液二和5微升商业索引引物，并将样品放入热循环仪中孵育。使用生物分析仪上的高灵敏度DNA检测试剂评估样品的DNA浓度。随后将Methyl-Seq文库提交至下一代测序仪进行测序。在完成亚硫酸氢盐转化和PCR扩增验证样品后，使用结合缓冲液、水和链霉亲和素包被的Sepharose珠配制主混合液。然后，向96孔板中加入75微升主混合液和5微升巢式PCR产物，并将该板置于板式振荡器上振荡15至60分钟。在振荡过程中，向焦磷酸测序分析板的各孔中加入12微升引物。振荡结束后，将真空工具放入盛有水的槽中，随后将其置于含有结合反应液的板中。接下来，将真空工具浸入装有70%乙醇、氢氧化钠和Tris-乙酸盐缓冲液的半满槽中。断开真空，将真空工具放入HS焦磷酸测序分析板中以转移珠子。将板置于加热块上，在80摄氏度孵育两分钟。最后，在开始焦磷酸测序程序前，让样品板冷却五分钟。本方案中，甲基化测序文库的分析提供了应激与非应激动物之间差异甲基化区域（DMRs）的排序列表，并给出了DMRs的图形化图谱。通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序验证发现，所有应激动物在全部CpG位点的甲基化水平均高于非应激动物。CpG 10 位点的甲基化水平还与每只动物的平均三周 CORT 水平进行了比较。结果表明，内分泌数据与甲基化数据之间存在适度的相关性。在进行该实验操作时，需注意比较 DNA 片段化与接头连接步骤之间平均 DNA 大小的增加情况，并确保测序前文库数量充足。采用此方法后，还可实施其他类似方法以回答新的科学问题，例如环境毒物对大鼠神经发育的影响。该技术建立后，为表观遗传学领域的研究人员提供了研究工具，可用于在任何基因组序列已知的模式或非模式生物中分析全基因组范围的DNA甲基化变化。请注意，操作温度敏感性酶时必须在使用过程中置于冰上，并在使用后保存于-20 °C冰箱中。用于目标捕获的RNA磁珠在使用过程中需在冰上融化并保存，长期储存则需置于负80度冰箱中。

a-rat-methyl-seq-platform-to-identify-epigenetic-changes-associated

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

大鼠甲基 Seq 平台识别与应力接触相关的表观变化

我们描述了一种创伤后应激障碍（PTSD）的大鼠模型，该模型揭示了神经内分泌功能的持续性改变以及延迟出现的长期过度恐惧反应，这些特征与PTSD患者的表现一致。本文所述的动物模型和方法可用于关联脑核团中的生物标志物（具有机制性意义但无法在患者中检测）与外周白细胞中的生物标志物（可检测）。...

用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物

本文展示了一种用于研究生命早期应激下DNA甲基化和基因表达变化的简化工作流程。从新生小鼠的母体分离开始，到离散脑组织的分离，我们提供了一种从脑组织穿孔样本中同时提取DNA和RNA的实验方案，以用于后续的亚硫酸氢盐测序和逆转录PCR分析。...

大脑中微小解剖限定区域的DNA甲基化与基因表达优化分析

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序是一种基于限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析测序文库制备方法。该方案需要50...

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

抗应激能力是长寿的标志性特征之一，已知其受遗传因素调控。在此，我们开发了一种无偏倚的高通量方法，用于筛选赋予胚胎干细胞抗应激能力的突变，从而建立用于长寿研究的小鼠模型。...

利用正向遗传学方法揭示小鼠应激抗性基因——在胚胎干细胞中进行的高通量筛选

本文介绍了将工程化分裂型TET2酶（CiDER）导入哺乳动物细胞的详细实验方案，用于化学诱导DNA羟甲基化及表观遗传重塑。...

一种可化学诱导DNA羟甲基化与表观遗传重塑的工程化分裂型TET2酶

本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C.

生理应激反应的测量 秀丽隐杆线虫

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

本研究描述了利用微阵列技术获得的DNA甲基化数据的处理流程。该方案展示了从样本制备到数据分析的各个步骤。所有操作均进行了详细说明，视频中还演示了关键的操作步骤。...

DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略

本文介绍了一种高效的荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，适用于通过靶点切割和核酸酶释放技术（CUT&amp;RUN）研究肌纤维中转录调控。...

一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

本文介绍了在小鼠和大鼠中使用物理束缚应激诱导应激反应的操作步骤，并讨论了在啮齿类动物模型中选择和使用束缚应激时应考虑的其他因素。...

在小鼠和大鼠中通过束缚诱导应激

本方案通过放线菌素D处理、逆转录定量PCR及非线性回归分析，定量测定小鼠胚胎干细胞中基因间和基因内增强子RNA的稳定性和半衰期。采用位置特异性标准化策略，以准确建模依赖于上下文的增强子RNA降解动力学。...

小鼠胚胎干细胞中增强子RNA稳定性的优化定量评估

了解Methyl-Seq甲基化测序平台在大鼠模型中的应用，用于识别慢性应激暴露引起的DNA甲基化变化。该方法可定量评估表观遗传改变，为研究环境因素影响提供全面工具。

一种用于识别与应激暴露相关表观遗传变化的大鼠甲基化测序平台

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