大鼠甲基 Seq 平台识别与应力接触相关的表观变化
2018年10月24日
在这里, 我们描述了同道平台甲基 Seq 的协议和实现, 使用老鼠模型来识别与慢性应力暴露相关的表观变化。结果表明, 大鼠甲基序列平台能够检测大鼠应力暴露引起的甲基化差异。
此方法通过演示如何设计和实施基于测序的工具来评估环境因素对 DNA 甲基化的影响，有助于回答表观基因组学领域的关键问题。与基于阵列的平台相比，该技术的主要优点是，它可以提供一种更全面和定量的方法来评估DNA甲基化水平。该技术的影响延伸到DNA甲基化变化的识别，由于不同类型的生理过程在任何生物体的序列数据可用。
虽然这种方法可以提供对DNA甲基化压力的影响的洞察，但它也可以应用于其他环境因素或生理条件，如高脂肪饮食中接触环境有毒物质以及糖尿病和心血管疾病等疾病。剪切DNA并通过生物分析器验证大小后，在每个样品中加入180微升DNA结合磁珠，并在室温下孵育5分钟。将珠子放在磁性板上，然后取出上一除。
将颗粒重新在 200 微升 70%乙醇中。接下来，使用磁板对珠子进行颗粒，并尽可能多地去除乙醇。在37摄氏度的高温下将珠子干燥3至5分钟。
然后，将颗粒重新在44微升无核糖水中，并收集约42微升的上一液。在连接适配器和通过生物分析器验证结扎后，将样品转移到低DNA结合的微离心管中。然后，使用加热真空浓缩器将样品体积减至 3.4 微升以下。
在此之后，将5.6微升的甲基-Seq块混合添加到每个样品中，并在热循环器中孵育。根据文本协议准备捕获库混合。然后，将捕获库杂交混合的 20 微升添加到每个样品中，并在 65 摄氏度下孵育 16 小时。
在潜伏期接近尾声时，通过将每个样品的50微升链球菌磁珠添加到新的八井条带管中，准备链球菌磁珠。用200微升的甲基-秒装缓冲液清洗珠子。将条管放在磁性板上，然后从磁珠上取下上一除。
然后，在200微升甲基-秒装缓冲液中重新填充珠子。将样品加入洗涤的链球菌珠中，并在室温下在旋转搅拌器上孵育30分钟。当样品混合时，等价200微升的甲基-Seq洗涤缓冲液二成96孔板的三孔，预热至65摄氏度。
样品孵育后，用磁板对磁珠进行颗粒化，然后取出上经剂。然后，在200微升的甲基-Seq洗涤缓冲器一中重新填充珠子。在室温下孵育珠子15分钟，并使用磁板去除上一液。
在此之后，在预热洗涤缓冲器二的200微升中重新填充珠颗粒。然后，在使用磁板对珠子进行颗粒化之前，先在热循环器中孵育珠子。在洗涤的珠子中加入 20 微升甲基 - 洗脱缓冲液，并在室温下孵育 20 分钟。
使用磁板对珠子进行颗粒状，然后将上一液转移到新的条管上。首先，将130微升的二硫酸盐转化试剂添加到先前收集的上流液中。将150微升反应平均分为两个孔。
然后，在热循环器中孵化反应。使用 600 微升装订缓冲器将样品绑定到旋转柱，并使用 100 微升的洗涤缓冲器清洗柱。然后，将柱子离心，并丢弃流经。
在此之后，向列中添加 200 微升脱硫缓冲器。在室温下孵育柱15至20分钟。用 200 微升的洗涤缓冲器清洗柱子两次。
然后，向列中添加 10 微升的"洗脱缓冲区"。在室温下孵育，并离心机。根据文本协议准备 PCR 反应主混合。
然后，将主混合物的82微升添加到每个样品中，并在热循环器中孵育样品。首先，根据文本协议在冰上准备PCR主混合二。然后，在每个样品中，加入25.5微升PCR主混合2和5微升的商业索引底剂，并在热循环器中孵育样品。
利用生物分析器上的高灵敏度DNA检测试剂评估样品的DNA浓度。然后提交甲基-Seq 库，用于下一代测序器的测序。在双硫酸盐转换和PCR放大验证样品后，准备与结合缓冲器、水和链球菌涂层的塞法罗斯珠的主混合。
然后，将主混合物的 75 微升和嵌套 PCR 产品的 5 微升添加到 96 井板中，并在板摇板上摇动板 15 至 60 分钟。当板摇动时，在一个镀光检测板的井中加入12微升的底剂。摇动后，将真空工具放在装满水的槽中，然后将真空工具放在具有结合反应的板中。
接下来，将真空工具淹没在半填充槽中，其中含有70%乙醇、氢氧化钠和三醋酸酯缓冲液。断开真空，将真空工具放在 HS 转印检测板中以转移珠子。将板放在热块上，在 80 摄氏度下孵育两分钟。
最后，让板冷却五分钟，然后开始热气塔程序。在该协议中，对甲基-Seq库的分析提供了压力动物和无压力动物之间的不同甲基化区域（DMR）的排名列表，以及DMR的图形图。 通过双硫化双糖的验证表明，所有CCP的压水动物的甲基化水平都高于未强调动物。
CpG 10 的甲基化水平还与每种动物的三周平均 CORT 水平进行比较。结果表明，内分泌和甲基化数据之间有适度的相关性。在尝试此过程时，必须记住比较 DNA 剪切和适配器结扎步骤之间平均 DNA 大小的增加，并确保在测序之前有足够的库数量。
按照这个程序，可以实施其他类似的方法，以回答新的问题，如环境毒剂对大鼠神经发育的影响。该技术开发后，为表观遗传学领域的研究人员提供了探索基因组全基因组DNA甲基化变化的手段，这些非模型或模型生物体的基因组序列都可用。不要忘记，使用温度敏感的酶需要储存在冰上，而使用和储存在负20度的冰柜。
用于目标捕获的RNA珠需要在使用时解冻和储存在冰上，并长期储存在零下80度的冰柜中。
概述
本文描述了Methyl-Seq协议，这是一个应用于大鼠模型的表观基因组平台，用于探索由于慢性压力导致的表观遗传改变。研究结果表明，Methyl-Seq平台能有效地识别与压力暴露相关的甲基化变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观基因组学
- 压力生理学
- DNA甲基化
背景
- Methyl-Seq是一种基于测序的工具，用于评估DNA甲基化。
- 它提供了一种比传统基于芯片平台更全面的方法。
- 该技术可应用于不同生物体的各种生理过程。
- 了解DNA甲基化变化可以提供关于压力和其他环境因素的见解。
研究目的
- 展示在大鼠模型中实施Methyl-Seq。
- 识别与慢性压力暴露相关的表观遗传变化。
- 提供DNA甲基化水平的定量评估。
所用方法
- 剪切DNA并通过生物分析仪验证大小。
- 使用磁性珠进行DNA结合和纯化。
- 进行亚硫酸盐转化和PCR扩增。
- 在下一代测序仪上对Methyl-Seq文库进行测序。
主要结果
- 识别受压力和未受压力大鼠之间的差异甲基化区域（DMRs）。
- 验证受压力动物在所有CpG位点上的较高甲基化水平。
- DMRs的图形表示显示了显著的表观遗传变化。
- 关于压力对DNA甲基化水平影响的见解。
结论
- Methyl-Seq平台有效用于研究由于压力导致的表观遗传变化。
- 这种方法可以适应各种环境和生理条件。
- 进一步的研究可以扩展其应用到其他健康相关问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Epigenetic profiling enables mechanistic de-risking in target validation by linking environmental exposures to functional genomic changes. The rat Methyl-Seq platform provides quantitative, genome-wide methylation data that supports hypothesis testing in stress-related disease models. This capability enhances predictive confidence in preclinical target selection and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying stress-induced methylation changes in promoter and CpG island regions.
- Operational Value: Enables biological de-risking through epigenome-wide association with phenotypic outcomes.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating epigenetic markers with endocrine biomarkers such as corticosterone levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated epigenetic assays for downstream compound screening in disease-relevant systems.
- Operational Value: Standardizes methylation quantification via bisulfite conversion and next-generation sequencing for reproducible outputs.
- Scalability: Facilitates multiplexed library preparation for high-throughput epigenetic profiling across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase epigenetic findings to preclinical validation through independent bisulfite pyrosequencing confirmation.
- Mechanistic De-risking: Identifies differentially methylated regions (DMRs) that serve as mechanistic biomarkers of stress exposure.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on epigenetic response thresholds in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The Methyl-Seq platform integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing epigenetically informed decision points.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by linking stress exposure to site-specific methylation changes in RefSeq gene-associated regions.
- Screening: Delivers assay-ready epigenetic profiles with quantitative methylation readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates ranked DMR lists and graphical methylation plots that enable cross-condition comparison and statistical modeling.
- Translational Research: Ensures preclinical continuity by validating sequencing-derived DMRs with orthogonal bisulfite pyrosequencing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epigenetic profiling workflow applicable to diverse environmental toxicants, metabolic conditions, and pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of environmental stressors to epigenetic modifications in disease-relevant genomic regions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via bisulfite conversion, target enrichment, and NGS-based quantification.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in target validation through epigenetically informed stratification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on epigenetic response magnitude and reproducibility across biological replicates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenomics, library preparation, and bisulfite conversion chemistry.
- Depends on next-generation sequencing infrastructure and bioanalyzer for library QC.
- Necessitates cross-team standardization of DNA shearing, adapter ligation, and bead-based purification protocols.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and environmental exposure models beyond blood and stress.
- Includes practical limitations such as input DNA quantity requirements and sensitivity to enzymatic temperature sensitivity during bisulfite treatment.
