酵母的4D显微成像

该方法可在数分钟内对酵母细胞中的结构进行三维追踪，使我们能够研究细胞内细胞器和区室的动态行为。四维成像确保我们能够对细胞内动态过程得出可靠结论，特别是针对那些可能短暂存在的结构或标记物。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员Natalie Johnson进行演示。

首先，在 15 毫升带挡板的锥形瓶中，加入 5 毫升无荧光合成定义培养基（NSD），于 23 °C、良好通气条件下培养目标酵母菌株过夜。在分析前 3 至 4 小时，将处于对数生长期的酵母培养物用新鲜 NSD 培养基稀释，使成像时在 600 纳米处的光密度（OD600）达到 0.5 至 0.8。在培养物准备完成前至少 1 小时，将 2 毫克/毫升的刀豆蛋白 A（Concanavalin A）溶液取少量 aliquot 于离心机中以最大转速离心 5 分钟，以沉淀其中的颗粒物，然后取上清液 250 微升加入洁净的 35 毫米玻璃底共聚焦培养皿中。

15分钟后，每次用2 mL蒸馏水洗涤培养皿两到三次，在Concanavalin A包被的培养皿干燥后，加入250 µL酵母培养物。静置10分钟，使细胞充分贴附，随后用2 mL新鲜NSD培养基轻轻洗涤培养皿两到三次。然后加入2 mL新鲜NSD培养基覆盖细胞。

为了观察酵母细胞，需在共聚焦显微镜上选择一个数值孔径至少为1.4的63倍油镜。此处也可使用100倍物镜替代63倍物镜。随后，将滴有浸油的培养皿放置在物镜上。

在采集模式选项卡的下拉菜单中，选择 xyzt。在 XY 选项卡下，将帧尺寸设置为宽度 256、高度 128。使用最大扫描速度，通常约为八千赫兹。

如果支持双向X轴扫描，请将其开启，并将缩放倍数调整为9，此时像素大小约为80纳米。若使用100倍物镜，请相应调整缩放倍数，以保持像素大小约为80纳米。然后将线累积设置为4或6。

将针孔设为1.2艾里单位，如有条件，打开白光激光器。然后为每个荧光通道设置激发波长和激光功率百分比。如有条件，在配置选项卡中取消选择最大积分时间，以启用光子计数模式。

对于每个荧光通道，分配一个高灵敏度探测器，设置发射波长范围，并在可用的情况下开启光子计数模式。为每个荧光通道设置时间门控窗口为 0.6 至 10 纳秒，以避免捕获玻璃培养皿反射的光线。接下来，开启明场成像，并选择低灵敏度探测器进行数据采集。

打开实时成像模式，调高明场通道的增益，直至细胞清晰可见。若处于光子计数模式，将灰度值范围从手动改为自动，以观察荧光信号。设置Z轴层扫以覆盖酵母细胞的完整体积，并指定成像方向，使“向下”移动趋近于盖玻片。

将Z步进间隔设置为0.25至0.35微米，以获得每Z栈约20至25个光学切片，并在可用时开启Galvo Flow。对于典型的视频，将Z栈之间的时间间隔设置为2秒，视频持续时间设置为5至10分钟。然后将视频保存为LIF文件。

进行图像去卷积时，启动使用经典最大似然估计算法的适当去卷积软件程序，并打开数据序列。选择去卷积向导和参数编辑器，以确认成像参数已被检测并正确显示。将包埋介质的折射率值更改为 1.4，以近似酵母细胞质的折射率。

然后使用编辑器估算盖玻片位置。选择“全部设为已验证”，点击“接受”，再选择“进入向导”。点击下一步箭头，跳过点扩散函数选择和裁剪预处理阶段，随后为每个荧光通道依次完成去卷积向导操作。

选择计算对数垂直映射函数，并检查原始数据的荧光强度曲线。将背景估算模式设为手动，输入背景值，然后点击确认。将最大迭代次数保持为40，并输入估计的信噪比。

然后关闭漂白校正，点击去卷积。在去卷积结果窗口中，如果噪声已被充分去除，同时较弱结构的真实荧光信号未被消除，则选择“接受”以进入下一个通道。当所有荧光通道均被满意地去卷积后，点击“全部完成”，并将红色通道排列在前，随后依次为绿色通道、蓝色通道和明场通道，以便在 ImageJ 中进行后续编辑。

然后将图像序列保存为8位TIF文件，并选择每个通道一个文件以及对比度拉伸作为转换模式。进行漂白校正时，将去卷积后的图像序列导入ImageJ，点击图像、超堆栈（Hyperstacks）和堆栈转超堆栈（Stack to Hyperstack），将图像转换为超堆栈。从下拉菜单中选择xyzct，并输入通道数、Z轴层切片数和时间帧数。

为校正荧光通道的光漂白现象，依次选择图像（Image）、颜色（Color）、拆分通道（Split Channels）；针对荧光通道，依次选择插件（Plugins）、EMBLtools、漂白校正（Bleach Correction）和指数拟合（Exponential Fit）。然后选择图像（Image）、颜色（Color）和合并通道（Merge Channels），将明场图像与经漂白校正的荧光通道合并为超堆栈（hyperstack），并将去卷积且经漂白校正的超堆栈保存为8位TIF文件，用于后续的视频生成与编辑。要将去卷积并经漂白校正的数据集转换为缩放拼接图，依次选择插件（Plugins）、IJ_Plugins 和生成拼接序列（Make Montage Series），并选择相应的8位超堆栈。

单击“打开”和“确定”，确认使用所有切片创建拼接图，然后再次单击“确定”以接受建议的缩放因子值。将原始拼接图保存为8位TIF文件，然后选择“插件”→“IJ_Plugins”→“Montage Series to Hyperstack”，再单击“确定”，从包含所有时间帧的原始拼接图创建一个4D超堆栈。要生成原始的平均投影视频，首先选择“插件”→“IJ_Plugins”→“Project Hyperstack”，然后单击“确定”，以接受Z投影的默认参数。

将平均投影的视频保存为8位TIF文件，并检查视频以识别可在其标记期间持续追踪的单个结构。在整个视频过程中能够可靠追踪并用于分析的结构的识别，是该实验流程中最关键的步骤。随后，按照插件用户指南中的说明，通过编辑图像序列来分离出感兴趣的结构。

针对包含目标结构的时间段，从已编辑的拼接图像创建一个4D超堆栈，并保存已编辑的超堆栈。为了量化已编辑4D超堆栈中孤立结构随时间变化的荧光强度，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Analyze Edited Movie”（分析已编辑电影），输入Z堆栈之间的时间间隔，然后点击“OK”（确定）。要创建孤立结构的最终电影，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Project Hyperstack”（投影超堆栈），指定应包含的Z堆栈切片，选择“Average Intensity”（平均强度）作为投影类型，然后点击“OK”（确定）。要使用原始数据与已编辑数据合并创建4D超堆栈，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Merge Two Hyperstacks”（合并两个超堆栈），并选择“Place first above second”（将第一个置于第二个之上）。要从包含原始数据覆盖已编辑数据的4D超堆栈生成电影，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Project Hyperstack”（投影超堆栈），指定应包含的Z堆栈切片，选择“Average Intensity”（平均强度）作为投影类型，然后点击“OK”（确定）。此处，可以将原始数据Z堆栈投影的第一帧与经过去卷积和漂白校正后的相同数据进行比较。

这些图像来自同一段去卷积并校正了光漂白效应的视频，展示了两个被分析的池状结构。这些结构首先被绿色的钒酸盐抗性糖基化蛋白4（Vrg4）标记物标记，随后被红色的分泌相关基因7（Sec7）转运蛋白标记物标记。该图像组合图由去卷积并校正光漂白的超堆栈数据生成，显示了在编辑前后同一时间点的所有光学切片，以便分离出所选某个池状结构的信号。本图展示了最终投影Z堆栈视频中的若干帧图像，图的上半部分为原始投影图像，下半部分为经过编辑后的投影图像。

对选定的高尔基体扁平囊中绿色和红色荧光信号的定量分析显示，绿色Vrg4标记物到达后持续约80秒，随后红色Sec7标记物到达并持续约60秒，两种标记物之间存在短暂的重叠。在执行该操作时，重要的是要识别出在其整个生命周期中均可明确追踪的结构。在引入突变或其他特定干扰因素后，也可进行相同类型的分析。

该技术为利用酵母作为模式系统研究高尔基体扁平囊和内质网出芽位点的动态行为开辟了道路。