Name: 酵母的4D显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习使用多色4D共聚焦显微镜技术追踪酵母细胞内荧光标记的细胞器动态变化。该方法可实时观察高尔基体等细胞器的时序行为，为细胞生物学研究提供定量分析工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 GM104010支持。感谢Vytas Bindokas和Christine Labno在整合显微成像核心设施（Integrated Microscopy Core Facility）对荧光显微镜实验提供的协助，该设施由NIH资助的癌症中心支持项目P30 CA014599支持。

1. 准备
<ol>
	<li>制备非荧光性最低限度NSD培养基2。不含核黄素可降低细胞内背景绿色荧光及其相关的光毒性。</li>
	<li>将酵母菌株在50 mL带挡板的锥形瓶中，于约23 °C条件下，在5 mL NSD培养基中过夜培养至对数生长期，保持良好通气。在分析前约3–4小时，用新鲜NSD&#160;稀释酵母培养物，使成像时终末OD600为0.5–0.8。</li>
	<li>配制2 mg/mL的刀豆球蛋白A（ConA）溶液。如需要，可用液氮将该溶液分装后冻存于-80 °C。</li>
	<li>将ConA溶液在微量离心机中以最大转速离心5分钟，以去除可能干扰成像的颗粒物质。然后取250 µL上清液加入洁净的35 mm玻璃底共聚焦培养皿中。15分钟后，用2 mL去离子水（dH2O）洗涤2–3次，并使其自然干燥。</li>
	<li>向ConA包被的培养皿中加入250 µL酵母培养物，静置10分钟使细胞贴附，随后用2 mL NSD轻柔洗涤2–3次，并加入2 mL新鲜NSD覆盖细胞。</li>
</ol>
2. 成像
<ol>
	<li>使用63倍或100倍油镜。数值孔径（NA）为1.40已足够，但也可使用更高NA的物镜。</li>
	<li>将帧尺寸设置为256 × 128（宽 × 高）。如果需要更大的帧尺寸，只要共聚焦显微镜配备谐振扫描器，增加宽度不会降低扫描速度。</li>
	<li>调整缩放倍数，使像素大小约为80 nm。</li>
	<li>使用最大扫描速度，通常在8 kHz左右。如果设备支持且对照实验确认双向X轴扫描图像对齐无误，则开启双向X轴扫描。</li>
	<li>将线累积（line accumulation）设置为4或6。务必使用累积（求和）模式而非平均模式。</li>
	<li>将针孔设为1.2艾里单位（Airy units）。经验表明，在活体酵母细胞成像时，该设置比标准的1.0艾里单位能捕获更多光子，同时不会引起可察觉的分辨率损失。</li>
	<li>针对每个荧光通道，设置激发波长，指定高灵敏度探测器，设定发射波长范围，并在可用时开启光子计数模式。波长选择取决于所用荧光染料。例如，GFP荧光在485&#160;nm激发，收集范围为495–550 nm；mScarlet&#160;荧光在555&#160;nm激发，收集范围为562–625&#160;nm。</li>
	<li>将每台激光器的强度设置为尽可能低。该参数需通过实验确定。合适的强度应能获得虽有噪声但可解读的图像序列，在5分钟的成像过程中荧光信号漂白不超过50%。在本实验所用的共聚焦显微镜上（见材料表），此强度对应激光功率设置约为5%。</li>
	<li>使用陷波滤光片或时间门控以避免捕获盖玻片的反射光。若具备时间门控功能，将门控窗口设为0.6–10.0 ns。</li>
	<li>开启明场成像，并使用低灵敏度探测器进行数据采集。调节增益使细胞清晰可见。请勿使用微分干涉差（DIC）成像，因其棱镜会干扰可靠荧光数据的获取。</li>
	<li>将Z轴步进间隔设为0.25–0.35 µm。通过每个Z栈采集约20–25个光学切片，以覆盖酵母细胞的完整体积。设定成像方向，使&#34;向下&#34;指向盖玻片方向。</li>
	<li>对于典型影片，将Z栈之间的时间间隔设为2秒，影片持续时间设为5至10分钟。根据所研究的细胞区室，可缩短时间间隔以记录相对较快的动力学过程（制作较短影片），或延长间隔以记录较慢的动力学过程（制作较长影片）。</li>
	<li>将影片保存为LIF&#160;文件，明场图像置于最后一个通道。此阶段无需更高位深，后续处理流程已配置为接收8位TIFF数据。</li>
</ol>
3. 去卷积
<ol>
	<li>使用经典最大似然估计算法启动去卷积软件（参见材料表）。</li>
	<li>打开在步骤 2.13 中生成的数据集。选择&#34;去卷积向导&#34;。检查&#34;参数向导&#34;中显示的数值，成像参数应已被正确识别并显示。在&#34;折射率&#34;部分，将&#34;封埋介质&#34;的值更改为 1.40，以近似酵母细胞质的折射率。&#160;在“盖玻片”选项下，选择“启动编辑器”、“估计位置”和“确定”，以设定盖玻片的位置。然后选择&#34;设置全部已验证&#34;和&#34;确认&#34;。</li>
	<li>对每个荧光通道依次执行&#34;去卷积向导&#34;。在背景估计模式中选择&#34;手动&#34;。检查原始数据的荧光强度分布，以确定背景值的估计值，该值通常约为 0.1。</li>
	<li>在去卷积设置菜单中，输入&#34;最大迭代次数&#34;为 40，并关闭漂白校正。输入信噪比（SNR）的估计值，通常约为 5.0。点击&#34;开始去卷积&#34;。</li>
	<li>如有必要，返回原始数据文件，调整背景值和 SNR 值，并重复去卷积过程，直至在充分去除噪声的同时，不丢失来自弱荧光结构的真实信号。</li>
	<li>合并明场与去卷积后的荧光通道。在 ImageJ 中进行后续视频编辑时，按以下顺序排列通道：红色通道在前，绿色通道（如存在）其次，蓝色通道（如存在）再次，明场通道在最后。将图像序列保存为 8 位 TIFF 文件。</li>
</ol>
4. 漂白校正与视频生成
<ol>
	<li>将反卷积后的图像序列导入 ImageJ，并通过选择“图像 &#62; 超级栈 &#62; 栈转超级栈”将其转换为超级栈。从下拉菜单中选择 &#34;xyzct&#34;，并填写通道数、Z 栈层数和时间帧数（http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector）。</li>
	<li>选择“图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道”。</li>
	<li>使用来自 http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector 的 ImageJ 插件对荧光通道进行光漂白校正。下载并安装该插件后，选择“插件 &#62; EMBLtools &#62; 光漂白校正”，然后选择 &#34;指数拟合&#34;。</li>
	<li>要将明场图像与校正后的荧光通道合并为一个超级栈，请选择“图像 &#62; 颜色 &#62; 合并通道”。将生成的超级栈保存为 8 位 TIFF 文件。</li>
	<li><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58618/ImageJ.zip" target="_blank">安装本实验方案提供的自定义 ImageJ 插件</a>。按照随附文档中的说明查看、编辑和量化图像序列，并生成 Z 栈投影的最终视频。</li>
</ol>

<ol><li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li>
<li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li>
<li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li>
<li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Golgi+apparatus%3A+insights+and+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li>
<li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li>
<li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232(2015).</li>
<li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting%2C+disruption%2C+replacement%2C+and+allele+rescue%3A+integrative+DNA+transformation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li>
<li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li>
<li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787(2017).</li>
<li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).</li>
<li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin%2C+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li>
<li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li>
<li>Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy.+3rd+edn%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

对酵母细胞器进行4D共聚焦成像需要仔细优化多个参数。主要关注的问题是光漂白和光毒性。典型的4D视频需要采集数千个光学切片，因此必须尽可能降低激光照射强度。可使用串联荧光蛋白标签来增强信号，而无需提高被标记蛋白的表达水平16,17。提高扫描速度有助于减少光损伤，同时也能以足够短的时间间隔采集Z轴堆栈图像。在XY和Z方向上均达到奈奎斯特采样极限的体素尺寸，可在理论上最大限度地还原光学系统所能提供的信息，同时最小化光照暴露18。最终，在光学切片中信号区域的每个体素通常仅接收到1–3个光子。这一信息量远低于单次Z轴堆栈成像或去卷积处理通常推荐的最佳成像条件。但去卷积仍可通过平滑噪声信号提供帮助，此类数据集仍可进行分析与定量。
即使拥有高质量的4D数据集，对标记细胞器的追踪仍是一项复杂的任务。通过此处提供的ImageJ插件，研究人员可以在计算机屏幕上排列每个Z-stack，并能够方便地在不同时间点以及原始数据与编辑后的数据之间来...

内膜系统的各个区室始终处于动态变化之中，对其进行全面表征需要进行活细胞成像。本文所述的方案采用4D（延时3D）共聚焦显微镜技术，用于观察出芽酵母中荧光标记的区室。该方法最初开发用于追踪Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae1,2,3中的分泌区室动态。本方案聚焦于S. cerevisiae，其高尔基体不形成堆叠结构，各个单个囊泡在光学上可分辨4。S. cerevisiae独特的高尔基体结构使得通过4D显微镜观察成为可能：一个高尔基体囊泡最初被定位于顺式高尔基体的标志蛋白标记，随后失去这些蛋白，同时获得位于反式高尔基体的标志蛋白3,5。这种转变可通过构建一种酵母菌株来实现可视化，其中早期高尔基体蛋白Vrg4标记GFP，晚期高尔基体蛋白Sec7标记单体红色荧光蛋白。在追踪单个囊泡时，成熟过程表现为由绿色向红色的转变3。此类分析可提供有关蛋白质定位和区室身份的重要信息。例如，在静态图像中，两个到达和离开时间略有差异的蛋白质可能看似定位于不同区室，但在4D动态影像中可观察到它们在不同时间点标记的是同一区室6,7。因此，4D显微镜能够揭示传统方法无法察觉的生物学现象。
通过适当的实验步骤和设备，可实现对酵母细胞区室的高信息量4D显微成像2。在条件允许的情况下，应通过基因替换方法进行荧光蛋白标记8，以避免因过表达而产生的假象。由于细胞内结构通常具有高度动态性，因此需要进行4D成像，以确保能够可靠地随时间追踪特定结构。本文所述方案采用配备高灵敏度检测器的激光扫描共聚焦显微镜。使用该设备，可对S. cerevisiae的整个细胞体积进行共聚焦成像，成像时间间隔约为每1–3秒一次，典型设置为每2秒成像一次。数据采集时间可持续5–15分钟，具体时长取决于荧光染料的标记密度及其光物理特性。主要挑战在于最大限度减少光漂白。为此，应将激光强度保持在尽可能低的水平，共聚焦扫描速度应设置为最大值，并将光学参数配置为达到奈奎斯特采样极限，以便在捕获关键信息的同时避免过度光照。这些设置还有助于减轻光毒性，而光毒性在活细胞成像过程中常被忽视9,10,11。所获得的含噪声数据随后通过光漂白校正和去卷积算法进行处理，以促进荧光强度的定量分析。
即使使用高质量的4D成像，分析仍然具有挑战性，因为酵母细胞器通常数量众多、具有异质性且处于运动状态。由于共聚焦显微镜的固有限制以及长时间4D成像所需的非最优设置，彼此靠近的荧光结构难以分辨。这一问题可通过关注在标记期间始终保持光学可分辨的少数荧光结构来规避，前提是这些结构能够代表所有被标记细胞器的整体群体。可通过观察Z轴投影图像序列的动态视频，并在计算机屏幕上将每个时间点的光学切片排列成一系列拼接图，从而识别出可被可靠追踪的荧光细胞器。该分析采用定制的ImageJ12插件，可实现对单个结构的独立追踪。
近期的方法学论文涵盖了荧光蛋白在酵母中的应用13，以及酵母细胞4D共聚焦成像的理论与实践2。本实验方案重点介绍4D成像实验中的关键实践环节，包括对先前所述实验步骤的一些改进，以及ImageJ插件代码和文档的更新版本。示例部分聚焦于高尔基体动态，但本方案同样适用于其他酵母细胞区室的成像。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>成像用培养皿</td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Vector Laboratories</td><td>CB-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>显微镜软件</td></tr><tr><td>Huygens Essential 软件，版本 17.04</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td>去卷积软件</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>图像处理与分析软件</td></tr></tbody></table>

酵母的4d显微成像

4D Microscopy of Yeast

本实验方案的目的是表征出芽酵母活细胞中膜区室的形成与转化过程。酵母细胞内的许多区室具有动态特性，要全面理解其性质，需要进行时间序列成像。多色4D共聚焦荧光显微镜是一种强大的方法，可用于在5–15分钟的时间尺度上追踪细胞内区室的行为和组成。对区室动态进行严谨分析需要采集数千张光学切片。为实现这一目标，需在极低激光功率下快速扫描，以最大限度减少光漂白和光毒性，同时将像素尺寸和Z轴步进间隔设置为与全分辨率采样兼容的最大值。由此获得的4D数据集虽然存在噪声，但可通过去卷积进行平滑处理。即使数据质量较高，分析阶段仍具挑战性，因为细胞内结构通常数量众多、形态异质且具有移动性。为满足这一需求，已开发了定制的ImageJ插件，用于在计算机屏幕上排列4D数据、识别感兴趣结构、编辑数据以分离单个结构、量化荧光时间变化，并生成Z栈投影的动态影像。4D影像特别有助于区分稳定的区室与通过成熟过程短暂存在的区室。此类影像还可用于表征区室融合等事件，并检验特定突变或其他干扰因素的影响。

此处给出的示例通过双色4D共聚焦显微镜3记录并量化了两种酵母高尔基体囊腔的成熟过程。一个酵母细胞含有约10–15个高尔基体囊腔，每个囊腔的成熟过程持续大约2–4分钟。可通过将早期高尔基体标志物Vrg4与GFP标记，以及将晚期高尔基体标志物Sec7与mCherry或mScarlet等红色荧光蛋白标记，来可视化该成熟过程。单个囊腔最初被Vrg4标志物标记，随后经历一个短暂的过渡阶段，在此期间标志物发生交换，最终被Sec7标志物标记。
由于细胞内含有多个高度动态的高尔基体囊腔，因此在整个标记期间追踪单个囊腔具有挑战性。鉴于图像数据在时间和空间分辨率上的限制，囊腔之间的距离通常过于接近，难以被明确区分。此外，高尔基体囊腔偶尔会发生融合14，而晚期高尔基体囊腔倾向于在极性生长位点处聚集15。因此，一段4D影像通常只能提供...

本方案描述了利用多色4D（延时3D）共聚焦显微镜对出芽酵母中荧光标记的细胞内区室进行分析的方法。成像参数的选择旨在获取足够信号的同时尽量减少光损伤。通过定制的ImageJ插件，可对标记结构进行追踪和定量分析。

酵母的4D显微成像

本实验方案的目的是表征出芽酵母活细胞中膜区室的形成与转化过程。许多细胞内区室……

该方法可在数分钟内对酵母细胞中的结构进行三维追踪，使我们能够研究细胞内细胞器和区室的动态行为。四维成像确保我们能够对细胞内动态过程得出可靠结论，特别是针对那些可能短暂存在的结构或标记物。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员Natalie Johnson进行演示。首先，在 15 毫升带挡板的锥形瓶中，加入 5 毫升无荧光合成定义培养基（NSD），于 23 °C、良好通气条件下培养目标酵母菌株过夜。在分析前 3 至 4 小时，将处于对数生长期的酵母培养物用新鲜 NSD 培养基稀释，使成像时在 600 纳米处的光密度（OD600）达到 0.5 至 0.8。在培养物准备完成前至少 1 小时，将 2 毫克/毫升的刀豆蛋白 A（Concanavalin A）溶液取少量 aliquot 于离心机中以最大转速离心 5 分钟，以沉淀其中的颗粒物，然后取上清液 250 微升加入洁净的 35 毫米玻璃底共聚焦培养皿中。15分钟后，每次用2 mL蒸馏水洗涤培养皿两到三次，在Concanavalin A包被的培养皿干燥后，加入250 µL酵母培养物。静置10分钟，使细胞充分贴附，随后用2 mL新鲜NSD培养基轻轻洗涤培养皿两到三次。然后加入2 mL新鲜NSD培养基覆盖细胞。为了观察酵母细胞，需在共聚焦显微镜上选择一个数值孔径至少为1.4的63倍油镜。此处也可使用100倍物镜替代63倍物镜。随后，将滴有浸油的培养皿放置在物镜上。在采集模式选项卡的下拉菜单中，选择 xyzt。在 XY 选项卡下，将帧尺寸设置为宽度 256、高度 128。使用最大扫描速度，通常约为八千赫兹。如果支持双向X轴扫描，请将其开启，并将缩放倍数调整为9，此时像素大小约为80纳米。若使用100倍物镜，请相应调整缩放倍数，以保持像素大小约为80纳米。然后将线累积设置为4或6。将针孔设为1.2艾里单位，如有条件，打开白光激光器。然后为每个荧光通道设置激发波长和激光功率百分比。如有条件，在配置选项卡中取消选择最大积分时间，以启用光子计数模式。对于每个荧光通道，分配一个高灵敏度探测器，设置发射波长范围，并在可用的情况下开启光子计数模式。为每个荧光通道设置时间门控窗口为 0.6 至 10 纳秒，以避免捕获玻璃培养皿反射的光线。接下来，开启明场成像，并选择低灵敏度探测器进行数据采集。打开实时成像模式，调高明场通道的增益，直至细胞清晰可见。若处于光子计数模式，将灰度值范围从手动改为自动，以观察荧光信号。设置Z轴层扫以覆盖酵母细胞的完整体积，并指定成像方向，使“向下”移动趋近于盖玻片。将Z步进间隔设置为0.25至0.35微米，以获得每Z栈约20至25个光学切片，并在可用时开启Galvo Flow。对于典型的视频，将Z栈之间的时间间隔设置为2秒，视频持续时间设置为5至10分钟。然后将视频保存为LIF文件。进行图像去卷积时，启动使用经典最大似然估计算法的适当去卷积软件程序，并打开数据序列。选择去卷积向导和参数编辑器，以确认成像参数已被检测并正确显示。将包埋介质的折射率值更改为 1.4，以近似酵母细胞质的折射率。然后使用编辑器估算盖玻片位置。选择“全部设为已验证”，点击“接受”，再选择“进入向导”。点击下一步箭头，跳过点扩散函数选择和裁剪预处理阶段，随后为每个荧光通道依次完成去卷积向导操作。选择计算对数垂直映射函数，并检查原始数据的荧光强度曲线。将背景估算模式设为手动，输入背景值，然后点击确认。将最大迭代次数保持为40，并输入估计的信噪比。然后关闭漂白校正，点击去卷积。在去卷积结果窗口中，如果噪声已被充分去除，同时较弱结构的真实荧光信号未被消除，则选择“接受”以进入下一个通道。当所有荧光通道均被满意地去卷积后，点击“全部完成”，并将红色通道排列在前，随后依次为绿色通道、蓝色通道和明场通道，以便在 ImageJ 中进行后续编辑。然后将图像序列保存为8位TIF文件，并选择每个通道一个文件以及对比度拉伸作为转换模式。进行漂白校正时，将去卷积后的图像序列导入ImageJ，点击图像、超堆栈（Hyperstacks）和堆栈转超堆栈（Stack to Hyperstack），将图像转换为超堆栈。从下拉菜单中选择xyzct，并输入通道数、Z轴层切片数和时间帧数。为校正荧光通道的光漂白现象，依次选择图像（Image）、颜色（Color）、拆分通道（Split Channels）；针对荧光通道，依次选择插件（Plugins）、EMBLtools、漂白校正（Bleach Correction）和指数拟合（Exponential Fit）。然后选择图像（Image）、颜色（Color）和合并通道（Merge Channels），将明场图像与经漂白校正的荧光通道合并为超堆栈（hyperstack），并将去卷积且经漂白校正的超堆栈保存为8位TIF文件，用于后续的视频生成与编辑。要将去卷积并经漂白校正的数据集转换为缩放拼接图，依次选择插件（Plugins）、IJ_Plugins 和生成拼接序列（Make Montage Series），并选择相应的8位超堆栈。单击“打开”和“确定”，确认使用所有切片创建拼接图，然后再次单击“确定”以接受建议的缩放因子值。将原始拼接图保存为8位TIF文件，然后选择“插件”→“IJ_Plugins”→“Montage Series to Hyperstack”，再单击“确定”，从包含所有时间帧的原始拼接图创建一个4D超堆栈。要生成原始的平均投影视频，首先选择“插件”→“IJ_Plugins”→“Project Hyperstack”，然后单击“确定”，以接受Z投影的默认参数。将平均投影的视频保存为8位TIF文件，并检查视频以识别可在其标记期间持续追踪的单个结构。在整个视频过程中能够可靠追踪并用于分析的结构的识别，是该实验流程中最关键的步骤。随后，按照插件用户指南中的说明，通过编辑图像序列来分离出感兴趣的结构。针对包含目标结构的时间段，从已编辑的拼接图像创建一个4D超堆栈，并保存已编辑的超堆栈。为了量化已编辑4D超堆栈中孤立结构随时间变化的荧光强度，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Analyze Edited Movie”（分析已编辑电影），输入Z堆栈之间的时间间隔，然后点击“OK”（确定）。要创建孤立结构的最终电影，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Project Hyperstack”（投影超堆栈），指定应包含的Z堆栈切片，选择“Average Intensity”（平均强度）作为投影类型，然后点击“OK”（确定）。要使用原始数据与已编辑数据合并创建4D超堆栈，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Merge Two Hyperstacks”（合并两个超堆栈），并选择“Place first above second”（将第一个置于第二个之上）。要从包含原始数据覆盖已编辑数据的4D超堆栈生成电影，请选择“Plugins”（插件）、“IJ_Plugins”（IJ插件）和“Project Hyperstack”（投影超堆栈），指定应包含的Z堆栈切片，选择“Average Intensity”（平均强度）作为投影类型，然后点击“OK”（确定）。此处，可以将原始数据Z堆栈投影的第一帧与经过去卷积和漂白校正后的相同数据进行比较。这些图像来自同一段去卷积并校正了光漂白效应的视频，展示了两个被分析的池状结构。这些结构首先被绿色的钒酸盐抗性糖基化蛋白4（Vrg4）标记物标记，随后被红色的分泌相关基因7（Sec7）转运蛋白标记物标记。该图像组合图由去卷积并校正光漂白的超堆栈数据生成，显示了在编辑前后同一时间点的所有光学切片，以便分离出所选某个池状结构的信号。本图展示了最终投影Z堆栈视频中的若干帧图像，图的上半部分为原始投影图像，下半部分为经过编辑后的投影图像。对选定的高尔基体扁平囊中绿色和红色荧光信号的定量分析显示，绿色Vrg4标记物到达后持续约80秒，随后红色Sec7标记物到达并持续约60秒，两种标记物之间存在短暂的重叠。在执行该操作时，重要的是要识别出在其整个生命周期中均可明确追踪的结构。在引入突变或其他特定干扰因素后，也可进行相同类型的分析。该技术为利用酵母作为模式系统研究高尔基体扁平囊和内质网出芽位点的动态行为开辟了道路。

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