小鼠肝脏消化对淋巴内皮细胞的流式细胞仪分析

该方案的目标是使用所述标记识别肝脏内的淋巴管内皮细胞群。我们利用胶原酶 iv 和 dnase 和组织的温和切碎, 结合流式细胞仪, 以确定一个独特的淋巴内皮细胞的群体。

此方法可以帮助回答淋巴和肝脏领域的关键问题，如淋巴内皮细胞或 LECs 如何响应特定刺激，以及这如何有助于疾病发病机制。该技术的主要优点是，我们可以评估肝淋巴内皮细胞表型和功能基于每个细胞的基础上，并可用于细胞排序后下游应用。虽然这种方法可以提供肝脏淋巴生物学的见解，它也可以用来评估不同组织的淋巴内皮细胞，如皮肤和乳腺。

演示这个程序的将是杰弗里·芬隆，一个专业的研究助理，从我的实验室。要准备从分离的肝细胞的单细胞悬浮液，首先用70%的乙醇喷洒给小鼠，并固定爪子到解剖板。使用解剖剪刀切割离动物的约一厘米的皮肤，并使用齿形钳将皮肤从身体中抬离。

在皮肤和内膜之间插入剪刀尖，打开剪刀分离组织，然后继续皮肤切口到颈部。将皮肤固定到每个前肢下和每个后肢上方的解剖板上，向上拉包头袋，将切口伸向颈部。抓住肝脏的叶，切在胸骨的下方，让肝脏周围解剖。

然后将器官转移到四毫升的点击的EHAA介质。使用手术刀将肝脏切成直径约一毫米的碎片，并消化在五百微升新鲜准备的消化液和五百微升的DNase 1。在三十七摄氏度下十五分钟后，使用五百毫升移液器将组织彻底混合，将容器再返回孵化器十五分钟。

在孵育结束时，通过一百微米过滤器将消化的样品转移到一个五十毫升的圆锥管中，然后使用一毫升注射器中的柱塞，通过网状体轻轻按压剩余的组织。用五毫升隔离缓冲液清洗过滤器，然后轻轻按压过滤器中剩余的组织。通过离心收集分离的肝细胞，并在四毫升红血球解液缓冲液中重新悬浮颗粒。

在室温下五分钟后，将细胞用十毫升的隔离缓冲液清洗，并计算血细胞仪上的细胞，以确定完整的肝脏计数。将颗粒重新悬浮在五毫升20%碘糖醇中，用一毫升PBS覆盖细胞悬浮液。通过密度梯度分离分离细胞，收获PBS和碘桑醇之间的层。

然后通过一百微米滤株过滤细胞，进入一个新的五十毫升锥形管。将细胞用10毫升的新鲜分离缓冲液清洗，并在PBS的500微升中重新悬浮产生的颗粒，并辅以2%的胎儿牛血清或FBS。计数后，等分约五倍十至第六非乳质细胞进入每个对照和实验井的96井板离心和重新悬浮在PBS加FBS每井90微升的颗粒。

将适当的实验和控制原抗体鸡尾酒添加到每口油井中，并用适当的生存能力标记染色所有油井。在这个程序中最重要的步骤是抗体的正确滴定和使用冰型控制和荧光-1控制，以验证染色。在摄氏四度下30分钟后，离心机用每井100微升PBS加FBS清洗细胞，将每个井的细胞转移到单独的5毫升圆底流细胞学管中，达到每管PBS加FBS的四百微升最终体积。

然后，使用少量细胞调整流式细胞仪上的激光和补偿设置，并读取每个管的所有事件。读取所有管后，将数据导入适当的流式细胞仪分析程序。基于负表达的活体标记染料的活细胞上的栅极。

基于细胞的大小和粒度及其生存能力标记染料表达的活细胞上的门，然后使用适当的等型控制和荧光-1数据对CD45阴性CD31阳性细胞群进行浇注，以确定阳性和负量。然后根据CD16/32和足二丁酮表达对CD45阴性CD31阳性细胞进行门控，以识别CD45阴性CD31阳性、CD16/32阴性足腺素阳性淋巴内皮，以及CD45阴性CD31阳性、CD16/32阳性足阴性肝胆内皮细胞群。强调内皮细胞表达淋巴血管和内皮催眠一，但不是CD146。

肝脏分离CD31阳性CD16/32阳性细胞分离，如证明也是CD146阳性和足科素阳性，而CD31阳性CD16/32阴性细胞主要是CD146阴性细胞，以及足科素阳性或阴性。根据荧光-1染色确定积极性。肝脏淋巴内皮细胞为CD146阴性，PDPN阳性。

血管内皮和穆林肝巨噬细胞都不表达足骨素。波多普兰宁染色也可用于区分胆管细胞和淋巴细胞体基于胆管的不同核结构以及细胞蛋白7染色。由于肝脏中只有淋巴内皮细胞共同表达血管内皮生长因子受体3和普罗斯佩罗家血箱蛋白1，这些标记可用于进一步确认肝脏淋巴内皮细胞种群的纯度。

在尝试此过程时，重要的是要记住快速工作并保持细胞在冰上。按照此过程，可以执行其他方法，如 LEC 群体的流动排序，以回答其他问题，如 LEC 的转录分析。这项技术开发后，为肝脏特异性淋巴生物学领域的研究人员探索淋巴如何影响小鼠和人类肝脏疾病铺平了道路。

一般来说，新方法的个体将挣扎，因为淋巴内皮细胞是肝脏中不常见、渐进的群体，需要快速进行。