Name: 小鼠肝脏消化对淋巴内皮细胞的流式细胞仪分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解使用胶原酶IV和DNase消化小鼠肝脏组织，结合流式细胞术分离淋巴内皮细胞的方法。该技术可在单细胞水平评估细胞表型与功能，适用于肝脏及其他组织的淋巴生物学研究。

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作者感谢胃肠道与肝脏先天免疫项目对本研究的资金支持。B.A.J.T. 还获得了 R01 AI121209 项目的资助。

本文所述所有方法均已获得科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1.&#160;材料的准备
<ol>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 mg/mL 的 DNase I 溶液。</li>
	<li>将 5,000 U/mL 的胶原酶 IV 加入 Click’s EHAA 培养基中，制备消化液。</li>
	<li>使用前将消化液在 37 °C 下预热 30 分钟。</li>
	<li>在 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）中加入 4.8% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），制备分离缓冲液。</li>
	<li>在蒸馏水（H2O）中加入 100 mM 氯化铵、10 mM KHCO3 和 0.1 mM EDTA，制备红细胞裂解缓冲液。</li>
</ol>
2. 小鼠肝脏单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>使用 CO2 和颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，使毛发湿润。将小鼠四肢用大头针固定于解剖板上。</li>
	<li>使用解剖剪在肛门上方约 1 cm 处剪开皮肤，注意仅切穿皮肤层（约 1 mm 深度）。用有齿镊将皮肤从体壁拉开，将剪刀插入皮肤与腹膜之间，撑开剪刀以分离皮肤与腹膜，然后从切口处向颈部方向剪开皮肤。</li>
	<li>在每侧腋下及每条腿上方用大头针将皮肤固定于解剖板上。提起腹膜囊并向颈部方向剪开。抓住肝脏叶，于胸骨稍下方剪开。 
	注意：若肝脏组织将用于免疫组织化学（IHC），操作时应格外小心。</li>
	<li>围绕肝脏剪开并将其从小鼠体内取出，放入 4 mL Click’s EHAA 培养基中。</li>
	<li>使用手术刀将肝脏切成直径约 1 mm 的小块。</li>
	<li>向肝脏组织中加入 500 µL 消化液混合物和 500 µL DNase I（2 mg/mL）。</li>
	<li>将肝脏在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育 15 分钟后，用 5 mL 移液器混匀液体。</li>
	<li>孵育 30 分钟后，将消化后的样品通过 100 µm 细胞筛过滤至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用 1 mL 注射器的推杆轻轻将残留组织块推过滤膜。</li>
	<li>用 5 mL 分离缓冲液冲洗滤膜，并用 1 mL 注射器推杆背面轻轻将组织推过细胞筛。重复此步骤，直至滤膜用 25 mL 分离缓冲液冲洗完毕。</li>
	<li>以 400 x g 离心 5 分钟，小心吸弃上清液。</li>
	<li>用 4 mL 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 10 mL 分离缓冲液洗涤细胞，并以 400 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定全肝细胞总数。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 mL 20% 碘克沙醇溶液中，并在其上方轻柔铺加 1 mL PBS。</li>
	<li>以 300 x g 离心 15 分钟，不启用刹车。</li>
	<li>收集 PBS 与碘克沙醇之间的界面层，通过 100 µm 细胞筛转移至新的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用 10 mL 分离缓冲液洗涤细胞，并以 400 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于含 2% 胎牛血清（FBS）的 500 µL PBS 中。</li>
</ol>
3.&#160;肝脏单细胞的流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用血细胞计数板和显微镜对细胞进行计数，采用台盼蓝排斥法检测活细胞。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，立即加入血细胞计数板，在显微镜下计数未染色（非蓝色）的活细胞。随后计算每微升中的细胞数量。</li>
	<li>将约500万个剩余的非实质细胞分装至96孔板的一个孔中。</li>
	<li>以 400 x g 离心细胞 g 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于90 µL含2% FBS的PBS中。</li>
	<li>加入用10 µL 10x 2.4G2或抗-CD16/32（1:200）稀释的抗-CD45（1:200）、抗-CD146（1:200）、抗-CD31（1:200）和PDPN（1:200）。 
	注意： 使用抗CD16/32标记抗体时未使用Fc阻断剂（2.4G2）。</li>
	<li>为确定阳性与阴性门控的设置位置，应针对每种荧光染料设置荧光减一（FMO）对照，并使用同型对照抗体。</li>
	<li>确定活细胞 与 死细胞，使用活力标记物（如 Ghost Red 780）染色。4 °C 下孵育细胞 30 分钟。</li>
	<li>用含 2% FBS 的 PBS 100 µL 洗涤细胞。</li>
	<li>使用少量细胞调整流式细胞仪的激光和补偿设置。用针对每种单独荧光染料的抗体以及不加任何抗体的对照对细胞进行染色。 
	注意： 根据所使用的流式细胞仪，应建立补偿矩阵以消除光谱重叠。</li>
	<li>将样本管置于细胞仪探针上，收集并记录所有事件。</li>
</ol>
4.&#160;数据分析
<ol>
	<li>观察侧向散射面积 与 前向散射面积，根据细胞大小、颗粒度及活细胞标记染料对“活细胞”设门。</li>
	<li>接下来，使用CD45 Brilliant Violet 510和CD31 PerCp Cy5.5，结合同型对照和荧光减一对照（FMO）设门，圈定CD45- CD31+细胞群，以确定阳性与阴性细胞群体。</li>
	<li>最后，使用 CD146 v450 或 CD16/32 FITC 与 PDPN APC，结合同型对照和荧光减一对照（FMO）设门，分选 CD146- PDPN+ 或 CD16/32- PDPN+ 细胞，以确定阳性与阴性细胞群。这些细胞即为淋巴管内皮细胞（LECs）。</li>
</ol>

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<li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospero-related+homeobox+1+%28Prox1%29+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development%2C+injury+and+regeneration%2C+and+is+absent+from+%22oval+cells%22%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li>
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<li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li>
<li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li>
<li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphatic+System%3A+Integral+Roles+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li>
<li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+system+in+body+homeostasis%3A+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，淋巴管内皮细胞（LECs）在免疫稳态与免疫调节中的整体重要性逐渐被揭示25。目前已发表的关于淋巴系统的文献大多集中于皮肤和淋巴结；然而，淋巴系统遍布全身26，因此我们有必要深入理解其在不同器官中的作用。本文介绍了一种可在单细胞水平上研究肝脏中淋巴管内皮细胞的方法，以更深入地了解这些细胞同时表达的不同表面标志物、细胞因子、趋化因子以及转录因子等细胞内蛋白的情况。该方法将有助于未来研究在健康与疾病状态下肝脏中淋巴管内皮细胞的表型与功能。
在肝脏中鉴定肝内淋巴管内皮细胞（LECs）的一个难点在于，与其他细胞类型相比，其频率相对较低。肝细胞约占肝脏细胞总数的80%，因此在对肝脏样本进行流式细胞术分析前，使用密度梯度（碘克沙醇）去除肝细胞可节省时间，从而获得更好的细胞活性。为了将肝脏中表达LYVE1的LECs与表达LYVE1的肝窦内皮细胞（LSECs）区分开来，我们利用了LSECs表达而LECs表达水平很低或不表达的标记物CD16/32和CD146。结合肝脏中其他内皮细胞几乎不表达或低表达...

肝内淋巴管及淋巴管内皮细胞（LECs）的作用尚不明确。尽管已发现淋巴管存在于肝脏门管区1，并在疾病过程中发生扩张2，但关于肝内 LECs 的功能及其表型特征仍知之甚少。随着主要表达于 LECs 上的标志物被发现3，这些细胞在不同组织微环境中的稳态与疾病状态下的重要性将填补我们认知中的一个重要空白。LECs 在淋巴结及转移性肿瘤中通过直接与 T 细胞相互作用，在维持外周耐受中发挥关键作用4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。淋巴结中的 LECs 还可通过与迁移性树突状细胞的相互作用促进保护性免疫应答14,15,16。因此，LECs 的多种功能可能与其所处的特定组织环境及相互作用对象密切相关。然而，目前对 LECs 如何在组织中与免疫细胞相互作用，以及其在不同器官系统中的功能仍了解甚少；因此，对肝脏或其他器官中 LECs 进行单细胞水平的分析，可能推动我们对 LECs 调控组织特异性免疫机制的理解。尽管目前多数关于肝内 LECs 的研究主要依赖显微镜技术，通过一至两种标志物及形态学特征进行观察17，但极少有研究采用流式细胞术对 LECs 进行单细胞水平的特异性分析，仅有一项研究比较了肝窦内皮细胞（LSECs）与 LECs 的差异18。通过流式细胞术对肝脏中 LEC 群体进行分析，有助于深入研究其在正常稳态或疾病状态下的表型特征。
为了通过流式细胞术评估淋巴管内皮细胞（LEC），需要多种表面标志物。通常，可通过显微镜观察 prospero 相关同源框 1（Prox-1）、淋巴管内皮透明质酸受体 1（LYVE1）或血管内皮生长因子受体 3（VEGFR3）的表达来识别 LEC。然而，在肝脏中，这些标志物的表达并不局限于 LEC。Prox-1 在肝发育、再生和损伤过程中被肝细胞广泛表达19，而 LYVE1 和 VEGFR3 则由肝窦内皮细胞表达18。在淋巴结中，LEC 可通过流式细胞术鉴定为分化簇（CD）CD45-、CD31+ 和 podoplanin+（PDPN）的细胞群16。然而，该方法在肝脏中用于分离 LEC 时过于简单，因为 CD45- CD31+ 细胞群会包含内皮细胞，而肝脏中占主导地位的血管内皮细胞为肝窦内皮细胞（LSEC）。因此，需要其他标志物来区分稀有的 LEC 群体与丰富的 LSEC 群体。CD16/32（由成熟 LSEC 表达18）和 CD146（一种常见的血管内皮细胞标志物，在肝脏中主要由肝窦内皮细胞在肝窦内表达20，而淋巴管内皮细胞几乎不表达或完全不表达21）均为候选标志物。
因此，我们优化了一种利用上述标记物CD45、CD31、CD146、CD16/32和PDPN通过流式细胞术分离和可视化肝脏淋巴管内皮细胞（LECs）的方法。我们描述了使用胶原酶IV、DNase 1及机械分离法将肝组织消化为单细胞悬液的操作步骤。我们还介绍了采用碘克沙醇密度梯度法分离非实质细胞（NPC）并去除细胞碎片的方法。最后，通过多种标记物的联合使用，我们确定了以PDPN为主要标志物，从肝脏中鉴定LECs的最优流式细胞术设门策略。

<table><tbody><tr><td>Clicks/EHAA 培养基</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Worthington Biochemical corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical corporation</td><td>LS002145</td><td>脱氧核糖核酸酶 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>V450 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1）</td><td>BD biosciences</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1）</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>异硫氰酸荧光素（FITC）</td></tr><tr><td>Pacific Blue 抗小鼠 CD31（克隆 390）</td><td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD31（克隆 390）</td><td>Biolegend</td><td>102420</td><td>多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5）</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 PDPN（克隆 8.1.1）</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>别藻蓝蛋白（APC），podoplanin（PDPN）</td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 CD16/32（克隆 93）</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>异硫氰酸荧光素（FITC）</td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD16/32（克隆 93）</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5）</td></tr><tr><td>ghost red 780 活性染料</td><td>TONBO biosciences</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC 仓鼠 IgG（克隆 SHG-1）</td><td>Biolegend</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 大鼠 IgG2a（克隆 RTK2758）</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠 IgG2（克隆 eBR2a）</td><td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 LYVE1（克隆 223322）</td><td>R&amp;D systems</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠细胞角蛋白（克隆 EPR17078）</td><td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80（克隆 Cl:A3-1）</td><td>Bio-rad</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA（V 组分）</td><td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>牛血清白蛋白（BSA）</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>乙二胺四乙酸（EDTA）—用于红细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fischer</td><td>A687-500</td><td>用于红细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Fischer</td><td>P184-500</td><td>用于红细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Fischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>本实验室/ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FC 阻断剂，用于抑制非特异性结合至 Fc gamma 受体阳性细胞——由杂交瘤制备</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液枪头</td><td>USA scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 移液枪头</td><td>USA scientific</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液枪头</td><td>USA scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>血清学 10 mL 移液管</td><td>greiner bio-one</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>血清学 5 mL 移液管</td><td>greiner bio-one</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Fischer</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II 流式细胞仪</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>临床离心机</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>型号 X-14R</td></tr></tbody></table>

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

在肝脏中，淋巴管位于门管区，其已知功能是将肝内的组织液引流至淋巴结，在那里对细胞碎片和抗原进行监测。我们非常关注淋巴脉管系统在肝脏炎症及免疫细胞功能中可能发挥的作用。然而，目前关于分离肝脏淋巴管内皮细胞（LECs）的消化方案，或用于在单细胞水平评估肝脏 LECs 的特异性标志物的研究报道极少。因此，我们优化了一种用于肝脏消化和染色的方法，以评估肝脏中 LEC 群体。我们相信，本文所述方法将有助于识别和分离肝脏中的 LECs，并加深我们对 LECs 如何响应肝脏微环境的理解。

目前对肝脏淋巴管的研究主要采用免疫组织化学方法来定量分析肝脏中淋巴管的数量和直径。然而，该方法无法在单细胞水平上评估淋巴管内皮细胞（LEC），也无法检测多种标志物、细胞因子、趋化因子或转录因子的表达。因此，我们探讨了是否可从肝脏中分离出LEC，并通过流式细胞术进行分析。既往分离淋巴结LEC的研究采用Liberase DL（胶原酶I-II-分散酶）联合DNase 1，并结合针头机械解离淋巴结组织的方法14,16。因此，本研究尝试在肝组织上使用相同的消化方案，或采用之前用于从肝脏中分离免疫细胞的胶原酶IV和DNase 1方案22，并在消化后加入密度梯度离心（碘克沙醇）步骤，以去除肝细胞并提高肝脏中其他细胞类型的相对比例（图1A）。肝脏组织经消化并使用密度梯度离心后，细胞使用CD45、CD31、PDPN和CD16/32进行染色。已有文献报道CD16/32在...

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。

在肝脏中，淋巴管位于门管区，其已知功能是将肝内的组织液引流至……

该方法有助于解答淋巴系统和肝脏研究领域中的关键问题，例如淋巴管内皮细胞（LEC）如何响应特定刺激，以及这种反应如何参与疾病的发生发展。该技术的主要优势在于，我们能够以单细胞水平评估肝脏淋巴管内皮细胞的表型和功能，并可在细胞分选后用于下游应用。尽管该方法可用于研究肝脏淋巴管生物学特性，也可用于评估来自其他组织（如皮肤和乳腺）的淋巴管内皮细胞。演示该实验步骤的是来自我实验室的专业研究助理 Jeffrey Finlon。要从分离的肝细胞制备单细胞悬液，首先用70%乙醇喷洒小鼠，并将其四肢固定在解剖板上。使用解剖剪在肛门上方约1厘米处剪开皮肤，再用有齿镊将皮肤从身体上提起。将剪刀尖插入皮肤与腹膜之间，张开剪刀分离组织，然后继续沿皮肤切口向上至颈部。在每侧前肢下方及每侧后肢上方将皮肤固定于解剖板上，并向上牵拉腹膜囊，使切口向颈部延伸。抓住肝脏叶，于胸骨稍下方剪开，以便围绕肝脏进行解剖。然后将器官转移至4 mL Click's EHAA培养基中。使用手术刀将肝脏切成直径约1 mm的组织块，并将其放入500 µL新配制的消化液和500 µL DNase 1中进行消化。在37°C条件下孵育15分钟后，使用500 µL移液器充分混匀组织，再将容器放回培养箱继续孵育15分钟。孵育结束后，将消化后的样品通过一个孔径为100微米的滤网转移至一个50毫升的锥形管中，并使用1毫升注射器的推杆轻轻将残留的组织块压过滤网。用5毫升分离缓冲液洗涤滤网，并轻轻将任何残留的组织压过滤网。通过离心收集分离的肝细胞，并将沉淀重悬于4毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育5分钟后，用10毫升分离缓冲液洗涤细胞，并在血细胞计数板上计数细胞，以确定全肝脏细胞数量。将细胞沉淀重悬于5毫升20%碘克沙醇溶液中，再在细胞悬液上方覆盖1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。通过密度梯度离心分离细胞，收集PBS与碘克沙醇之间的界面层。然后将细胞通过一个100 µm的滤网过滤至新的50 mL离心管中。用10 mL新鲜分离缓冲液洗涤细胞，并将所得沉淀重悬于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加2%胎牛血清（FBS）。计数后，将约5 × 10⁶个非实质细胞分装至96孔板的每个对照孔和实验孔中，进行离心，并将各孔的沉淀重悬于90 µL PBS加FBS中。向每个孔中加入适当的实验组和对照组一抗混合物，并使用合适的活率标记物对所有孔进行染色。该实验步骤中最关键的环节是抗体的正确滴定，以及使用冰上对照和荧光-1对照来验证染色效果。在4°C孵育30分钟后，每孔加入100 µL含FBS的PBS缓冲液离心洗涤细胞，然后将每孔的细胞分别转移至独立的5 mL圆底流式细胞术管中，每管最终体积为400 µL含FBS的PBS缓冲液。然后，使用少量细胞在流式细胞仪上调整激光和补偿设置，并读取每管中的所有事件。所有样本管读取完毕后，将数据导入合适的流式细胞术分析软件。根据活性标记染料对活细胞设门，阴性表达视为活细胞。根据细胞的大小、粒度及其活力标记染料的表达情况对活细胞进行设门，随后利用相应的同型对照和荧光-1数据对CD45阴性CD31阳性细胞群进行设门，以确定阳性与阴性细胞群。接着，根据CD45阴性CD31阳性细胞的CD16/32和podoplanin表达情况进一步设门，从而鉴定出CD45阴性CD31阳性、CD16/32阴性podoplanin阳性淋巴管内皮细胞群，以及CD45阴性CD31阳性、CD16/32阳性podoplanin阴性肝窦内皮细胞群。淋巴管内皮细胞表达淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1），但不表达CD146。如所示方法分离的肝脏CD31阳性且CD16/32阳性的细胞也表达CD146和podoplanin，而CD31阳性但CD16/32阴性的细胞主要为CD146阴性，且podoplanin可为阳性或阴性。阳性判断基于荧光-1染色结果。肝脏淋巴管内皮细胞为CD146阴性、PDPN阳性。血管内皮细胞和小鼠肝脏巨噬细胞均不表达podoplanin。根据胆管独特的细胞核结构以及细胞角蛋白7染色结果，podoplanin染色还可用于区分胆管上皮细胞与淋巴管。由于在肝脏中仅有淋巴管内皮细胞共表达血管内皮生长因子受体3和Prospero同源框蛋白1，因此这些标志物可进一步用于验证分选所得肝脏淋巴管内皮细胞群体的纯度。在进行该操作时，重要的是要记住快速操作，并将细胞保持在冰上。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，例如对肝淋巴管内皮细胞（LEC）群体进行流式分选，以回答更多科学问题，如LEC的转录谱分析。该技术建立后，为肝脏特异性淋巴生物学领域的研究人员探索淋巴系统如何影响小鼠和人类肝脏疾病奠定了基础。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为肝内淋巴管内皮细胞数量稀少且增殖缓慢，且该方法需要快速完成。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠肝脏消化对淋巴内皮细胞的流式细胞仪分析

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。...

小鼠主动脉内免疫细胞的流式细胞术分析

由于人们日益认识到肠道淋巴细胞在多种肠道及全身性疾病中发挥着关键作用，对这些细胞进行定量表征的研究兴趣不断增长。在本方案中，我们描述了如何从小肠不同区室中分离单细胞群体，以用于后续的流式细胞术分析。...

小鼠小肠淋巴细胞的分离与流式细胞术表征

肝脏损伤伴随前体细胞的扩增，这些前体细胞构成一个异质性的细胞群体。对该细胞区室进行新的分类，有助于区分多个细胞亚群。本文所述方法展示了通过流式细胞术分析及高纯度分离各类亚群的技术流程，所获细胞可用于后续多种实验分析。...

利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

本文介绍了一种简单且可靠的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导啮齿类动物模型，通过非SPF级动物饲养环境并给予特定高脂饮食实现。我们描述了在暴露于环境微生物的小鼠中鉴定肝脏和脂肪组织免疫细胞亚群的方法，以模拟人类的免疫学状态。...

一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型

本方案提供了一种将完整眼球消化为单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析，以鉴定特定的眼部单核吞噬细胞群体，包括单核细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞。...

小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

本研究中，我们提供了一种高效且可重复的小鼠呼吸系统免疫细胞群体分离方案。同时，我们还介绍了一种利用基于9色流式细胞术的检测...

小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

本实验方案详细描述了一种用于分离小鼠十二指肠内营养物质灌注后流动的肠淋巴液的外科手术方法。该方法可用于生理条件下测定总肠道脂质吸收以及乳糜微粒的合成与分泌情况，以响应不同实验性营养物质的刺激。...

小鼠肠系膜引流淋巴液的分离与定量 在体 内 膳食脂质吸收与乳糜微粒分泌的动力学

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析...

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

本方案详细描述了从小鼠肺组织中分离稳态及流感病毒感染后活体免疫细胞和非免疫细胞群体的方法。同时提供了用于鉴定上皮细胞和髓系细胞亚群的设门策略。...

从小鼠肺组织中分离活体髓系细胞和上皮细胞群体

了解使用胶原酶IV和DNase消化小鼠肝脏组织，结合流式细胞术分离淋巴内皮细胞的方法。该技术可在单细胞水平评估细胞表型与功能，适用于肝脏及其他组织的淋巴生物学研究。

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

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