小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

该方法有助于解答淋巴系统和肝脏研究领域中的关键问题，例如淋巴管内皮细胞（LEC）如何响应特定刺激，以及这种反应如何参与疾病的发生发展。该技术的主要优势在于，我们能够以单细胞水平评估肝脏淋巴管内皮细胞的表型和功能，并可在细胞分选后用于下游应用。尽管该方法可用于研究肝脏淋巴管生物学特性，也可用于评估来自其他组织（如皮肤和乳腺）的淋巴管内皮细胞。

演示该实验步骤的是来自我实验室的专业研究助理 Jeffrey Finlon。要从分离的肝细胞制备单细胞悬液，首先用70%乙醇喷洒小鼠，并将其四肢固定在解剖板上。使用解剖剪在肛门上方约1厘米处剪开皮肤，再用有齿镊将皮肤从身体上提起。

将剪刀尖插入皮肤与腹膜之间，张开剪刀分离组织，然后继续沿皮肤切口向上至颈部。在每侧前肢下方及每侧后肢上方将皮肤固定于解剖板上，并向上牵拉腹膜囊，使切口向颈部延伸。抓住肝脏叶，于胸骨稍下方剪开，以便围绕肝脏进行解剖。

然后将器官转移至4 mL Click's EHAA培养基中。使用手术刀将肝脏切成直径约1 mm的组织块，并将其放入500 µL新配制的消化液和500 µL DNase 1中进行消化。在37°C条件下孵育15分钟后，使用500 µL移液器充分混匀组织，再将容器放回培养箱继续孵育15分钟。

孵育结束后，将消化后的样品通过一个孔径为100微米的滤网转移至一个50毫升的锥形管中，并使用1毫升注射器的推杆轻轻将残留的组织块压过滤网。用5毫升分离缓冲液洗涤滤网，并轻轻将任何残留的组织压过滤网。通过离心收集分离的肝细胞，并将沉淀重悬于4毫升红细胞裂解缓冲液中。

室温孵育5分钟后，用10毫升分离缓冲液洗涤细胞，并在血细胞计数板上计数细胞，以确定全肝脏细胞数量。将细胞沉淀重悬于5毫升20%碘克沙醇溶液中，再在细胞悬液上方覆盖1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。通过密度梯度离心分离细胞，收集PBS与碘克沙醇之间的界面层。

然后将细胞通过一个100 µm的滤网过滤至新的50 mL离心管中。用10 mL新鲜分离缓冲液洗涤细胞，并将所得沉淀重悬于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加2%胎牛血清（FBS）。计数后，将约5 × 10⁶个非实质细胞分装至96孔板的每个对照孔和实验孔中，进行离心，并将各孔的沉淀重悬于90 µL PBS加FBS中。

向每个孔中加入适当的实验组和对照组一抗混合物，并使用合适的活率标记物对所有孔进行染色。该实验步骤中最关键的环节是抗体的正确滴定，以及使用冰上对照和荧光-1对照来验证染色效果。在4°C孵育30分钟后，每孔加入100 µL含FBS的PBS缓冲液离心洗涤细胞，然后将每孔的细胞分别转移至独立的5 mL圆底流式细胞术管中，每管最终体积为400 µL含FBS的PBS缓冲液。

然后，使用少量细胞在流式细胞仪上调整激光和补偿设置，并读取每管中的所有事件。所有样本管读取完毕后，将数据导入合适的流式细胞术分析软件。根据活性标记染料对活细胞设门，阴性表达视为活细胞。

根据细胞的大小、粒度及其活力标记染料的表达情况对活细胞进行设门，随后利用相应的同型对照和荧光-1数据对CD45阴性CD31阳性细胞群进行设门，以确定阳性与阴性细胞群。接着，根据CD45阴性CD31阳性细胞的CD16/32和podoplanin表达情况进一步设门，从而鉴定出CD45阴性CD31阳性、CD16/32阴性podoplanin阳性淋巴管内皮细胞群，以及CD45阴性CD31阳性、CD16/32阳性podoplanin阴性肝窦内皮细胞群。淋巴管内皮细胞表达淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1），但不表达CD146。

如所示方法分离的肝脏CD31阳性且CD16/32阳性的细胞也表达CD146和podoplanin，而CD31阳性但CD16/32阴性的细胞主要为CD146阴性，且podoplanin可为阳性或阴性。阳性判断基于荧光-1染色结果。肝脏淋巴管内皮细胞为CD146阴性、PDPN阳性。

血管内皮细胞和小鼠肝脏巨噬细胞均不表达podoplanin。根据胆管独特的细胞核结构以及细胞角蛋白7染色结果，podoplanin染色还可用于区分胆管上皮细胞与淋巴管。由于在肝脏中仅有淋巴管内皮细胞共表达血管内皮生长因子受体3和Prospero同源框蛋白1，因此这些标志物可进一步用于验证分选所得肝脏淋巴管内皮细胞群体的纯度。

在进行该操作时，重要的是要记住快速操作，并将细胞保持在冰上。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，例如对肝淋巴管内皮细胞（LEC）群体进行流式分选，以回答更多科学问题，如LEC的转录谱分析。该技术建立后，为肝脏特异性淋巴生物学领域的研究人员探索淋巴系统如何影响小鼠和人类肝脏疾病奠定了基础。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为肝内淋巴管内皮细胞数量稀少且增殖缓慢，且该方法需要快速完成。