利用三维动态培养系统构建多层间充质干细胞片

干细胞治疗已被广泛报道为多种疾病的有前景的治疗方法。同时，细胞片技术也已得到发展，以提高细胞在靶组织中的滞留率和存活率。在构建细胞片的过程中，营养供应不足仍是导致干细胞功能丧失的关键问题，而干细胞特性不佳最终会影响其在体内的治疗效果。

为了制备可应用的多层干细胞片产品，我们的团队开发了细胞化的极性化心包膜及细胞片支架。基于该支架，可通过九肽氢键快速构建多层细胞起始结构，并采用动态灌注系统以确保干细胞在体外的营养供应。取出一个干燥的DBP支架，将其置于黑色基座中央。

将白色张力环置于脱细胞真皮基质（DBP）支架上，并将其固定在组织载体中。确保脱细胞真皮基质（DBP）支架完全固定于组织载体内。在脱细胞真皮基质（DBP）支架上加入 100 µL 培养基。

将支架放入37摄氏度的培养箱中，浸泡15分钟。从培养箱中取出细胞，弃去培养皿中的培养基，用2毫升预热的PBS轻轻洗涤细胞。移除培养皿中所有的PBS，确保无液体残留。

向培养皿中加入2毫升1.25%的胰蛋白酶溶液，将细胞孵育3分钟。加入2毫升培养基以终止胰蛋白酶的作用。轻柔地将细胞从培养皿中冲洗下来。

将细胞悬液转移至新的15毫升离心管中。在220 × g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液，并吸除残留的细胞沉淀。

用3毫升10%蔗糖溶液重悬细胞。吸取10微升细胞悬液，用血细胞计数板测定细胞数量，取300万个细胞转移至新的1.5毫升离心管中。以220 × g离心5分钟，彻底去除上清液，收集细胞沉淀。

制备20 µL 10%蔗糖溶液。轻柔地重悬细胞，获得均匀的细胞悬液。在悬液顶部加入20 µL多肽水凝胶，轻轻混合多肽水凝胶与细胞悬液，用T形管取出DBP支架，保留组织载体，然后用T形管轻柔吸取结石中段。将混合物吸取后均匀滴加至DBP支架上。

向组织载体底部加入1毫升钙依地酸。在培养皿中轻轻加入4毫升培养基，然后将细胞片浸入其中。将细胞放入培养箱中培养两小时。

动态灌注系统包括一个灌注培养容器、气体交换排泄物和一个玻璃瓶。组件如图所示，为动态灌注系统。在玻璃瓶中加入两毫升培养基。

将细胞片插入培养容器的腔室中，向容器内加入三毫升培养基，将动态灌注系统放入培养箱中，并启动泵。在双阳性卧位下打开培养容器。从培养容器中取出细胞片，并将其放入培养皿中。

使用一把镊子固定组织载体，另用两把镊子将白色张力环与黑色底部分离。最后获得多层细胞片。DBP支架呈透明状。

扫描电镜结果表明，细胞被完全捕获且组分保持完整。细胞片可通过镊子夹取并进行短期保存。这些细胞片可转移至1.5毫升圆柱形离心管中。

例如，作为模型，起始细胞显示出骨髓来源的成纤维细胞集落（BMFC）对干细胞标志物CD 90和CD 29呈强阳性。在细胞构建后，BMFC离开细胞片层时仍保持较高的CD 90和CD 29表达水平。构建多层细胞结构是该实验方案的关键步骤。

当pH值从酸性（SA）变为中性时，泛时需要四种水凝胶，因此用蔗糖溶液洗涤细胞以去除表面离子非常重要。此外，细胞悬液与泛四氢凝胶的体积比不利于构建临时的多层结构。在三维干细胞结构形成后，您会发现动态灌注系统对于稳定多层结构以及维持干细胞活力至关重要。

动态灌注培养基可促进干细胞增殖，并在多层结构中扩展细胞微环境；同时，应根据不同类型的干细胞调整动态培养的温度条件。