利用pDawn-Ag43实现高分辨率图案化生物膜沉积

我们开发了一种名为生物膜光刻的技术，该技术可将光线照射到表面，细菌会在有光的区域聚集。该方法将有助于我们回答生物膜研究中的关键问题，例如，空间结构如何影响群落功能。该技术具有诸多优势。

例如，该方法具有高达25微米的高分辨率，无需表面预图形化处理，且可在封闭的微流控装置内部进行。尽管该方法可为天然生物膜的结构-功能关系提供深入见解，也可应用于其他领域，如生物膜工程、生物材料以及多细胞合成生物学。在进行生物膜图形化之前，需要完成光学培养装置和细菌样品的关键预处理步骤，因此对该方法的可视化演示至关重要。

首先，将 pDawn-Ag43 质粒转化至目标大肠杆菌菌株中，并涂布于添加了壮观霉素的 LB 琼脂平板上。挑取单克隆接种于含有壮观霉素的 LB 液体培养基中，在培养管中于 250 rpm、37 °C 条件下的摇床中培养至对数生长期。接种后，通过在冻存管中将 1 mL 50% 无菌甘油与 1 mL 菌液混合，制备 pDawn-Ag43 转化菌株的 25% 甘油保存液。

将储备液保存在-80摄氏度的冰箱中。接下来，开始准备光学装置：将便携式投影仪放置在细菌培养箱底部，使投影孔径正对上方天花板，生物膜培养室将固定在该位置。通过显示电缆将笔记本电脑与培养箱内的投影仪连接。

使用胶带将一个空的假培养皿固定在培养箱的顶部。通过旋转投影仪的调焦旋钮来调整焦距，使焦平面与固定在培养箱顶部的生物膜培养皿的底面重合。投影仪应在培养皿底部投射出清晰、无模糊的图像。

优化投影后，取下虚拟培养皿。使用笔记本电脑软件，通过显示全蓝色幻灯片，使投影仪以最大蓝光照射整个视野。将光探测器探头置于培养箱顶部，使用光学功率计测量投影仪的光照强度，并读取对应功率计上针对460纳米波长光校准的强度数值。

接下来，通过调节位于投影仪孔径处的可调中性密度滤光片来调整光照强度。旋转滤光片，直至功率计测得的蓝光照射区域中心的光照强度为50微瓦每平方厘米。必须使用位于培养箱顶部的校准过的光电探测器，确保光照强度设定在适当的水平。

通过旋转中性密度滤光片，可精确调节光照强度。现在使用笔记本电脑上的投影演示软件绘制任意图案，并通过投影仪将这些图案投射到培养箱的顶部。在光照处理前，将含有pDawn-Ag43质粒的菌株从甘油保存液中划线接种至LB加链霉素的琼脂平板上。

在 37 摄氏度下培养过夜，使菌落生长。从琼脂平板上挑取一单菌落接种于含链霉素的 LB 培养基（LB-plus-spec 培养基）中，于 37 摄氏度、250 rpm 摇床培养箱中振荡培养过夜至稳定期。次日，用含链霉素的 LB 培养基按 1:1,000 的比例稀释菌液进行继代培养。

将稀释后的培养物置于摇床培养箱中，在 250 rpm、37 摄氏度条件下培养 6 小时，直至对数后期或稳定期初期。在光照诱导前，必须对过夜培养物进行稀释，并使其生长至对数后期。这一步骤可确保细菌在诱导时处于稳定且健康的活跃状态。

孵育结束后，用预先准备好的M63培养基将处于对数生长后期的培养物按1:100的比例进行稀释，该培养基需添加50 µg/mL的壮观霉素。然后，将稀释后的菌液接种至生物膜培养皿中。由于样品现已准备好进行光照处理，需将培养皿用胶带固定在培养箱的顶部，确保培养皿底部表面透明，以便由下方的投影仪进行光照。

生物膜样本过夜培养后，从培养箱中取出培养皿。培养皿底部被光照区域会附着生物膜细菌，而液体培养基中则含有悬浮生长的浮游细菌。通过移除培养皿中的液体培养基，弃去浮游细菌。

接下来，用 PBS 轻柔地吹打冲洗样品两次，以去除残留的浮游细胞，随后进行抽吸。如果细胞带有荧光标记，可直接使用荧光显微镜对样品成像。如图所示，采用 pDawn-Ag43 细菌在聚苯乙烯孔板中生成生物膜，并通过投影仪照射实现图案化。

可使用结晶紫染色法对生物膜进行可视化观察，或者在使用荧光标记细菌时通过荧光显微镜进行观察。荧光标记的生物膜样本还可通过共聚焦显微镜成像，以获得生物膜的三维图像。通过使用薄膜光掩模对生物膜样本提供图案化光照，可实现高分辨率的图案化。

此处展示了在玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面以及封闭的PDMS培养腔室中进行图案化的示例，说明了pDawn-Ag43图案化技术可应用的不同类型环境。在实施该实验流程时，首先需将pDawn-Ag43质粒转化至目标菌株中，随后正确聚焦并校准投影仪，最后按照规定的培养和回稀步骤处理细菌，以准备光照实验。采用该方法后，还可进一步开展其他技术操作，例如在不同培养条件下长期监测生物膜的形成。

通过这种方式，我们可以理解生物膜结构如何影响其功能。该技术将具有广泛的应用性，例如在合成生物学和材料研究领域，可被用于设计和构建具有多种应用功能的生物膜。