Name: 使用 pDawn-Ag43 的高分辨率图案生物膜沉积 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习使用光控生物膜光刻技术对大肠杆菌进行高分辨率图案化沉积。该方法无需表面预图案化即可在封闭流体装置中实现25微米精度的生物膜制备，为研究生物膜空间结构与群落功能关系提供了直观的技术手段。

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作者感谢 D. Glass、H. Kim、N. Cira、A. Choksi、S. Rajan 和 B. Keys 提出的宝贵建议，并感谢 Spormann 实验室提供共聚焦显微镜的使用权限。此外，作者还感谢斯坦福 Bio-X Bowes 奖学金、NSERC PGS 奖学金、美国国立卫生研究院（R21-AI-139941）以及美国癌症协会（RSG-14-177-01）提供的支持。

1. pDawn-Ag43 菌株的制备
<ol>
	<li>将 pDawn-Ag43 转化至 E. coli 中 大肠杆菌 感兴趣的菌株（图1).
	<ol>
		<li>接种含有 pDawn-Ag43 质粒（可从质粒库获取）的克隆菌株于添加 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37 °C、220 rpm 振荡培养过夜 &#956;g/mL 链霉素（LB+spec）于培养管中（在摇床培养箱中约 250 rpm、37℃ 过夜培养） &#176;C）。然后，使用质粒小提试剂盒提取纯化的 pDawn-Ag43 质粒10.</li>
		<li>选择一个 大肠杆菌 待测菌株的图案化。迄今为止，pDawn-Ag43 已在 MG1655 中验证有效3 和 BW25113。</li>
		<li>使用已确立的方案制备感受态（例如，化学感受态11 或电转感受态12) 所选菌株的保藏 大肠杆菌 菌株（例如，MG1655）</li>
		<li>将 pDawn-Ag43 质粒转化至感受态细菌中11,12，随后恢复培养1小时，并接种到平板&#160;在 LB+spec 琼脂平板上培养，37 °C 过夜培养 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存经 pDawn-Ag43 转化的菌株。
	<ol>
		<li>从LB+spec琼脂平板上挑取单个pDawn-Ag43菌落，接种至含有LB+spec液体培养基的培养管中，并于摇床培养箱中（约250 rpm，37℃）培养 &#176;C）至对数生长期（OD600 ~0.4 - 0.8）。</li>
		<li>制备用于在 -80 ℃ 保存 pDawn-Ag43 转化菌株的冻存液 &#176;将1 mL培养物与1 mL 50%无菌甘油在冻存管中混合，配制成终浓度为25%甘油的冻存液，于-80 ℃保存 &#176;C 冷冻箱</li>
		<li>如果需要额外的质粒（例如，荧光报告质粒）需要转化，制备感受态细胞11,12 从 pDawn-Ag43 转化菌株中提取并重复转化过程11,12 根据需要添加其他质粒。 
		注意：如果使用电穿孔8可以同时共转化多个质粒（包括 pDawn-Ag43）；然而，不建议在化学转化方法中进行 simultaneous 转化，因为质粒过大（&#62; pDawn-Ag43 的 10 kB 大小意味着转化效率降低。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备用于照射细菌的投影仪光学装置
<ol>
	<li>获取一个具有不透明壁且带有用于穿过电缆的孔洞的细菌培养箱、一个可放入并能在细菌培养箱内正常工作的便携式投影仪，以及一台配备有演示投影软件的笔记本电脑（参见 材料清单选择投影仪和培养箱时，应确保投影仪的最小焦距小于培养箱内部的高度。</li>
	<li>将投影仪放置在培养箱底部，其孔径正对上方天花板，即生物膜培养室的附着位置（图2).</li>
	<li>使用光学面包板作为底座，连接垂直立柱，再连接水平横杆，将投影仪固定在横杆上，从而将其稳固安装图2注意，此装置可根据投影仪/可用部件进行调整。关键要求是将投影仪牢固地固定在培养箱底部附近，且其光圈朝上。</li>
	<li>连接笔记本电脑 通过 显示电缆（例如，HDMI）连接至培养箱内的投影仪。</li>
	<li>如果培养箱内部的表面——尤其是顶部——具有反射性（例如，金属抛光表面），用暗色哑光表面覆盖以尽量减少反射。</li>
	<li>使用胶带将一个空的“假”培养皿固定在培养箱的顶部。注意，与投影仪类似，有多种可接受的方法用于固定培养皿；需确保培养室透明的底部表面（光照发生处）未被遮挡。</li>
	<li>通过旋转投影仪的调焦旋钮来调整焦距，使焦平面与生物膜培养皿的底面重合例如，一个连接到培养箱顶部的孔板）图2投影仪应将清晰、不模糊的图像投射到培养皿底部。投影优化后，移除“假”培养皿。</li>
	<li>使用笔记本电脑软件，控制投影仪以最大强度的蓝光照射整个视野例如，RGB = [0, 0, 255]）通过显示全蓝色幻灯片实现。</li>
	<li>使用光学功率计测量投影仪的光照强度，将光电探测器探头置于培养箱顶部，读取对应功率计上校准至460 nm波长光的强度值。按照所用功率计的说明书操作，连接并校准光电探测器。
	<ol>
		<li>减少环境光（例如尽可能关闭室内灯光，或将培养箱远离光源，以避免在进行光照强度测量前受到干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用置于投影仪孔径处的可调中性密度滤光片调节光照强度。旋转滤光片以调节功率计测得的光照强度，直至蓝光投射区域中心的光照强度读数为50 &#956;W/cm2. 
	注意：虽然可以通过软件端调低蓝色RGB值来调节光照强度，但使用滤光片的同时将蓝色RGB值调至最大，有助于在光照区域与非光照区域之间最大化系统的光学对比度 与 暗区</li>
	<li>使用笔记本电脑上的演示/投影软件绘制任意图案，并通过投影仪将这些图案显示在培养箱的顶部。 
	注意：应使用最大强度的蓝光照射来绘制生物膜形成区域（例如，RGB = [0, 0, 255]），无光照条件下不形成生物膜的区域（例如，RGB = [0, 0, 0]）。</li>
</ol>
3. 培养图案化生物膜
<ol>
	<li>在光照前，从甘油冻存菌种开始准备 pDawn-Ag43 细菌，使其在光照时稳定处于对数生长后期的诱导状态（图 3A).
	<ol>
		<li>从甘油保存菌种中划线接种pDawn-Ag43菌株至LB+spec琼脂平板。37 °C培养过夜，使菌落生长。 &#176;C). 
		注意：从此时起直至光照培养步骤，应尽可能使细胞保持在黑暗环境中——仅允许在环境光线下短暂暴露（例如，用于半稀释）是可接受的。</li>
		<li>从琼脂平板上挑取一单菌落的 pDawn-Ag43 细菌接种于 LB+spec 液体培养基中，过夜培养&#160;静止期（在摇床培养箱中，约250 rpm，37℃） &#176;C，约16小时）。</li>
		<li>以1:1,000的比例用LB+spec培养基稀释菌液（例如,&#160;加入1 &#956;将过夜培养物的 L 加入 1 mL 新鲜 LB+spec 中。</li>
		<li>让稀释后的培养物生长至&#160;对数后期/稳定期初期（OD ~1.0，约在37℃、250 rpm振荡培养箱中培养6小时） &#176;C）。</li>
		<li>在等待培养物生长的同时，准备含有1× M63盐、1 mM MgSO₄4，0.2% 葡萄糖，0.1% 酪蛋白氨基酸，以及 50 &#956;水中的每毫升微克链霉素（确保各组分无菌）。</li>
		<li>将对数生长后期的菌液用添加了50 μg/mL氨苄青霉素的M63培养基按1:100的比例稀释 &#956;g/mL 斯pectinomycin。然后，将该稀释液加入生物膜培养皿中（例如将稀释后的样品用移液器加入孔板中。 
		注意：此1:100稀释所需的体积取决于所使用的培养皿（例如，如果使用6孔聚苯乙烯培养板［非组织培养处理］，每个样品需添加20 &#956;将培养物加入2 mL M63+spec中（因为6孔板每孔的标准体积约为2 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由于样品现已准备好进行光照，将培养皿用胶带固定在培养箱顶部，确保培养皿底部表面透明，以便由下方的投影仪进行光照。 
	注意：必须确保培养箱的顶部不具反射性，以尽量减少杂散光照。也可使用黑色器壁的培养板作为培养皿来减少杂散光照，但并非必需；若使用此类培养板，需确保其底面透明。</li>
	<li>让生物膜在培养箱中培养过夜（37℃、静置培养16小时）。 &#176;C）。请注意，某些投影仪在较高温度下可靠性会降低。如果出现这种情况，请在较低温度下进行培养（例如, 30 &#176;C），需注意培养时间可能需要调整&#160;增加，取决于 大肠杆菌 菌株</li>
</ol>
4. 成像图案化生物膜
<ol>
	<li>在生物膜样本过夜培养后，将培养皿从培养箱中取出。此时，培养皿底部被光照区域已附着生物膜细菌，而液体培养基中则悬浮有浮游细菌。</li>
	<li>通过从培养皿中移除液体培养基，弃去浮游细胞（例如，用移液器轻轻抽吸。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）溶液冲洗样品 2 次，以去除残留的浮游细胞（图3B用移液管轻轻加入 PBS，随后吸出。</li>
	<li>如果细胞带有荧光标记，可直接使用荧光显微镜对样品进行成像13 (例如宽场13，三维共聚焦14, 等等。). 
	注意：也可使用自固化封片介质保存荧光生物膜。取一滴封片介质滴加至生物膜样本上，盖上玻璃盖玻片，注意避免产生气泡，室温下过夜固化后再进行成像。</li>
	<li>如果所使用的细菌细胞未进行荧光标记，则采用结晶紫染色法15 (图 3B）以在成像前增强生物膜的对比度。</li>
</ol>
5. 实验方案修改/替代方法
<ol>
	<li>在不同表面上培养 pDawn-Ag43 细菌。
	<ol>
		<li>在加入细菌样品/光照之前，将玻璃或聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品（例如，盖玻片或 PDMS 薄条）放入孔板中，并按照此前相同的操作流程在玻璃和 PDMS 上形成 pDawn-ag43 生物膜图案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在透明、封闭的培养室中培养 pDawn-Ag43 细菌。
	<ol>
		<li>制备用于 PDMS 的培养室模具。
		<ol>
			<li>对于基本的培养室，可通过将一个坚硬的矩形棱柱固定在平坦表面上来制作模具（该棱柱将在 PDMS 中形成一个空腔，模具浇铸完成后即作为培养室使用）。请注意，更复杂的培养室模具可使用软光刻技术16制备。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 PDMS 倒入模具中并使其固化，从而浇铸出 PDMS 空腔（详细的软光刻操作流程，请参见 JoVE 科学教育数据库16）。</li>
		<li>固化后，修剪多余的 PDMS，在空腔/培养室上打孔以形成进样/出样通道，并通过将 PDMS 紧密压在平坦表面（例如，玻璃/聚苯乙烯）上，将空腔与该表面键合，使表面与 PDMS 顶部之间的空腔作为生物膜培养室。 
		注：也可采用基于等离子体处理16的更永久性键合方式，但芯片将无法重复使用。</li>
		<li>按照此前的培养流程操作，使用带有钝头针头的注射器（而非移液器）将细菌样品引入培养室，或用 PBS 缓冲液冲洗（图 3C）。
		<ol>
			<li>若使用临时键合的空腔，仅可通过负压将液体吸入或抽出培养室，以确保空腔不会从下方的玻璃/聚苯乙烯表面脱落。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用薄膜光掩模进行结构化光照以培养 pDawn-Ag43 细菌。
	<ol>
		<li>使用与薄膜光掩模打印机/打印服务兼容的 CAD 软件设计生物膜图案。光掩模薄膜的设计应在预期形成生物膜的区域保持透明，其余区域为黑色/不透明。完成后，将光掩模文件发送至打印机/打印服务，并等待实物光掩模返回。</li>
		<li>通过笔记本电脑软件指令投影仪以最大蓝光强度照射整个视野（例如，RGB = [0, 0, 255]）。</li>
		<li>从较大的薄膜光掩模上裁剪出感兴趣的区域，并在加入细菌样品进行过夜光照前，将其直接粘贴在生物膜培养皿底部（图 3D）。按此前方法培养生物膜，培养结束后、成像前取下光掩模。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴于需要能够控制生物膜结构的研究工具，我们提出了一种易于使用的实验方案，利用pDawn-Ag43光遗传构建体对细菌生物膜进行图案化。通过该技术，可在多种表面环境中（包括封闭腔室）对大肠杆菌（E. coli）生物膜进行光学图案化，空间分辨率低于25 μm。
总体而言，本实验方案可分为四个主要部分：（1）pDawn-Ag43细菌的制备，（2）光学与培养装置硬件的准备，（3）光照前的细菌培养步骤，以及（4）光照后的清洗与成像。
第1部分的关键在于将pDawn-Ag43质粒成功转化至目标大肠杆菌（E. coli）菌株中。这一过程依赖于高质量纯化质粒的提取以及高质量感受态细胞的制备（表1，故障排除）。
第2部分的关键在于优化投影仪的设置，使在460 nm波长下照射强度调整为50 μW/cm2，并且投影仪在生物膜样品高度处正确聚焦。请注意，本方案中描述的是倒置照明装置，即投影仪从下方朝上向生物膜样品照射光线。这种设置的优势在于，光线只需穿过培养皿底部即可到达生物膜形成表面。而从上方照射时，光线需穿过生物膜表面之上的液体培养基，而在生长过程中，该培养基会因浮游细胞的存在而变得浑浊。除上述因素外，还应尽可能减少光学装置中的杂散光，例如通过覆盖培养箱内部的反光表面——这有助于获得更清晰的图案化生物膜。此外，使用光掩模控制照明图案也可获得更清晰的生物膜图案（图3D，图4C）。常见需排查的问题包括投影仪在较高温度（例如，37 °C）下的稳定性问题，可通过在较低温度（例如，30 °C）下培养生物膜来减轻；此外，计算机软件可能在过夜培养期间触发操作系统更新或蓝光过滤功能，也会影响实验（Table 1）。还需注意的是，根据所使用的投影仪和培养箱型号不同，投影仪产生的热量可能导致培养箱内部温度高于设定温度，这一偏差可能需要进行校正。
第3部分的关键是在细菌被光照诱导之前，获得可靠且可重复的细菌样本。因此，建议通过在琼脂平板上划线培养以获得pDawn-Ag43细菌的单克隆菌落，然后进行液体培养步骤，确保细菌在对数生长后期以可重复的方式接受光照/诱导。
最后，第4步的关键是在生物膜图案化实验步骤后，彻底但轻柔地洗去残留的浮游细胞；因此，建议使用PBS进行多次轻柔的冲洗步骤。
与现有的细胞图案化技术相比5,6基于pDawn-Ag43的光学生物膜图案化技术具有较低的使用门槛，无需微加工、洁净室设施、复杂化学处理或表面预处理，但仍能实现通常与微加工技术相关的高分辨率（25 μm）图案化。该方法拓展了此前用于控制基因表达的细菌光刻技术的研究。17目前，pDawn-Ag43 质粒仅限于 E. coli，因为它使用了基于pUC的复制起点，但pDawn和Ag43在其他（革兰氏阴性）细菌物种中也具有兼容性。目前已具备相应的遗传操作技术，有望将光调控生物膜形成引入不同细菌物种，这代表了一个可能的未来研究方向&#160;研究的另一个潜在局限性在于，该技术通过增强那些天然生物膜形成能力较弱的菌株的生物膜形成来发挥作用（例如MG1655 E. coli）。然而，具有较强天然生物膜形成能力的菌株，无论光照条件如何均会形成生物膜，从而无法使用本文所述的pDawn-Ag43实现生物膜的图案化；尽管如此，光遗传学技术在调控生物膜形成方面仍可能具有应用价值。我们注意到，在其他情况下，可能存在替代的生物膜图案化方法，例如 通过 光学c-di-GMP调控18.
总体而言，基于pDawn-Ag43的图案化技术适用于研究生物膜结构对其功能影响的应用场景1，因此可从对生物膜图案化过程的可调控制中获益——一个尤为相关的例子是生物膜中微生物生态学的研究2。未来的发展方向包括构建图案化的生物材料8,9和/或结构化的细菌群落。该易于实施的实验方案还可拓展至其他应用领域，例如生物艺术19（鉴于其显著的美学潜力），以及正式与非正式的生命科学教育20,21,22。从教育角度来看，本文所述的实验方案结合了多种关键技术（细菌培养、转化、光学/光遗传学），并且具有模块化扩展性（e.g.，可引入微流控技术）。

生物膜是附着在表面的微生物群落，以其结构与功能之间的紧密耦合而著称。生物膜的空间几何构型和图案分布在其整体群落功能中起着重要作用（反之亦然）1。由于生物膜结构涉及的尺度较小——约为数十微米量级2——实现对生物膜图案的可调且便捷的控制成为一个具有挑战性的问题。本文展示了一种基于光学照射的实验方案，可实现对生物膜在任意几何形状下的精确图案化。
本文介绍的实验方案使用了pDawn-Ag433，这是一种光遗传学构建体，通过pDawn4（一种受光学照射调控的转录调控元件）驱动Ag43（介导表面黏附和生物膜形成的黏附素基因）的表达，从而将大肠杆菌（E. coli）的生物膜形成过程与光学照射相偶联。该方法操作简便，可在多种表面环境中实现生物膜的图案化，包括封闭的（透明）培养腔室。与现有的细胞沉积方法（如基于液滴的沉积5或表面预图案化/处理6）相比，pDawn-Ag43无需微加工或洁净室设施，也不需要超出典型微生物学实验室常规配备的材料。该方法可实现低于25 μm的空间分辨率，接近天然生物膜中微菌落的空间尺度2。总体而言，该技术提供了操控生物膜结构的能力，从而为研究细菌群落中的微生态学开辟了多种途径7。此外，图案化的生物膜还可为构建有用的生物材料提供一个便捷的平台8,9。本文将讨论使用pDawn-Ag43进行生物膜图案化所需的基本实验流程，并探讨与该方法相关的潜在优化方案及故障排除策略。

<table><tbody><tr><td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td><td>Addgene</td><td>107742</td><td>携带 pDawn-Ag43 质粒的 DH5alpha 克隆菌株——使用前需将质粒转移至目标大肠杆菌菌株</td></tr><tr><td>MG1655 大肠杆菌</td><td>大肠杆菌遗传保藏中心 - 耶鲁大学</td><td>CGSC #6300</td><td>本研究代表性结果中使用 MG1655 作为目标大肠杆菌菌株</td></tr><tr><td>RFP 表达质粒</td><td>iGEM 生物元件库</td><td>J04450-pSB4K5bb</td><td>获得荧光细菌的方法有多种——若使用质粒，需确保其骨架与 pDawn-Ag43 的 colE1 复制起点无冲突</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>LB 液体培养基粉末</td><td>Affymetrix</td><td>75852</td><td>每升水中加入 20 g，高压灭菌后添加 50 &amp;mu;g/mL 链霉素，得到无菌 LB+spec 培养基</td></tr><tr><td>LB 琼脂培养基粉末</td><td>Affymetrix</td><td>75851</td><td>每升水中加入 35 g，高压灭菌后添加 50 &amp;mu;g/mL 链霉素，倒入培养皿中制备无菌 LB+spec 平板</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>431760</td><td></td></tr><tr><td>盐酸链霉素五水合物</td><td>abcam</td><td>ab141968</td><td>配制 1000 倍浓缩液（50 mg/mL 水溶液），过滤除菌，按需稀释至培养基中</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>与水按 1:1 体积比混合，通过高压灭菌或过滤除菌，获得 50% 甘油溶液</td></tr><tr><td>M63 培养基盐 5X 溶液</td><td>Bio-world</td><td>705729</td><td>加入酪蛋白氨基酸、葡萄糖和 MgSO4，用无菌水稀释至 1X 盐浓度</td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>Amresco</td><td>J851</td><td>配制 20% 水溶液，过滤除菌后作为补充物加入 M63 培养基（终浓度 0.1%）</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>配制 20% 水溶液，过滤除菌后作为补充物加入 M63 培养基（终浓度 0.2%）</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>配制 1 M 水溶液，高压灭菌后作为补充物加入 M63 培养基（终浓度 1 mM）</td></tr><tr><td>结晶紫&amp;nbsp;</td><td>Acros organics</td><td>212120250</td><td>使用前用水稀释至 0.1%</td></tr><tr><td>自固化封片介质（Shandon immumount）</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td>用于长期保存样品以进行荧光成像</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>也可使用由粉末或片剂配制的 PBS</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisherbrand</td><td>351146</td><td>作为生物膜培养皿用于获得代表性结果</td></tr><tr><td>PDMS 试剂盒</td><td>Dow</td><td>SYLGARD 184</td><td>可用于通过软光刻技术制备封闭的微腔室</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD 注射器</td><td>309659</td><td>用于封闭微腔室中的液体操作</td></tr><tr><td>钝头针</td><td>CML supply</td><td>901-23-050</td><td>可连接至 1 mL 注射器</td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901</td><td>用于将培养腔室固定在培养箱顶部</td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>Sheldon Manufacturing</td><td>SMI6</td><td>确保培养箱内部高度足够，以便将投影仪聚焦于顶部</td></tr><tr><td>便携式投影仪</td><td>Ivation</td><td>IV-PJ-PRO-4-1</td><td>市面上有多种便携式投影仪型号，pDawn-Ag43 已在多个型号上测试过，包括基于 LED/激光的设备，其蓝光通道中心波长范围为 450–460 nm</td></tr><tr><td>光学面包板底座</td><td>ThorLabs</td><td>MSB6</td><td>用于固定投影仪的光学平台底座——其他多种装置亦可，只需能牢固地将投影仪固定在培养箱底部并向上投射即可</td></tr><tr><td>光学支架立柱</td><td>ThorLabs</td><td>TR8</td><td>需要两根立柱——一根垂直安装于面包板底座上，另一根通过直角夹水平连接</td></tr><tr><td>光学支架直角夹</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>连接垂直与水平立柱</td></tr><tr><td>安装基座</td><td>ThorLabs</td><td>BA1S</td><td>连接光学面包板底座与垂直立柱</td></tr><tr><td>1/4&quot;-20 螺钉</td><td>ThorLabs</td><td>SH25S050</td><td>用于连接垂直立柱与安装基座，以及安装基座与面包板底座</td></tr><tr><td>1/4&quot;-20 紧定螺钉</td><td>ThorLabs</td><td>SS25E63D</td><td>通过三脚架螺孔将水平立柱与投影仪连接</td></tr><tr><td>光学功率计</td><td>Newport</td><td>840</td><td>需配合功率计探测器测量投影仪照明强度——多种型号可用，选用带可延伸探测器的型号便于测量</td></tr><tr><td>光学功率计探测器</td><td>Newport</td><td>818-UV</td><td>连接至上述功率计——由于蓝光位于可见光范围内，紫外探测器并非必需</td></tr><tr><td>可调中性密度滤光片</td><td>K&amp;F Concept</td><td>SKU0689</td><td>可通过旋转调节的中性密度滤光片——置于投影仪光圈上方</td></tr><tr><td>演示投影软件</td><td>Microsoft</td><td>Powerpoint</td><td>任何支持绘图或演示功能的软件均可满足需求</td></tr><tr><td>CAD 软件</td><td>Autodesk&amp;nbsp;</td><td>AutoCAD</td><td>用于设计光掩模，许多掩模打印服务均兼容 AutoCAD 文件</td></tr><tr><td>胶片光掩模</td><td>Fineline Imaging</td><td>n/a</td><td>存在多种高分辨率（&gt;30000 DPI）胶片光掩模打印服务</td></tr></tbody></table>

利用pdawn-ag43实现高分辨率图案化生物膜沉积

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

空间结构和空间模式在细菌生物膜中起着重要作用。本文展示了一种简便的方法，可用于以高空间分辨率将大肠杆菌（E. coli）生物膜培养成任意的空间图案。该技术采用一种基因编码的光遗传学构建体——pDawn-Ag43，将大肠杆菌（E. coli）中生物膜的形成与蓝光照射相耦合。我们详细描述了将pDawn-Ag43&#160;转化至大肠杆菌（E. coli）的过程、所需光学装置的准备，以及利用pDawn-Ag43细菌培养图案化生物膜的实验方案。使用本方案，可在多种表面和环境中实现空间分辨率低于25 μm的生物膜图案化，且无需微加工设备、洁净室设施或表面预处理。该技术操作便捷，适用于研究生物膜结构影响的应用，可对生物膜的图案化进行可调控制。更广泛而言，该技术在生物材料、教育及生物艺术领域也具有潜在应用价值。

如图所示 图4A使用pDawn-Ag43细菌在聚苯乙烯孔板中生成生物膜，并通过投影仪照明形成圆点图案（投影仪设置为投射圆点图案），采用明场显微镜结合结晶紫染色作为对比剂进行成像，同时利用表达红色荧光蛋白的细菌进行荧光显微镜观察。荧光标记的生物膜样本也可通过共聚焦显微镜成像。14 以获取生物膜的三维图像（图4B）。在 图 4C我们展示了利用薄膜光掩模对生物膜样品进行图案化照明所能实现的高分辨率图案。最后，在 图 4D 和 4E我们展示了在玻璃和PDMS表面以及封闭的PDMS培养腔室上进行图案化的示例——这些实例说明了pDawn-Ag43图案化技术可应用的不同类型环境。
<img alt="克隆质粒流程图：转化、大肠杆菌涂板、pDawn-Ag43 冷冻保存" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：pDawn-Ag43细菌的制备（实验方案第1节） 制备能够进行光调控生物膜形成的pDawn-Ag43细菌，需从宿主克隆菌株中纯化pDawn-Ag43质粒，并将其转化至目标菌株中 E. coli 目标菌株，以及制备用于长期保存的细菌冻存菌种。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于生物膜培养的光学装置示意图，460 nm 投影仪配合中性密度滤光片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：生物膜样品照明用光学装置的制备（实验方案第 2 部分）。 光学装置置于细菌培养箱内，由一台连接计算机的投影仪照射生物膜样品组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生物膜生长过程及染色方法。包含培养装置和成像前处理的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：生物膜图案化培养方案（方案第 3 节）。 （A）在光照前，需预先准备表达 pDawn-Ag43 的细菌，以确保其在适当的生长阶段能够被可靠地诱导。 （B）经过一夜的光照培养后，图案化的生物膜将形成于培养皿底部，同时液体培养基中存在浮游细胞；经过进一步处理后，生物膜即可用于成像。 （C）除了使用孔板外，生物膜也可在封闭的培养腔室中培养，例如模制的 PDMS 腔室。在此情况下，可通过连接钝头针的注射器向腔室内引入样品并冲洗液体。 （D）除了使用投影仪生成光照图案外，也可通过将薄膜光掩模直接粘贴至生物膜培养腔室底部来产生图案。此时，投影仪应设置为在整个视野范围内提供均匀的蓝光照射。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物膜分析：结晶紫染色；PDMS和玻璃片上RFP+细菌的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：使用pDawn-Ag43图案化生物膜的代表性结果。 所有实验均采用MG1655 E. coli 宿主菌株进行。（A）利用pDawn-Ag43细菌在聚苯乙烯孔板中生成生物膜，通过投影仪照射（投影仪设置为点阵图案）实现图案化，并采用明场显微镜结合结晶紫染色作为对比剂进行成像，同时使用表达红色荧光蛋白的细菌进行荧光显微镜观察。（B）利用共聚焦显微镜对荧光标记的生物膜样品进行成像，以获得生物膜的三维图像。（C）通过使用薄膜光掩模对生物膜样品提供图案化光照，可实现高分辨率的生物膜图案化。（D）可在玻璃和PDMS表面进行生物膜图案化。（E）可在封闭的培养腔室中实现生物膜图案化。本图改编自先前的研究3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>可能的原因/解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>将 pDawn-Ag43 转化至宿主菌株后无菌落生长</td>
			<td>质粒浓度过低——使用分光光度计检测质粒浓度。pDawn-Ag43 的典型质粒小提产量应至少达到 100 ng/μL；转化时可使用 10–100 ng 质粒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检查或重新制备感受态细胞：感受态细胞的转化效率应至少达到 10^6 cfu/µg，可通过标准质粒（如 pUC19）验证；若未达标，则需重新制备感受态细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB 琼脂平板上的抗生素种类或浓度错误——确保使用 50 μg/mL 氯霉素进行筛选</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>投影仪照明在夜间自动关闭或工作不稳定</td>
			<td>禁用可能导致问题的软件，例如：自动夜间系统/软件更新、夜间蓝光过滤功能</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>投影仪可能过热——开启投影仪时将培养箱温度设为较低值（例如 30 °C 而非 37 °C）；注意投影仪作为热源可能导致培养箱内部温度超过设定值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>从培养箱中移除不必要的湿气来源，以免影响投影仪电子元件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>经夜间光照后未形成或仅形成少量生物膜，且无浮游细胞生长（即液体澄清）</td>
			<td>抗生素种类或浓度错误——确保使用 50 μg/mL 氯霉素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检查 M63 培养基配方中所有组分是否均已正确添加</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>经夜间光照后未形成或仅形成少量生物膜，仅有浮游细胞生长（即液体浑浊）</td>
			<td>检查光照强度，投影仪应在 460 nm 波长下提供 50 μW/cm² 的蓝光照射</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尝试在接种 M63 前，调整 LB 1:1000 稀释后细菌的培养时间（缩短或延长）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>在 LB 平板上重新划线，从新鲜单菌落开始培养，以获得稳定的过夜培养物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>确保投影仪在夜间持续稳定工作——参见上述说明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物膜图案模糊，背景噪声水平高</td>
			<td>减少光学照明系统的杂散光，覆盖培养箱内部的反光表面</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可考虑使用基于光掩模的（而非基于投影仪的）结构化照明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>确保投影仪已正确聚焦于生物膜培养腔的底部表面</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：常见故障排除问题。

我们展示了一种利用基因编码的表面黏附结构的光刺激，以高分辨率在任意空间图案中沉积大肠杆菌（Escherichia coli）细菌生物膜的方法。

利用pDawn-Ag43实现高分辨率图案化生物膜沉积

空间结构与空间分布模式在细菌生物膜中起着重要作用。本文展示了一种简便的培养大肠杆菌生物膜的方法……

我们开发了一种名为生物膜光刻的技术，该技术可将光线照射到表面，细菌会在有光的区域聚集。该方法将有助于我们回答生物膜研究中的关键问题，例如，空间结构如何影响群落功能。该技术具有诸多优势。例如，该方法具有高达25微米的高分辨率，无需表面预图形化处理，且可在封闭的微流控装置内部进行。尽管该方法可为天然生物膜的结构-功能关系提供深入见解，也可应用于其他领域，如生物膜工程、生物材料以及多细胞合成生物学。在进行生物膜图形化之前，需要完成光学培养装置和细菌样品的关键预处理步骤，因此对该方法的可视化演示至关重要。首先，将 pDawn-Ag43 质粒转化至目标大肠杆菌菌株中，并涂布于添加了壮观霉素的 LB 琼脂平板上。挑取单克隆接种于含有壮观霉素的 LB 液体培养基中，在培养管中于 250 rpm、37 °C 条件下的摇床中培养至对数生长期。接种后，通过在冻存管中将 1 mL 50% 无菌甘油与 1 mL 菌液混合，制备 pDawn-Ag43 转化菌株的 25% 甘油保存液。将储备液保存在-80摄氏度的冰箱中。接下来，开始准备光学装置：将便携式投影仪放置在细菌培养箱底部，使投影孔径正对上方天花板，生物膜培养室将固定在该位置。通过显示电缆将笔记本电脑与培养箱内的投影仪连接。使用胶带将一个空的假培养皿固定在培养箱的顶部。通过旋转投影仪的调焦旋钮来调整焦距，使焦平面与固定在培养箱顶部的生物膜培养皿的底面重合。投影仪应在培养皿底部投射出清晰、无模糊的图像。优化投影后，取下虚拟培养皿。使用笔记本电脑软件，通过显示全蓝色幻灯片，使投影仪以最大蓝光照射整个视野。将光探测器探头置于培养箱顶部，使用光学功率计测量投影仪的光照强度，并读取对应功率计上针对460纳米波长光校准的强度数值。接下来，通过调节位于投影仪孔径处的可调中性密度滤光片来调整光照强度。旋转滤光片，直至功率计测得的蓝光照射区域中心的光照强度为50微瓦每平方厘米。必须使用位于培养箱顶部的校准过的光电探测器，确保光照强度设定在适当的水平。通过旋转中性密度滤光片，可精确调节光照强度。现在使用笔记本电脑上的投影演示软件绘制任意图案，并通过投影仪将这些图案投射到培养箱的顶部。在光照处理前，将含有pDawn-Ag43质粒的菌株从甘油保存液中划线接种至LB加链霉素的琼脂平板上。在 37 摄氏度下培养过夜，使菌落生长。从琼脂平板上挑取一单菌落接种于含链霉素的 LB 培养基（LB-plus-spec 培养基）中，于 37 摄氏度、250 rpm 摇床培养箱中振荡培养过夜至稳定期。次日，用含链霉素的 LB 培养基按 1:1,000 的比例稀释菌液进行继代培养。将稀释后的培养物置于摇床培养箱中，在 250 rpm、37 摄氏度条件下培养 6 小时，直至对数后期或稳定期初期。在光照诱导前，必须对过夜培养物进行稀释，并使其生长至对数后期。这一步骤可确保细菌在诱导时处于稳定且健康的活跃状态。孵育结束后，用预先准备好的M63培养基将处于对数生长后期的培养物按1:100的比例进行稀释，该培养基需添加50 µg/mL的壮观霉素。然后，将稀释后的菌液接种至生物膜培养皿中。由于样品现已准备好进行光照处理，需将培养皿用胶带固定在培养箱的顶部，确保培养皿底部表面透明，以便由下方的投影仪进行光照。生物膜样本过夜培养后，从培养箱中取出培养皿。培养皿底部被光照区域会附着生物膜细菌，而液体培养基中则含有悬浮生长的浮游细菌。通过移除培养皿中的液体培养基，弃去浮游细菌。接下来，用 PBS 轻柔地吹打冲洗样品两次，以去除残留的浮游细胞，随后进行抽吸。如果细胞带有荧光标记，可直接使用荧光显微镜对样品成像。如图所示，采用 pDawn-Ag43 细菌在聚苯乙烯孔板中生成生物膜，并通过投影仪照射实现图案化。可使用结晶紫染色法对生物膜进行可视化观察，或者在使用荧光标记细菌时通过荧光显微镜进行观察。荧光标记的生物膜样本还可通过共聚焦显微镜成像，以获得生物膜的三维图像。通过使用薄膜光掩模对生物膜样本提供图案化光照，可实现高分辨率的图案化。此处展示了在玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面以及封闭的PDMS培养腔室中进行图案化的示例，说明了pDawn-Ag43图案化技术可应用的不同类型环境。在实施该实验流程时，首先需将pDawn-Ag43质粒转化至目标菌株中，随后正确聚焦并校准投影仪，最后按照规定的培养和回稀步骤处理细菌，以准备光照实验。采用该方法后，还可进一步开展其他技术操作，例如在不同培养条件下长期监测生物膜的形成。通过这种方式，我们可以理解生物膜结构如何影响其功能。该技术将具有广泛的应用性，例如在合成生物学和材料研究领域，可被用于设计和构建具有多种应用功能的生物膜。

high-resolution-patterned-biofilm-deposition-using-pdawn-ag43

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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