Name: 细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习使用细胞外通量分析仪实时测定小鼠视网膜组织的氧消耗率和细胞外酸化率，评估糖酵解与氧化磷酸化水平，为研究视网膜能量代谢及眼部疾病机制提供可靠方法。

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我们感谢 Alexander Kolesnikov 博士和 Vladimir Kefalov 博士提供 Gnat1-/- 小鼠，以及他们在实验中提供的有益反馈、建议和对手稿的审阅。
本工作由以下机构资助：NIH EY025269（RR）、华盛顿大学糖尿病研究中心——NIH DK020579（JRM 和 RR）、防盲研究职业发展奖（RR）、Horncrest 基金会（RR）、JDRF 职业发展奖（JRM）、NIH DK101392（CFS）、DK020579（CFS）、DK056341（CFS）以及 DK114233（JRM）。

实验方案遵循视力与眼科学研究协会关于动物使用的规定，并经华盛顿大学批准。
1. 动物准备
<ol>
	<li>将动物饲养在标准环境中，保持12小时黑暗与12小时光照的循环。实验应在固定时间开始，以避免昼夜节律的影响，通常在清晨开灯后不久进行。</li>
</ol>
2. 溶液配制
<ol>
	<li>通过将 8.4 mg 粉末培养基溶解于双蒸 H2O (ddH₂O)2O)，并用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。使用 0.22 µm 细胞培养滤器过滤除菌。
	<ol>
		<li>向培养基中加入1 M葡萄糖和100 mM丙酮酸钠，使葡萄糖和丙酮酸的终浓度分别为5 mM和1 mM。</li>
		<li>将50 mL基础培养基置于37 °C水浴中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将Tris碱加入至10 mM、聚乙二醇叔辛基苯基醚加入至0.2%（v/v）、EDTA加入至1 mM，溶于ddH₂O中，配制用于通量分析结束时组织定量的裂解液2O. 混合至所有组分完全溶解，并调节pH至8.0。</li>
	<li>对于线粒体应激实验方案，用基础培养基配制浓度为 11 µM 的寡霉素（ATP 合酶抑制剂）储备液，使孔中终浓度为 1 µM。用基础培养基配制浓度为 11 µM 的羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP，解偶联剂）储备液，使孔中终浓度为 1 µM。配制电子传递链抑制剂混合液（鱼藤酮和抗霉素 A，RAA）：将鱼藤酮加入基础培养基至浓度为 11 µM，抗霉素 A 至浓度为 22 µM，使孔中终浓度为 1 µM 鱼藤酮和 2 µM 抗霉素 A。</li>
	<li>对于糖酵解实验方案，将葡萄糖溶于基础培养基中，配制220 mM的母液，以达到孔内终浓度为20 mM。同时，将2-脱氧葡萄糖（2-DG）溶于基础培养基中，配制1.1 M的母液；2-DG是葡萄糖的竞争性抑制剂和糖酵解拮抗剂，其孔内终浓度为100 mM。</li>
</ol>
3. 仪器校准
<ol>
	<li>为校准细胞外通量检测的仪器，向传感器微孔板的每个孔中加入 1 mL 校准液（共 24 个孔），并在 37 °C、无 CO2 的培养箱中孵育过夜（或至少 8 小时）。</li>
	<li>将线粒体应激实验方案或糖酵解实验方案所需的添加剂分别加入传感器微孔板上的加样口 A 至 D 中，并根据孔内体积变化进行调整。 
	注意：例如，若孔内初始体积为 450 µL，则典型的实验方案中，第一个加样口加入 45 µL 添加剂，第二个加入 49.5 µL，第三个加入 54.5 µL，最后一个加入 60 µL。</li>
	<li>在最初几次实验中，将基础培养基加入 A 口，以评估加样口注射后组织移动或伪影的程度。</li>
	<li>将加载完毕的传感器板置于 37 °C、非 CO2 培养箱中孵育至少 60 分钟。</li>
</ol>
4. 新鲜小鼠视网膜组织的分离
注意：此步骤改编自 Barry Winkler 博士的技术15。
<ol>
	<li>使用标准的氯胺酮/赛拉嗪混合物实施深度麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>使用一对中等大小的弯头镊子夹住视神经处的后部眼球，并轻轻施加向前的压力使眼球突出（图1A）。
	<ol>
		<li>用干净的剃须刀片，沿角膜从一侧角膜缘至另一侧角膜缘进行一次完整而有目的性的切开。</li>
		<li>使用精细的斜头McPherson式镊子夹住后部眼球，将晶状体和前部玻璃体膜从角膜切口挤出。弃去这些组织。</li>
		<li>重复使用镊子夹捏操作，将神经视网膜挤出。</li>
		<li>使用镊子像勺子一样托起视网膜，避免直接夹持组织，将视网膜从角膜切口处转移出来，并直接放入盛有温热培养基的3 cm培养皿或6孔组织培养板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两对精细的斜头McPherson式镊子，轻轻分离视网膜上残留的玻璃体。最佳操作方式是从视网膜杯周边部夹住玻璃体并向中心牵拉，最后整体将玻璃体从中心部位剥离。使用镊子清除视网膜光感受器表面残留的视网膜色素上皮细胞。
	<ol>
		<li>用剃须刀片切割P1000移液枪头，制造一个约4 mm的开口，以防止在转移过程中对脆弱的视网膜组织造成过度损伤。</li>
		<li>使用切割后的P1000移液枪头将分离的视网膜组织转移到新鲜培养基中。</li>
		<li>使用带有顶针装置的1 mm活检打孔器在视神经周围切取直径1 mm的视网膜组织块，以便在组织卡在孔内时可借助顶针将其推出（图1B）。将获取的视网膜组织块置于洁净培养基中，并放置于37 °C加热块或加热垫上备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 检测方案
<ol>
	<li>使用剪裁过的P1000枪头，将单个组织穿孔样本转移至24孔胰岛捕获微孔板中，同时吸取450 µL培养基与组织一同转移。</li>
	<li>使用精细的直头镊子将 punches 轻柔地移至微孔板中央。保持所有 punches 方向一致（例如，神经节细胞层朝上）。
	<ol>
		<li>将捕获板放置在设定为 37 °C 的加热垫或加热块上，并对剩余样品重复上述步骤。 
		注意： 每次实验需预留3-4个空白孔，每孔加入450 µL基础培养基，作为阴性对照。在剩余的20-21个孔中，每个生物学重复设三个复孔进行检测。因此，每块24孔板可记录6-7个不同动物或处理条件的数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>避免产生气泡，使用镊子将胰岛捕获网插入每个孔中，并用金属推杆或剪裁过的P1000移液器吸头固定插入件。图1C). 
	注意： 在此步骤中，应避免组织过度移动，以保持视网膜打孔位置位于样品微室的中央。气泡会严重干扰氧消耗率（OCR）读数。尽管微室深度足以容纳典型的小鼠视网膜图1C），偶尔由于筛网插入件的加工缺陷，可能导致组织在插入筛网时被过度压缩。若发生此情况，只需记录被压碎的组织，并将该样本从最终分析中剔除。</li>
	<li>在37 °C CO₂培养箱中孵育组织培养板2无菌培养箱中孵育至少60分钟。</li>
	<li>使用混合、等待、测量和重复命令对细胞外通量分析仪进行编程。例如，视网膜组织的典型实验可能包括以下步骤：混合2分钟，等待2分钟，测量5分钟。在基线记录期间以及运行过程中每次注射待测化合物后，将上述三个步骤重复5至8次（循环）。</li>
	<li>按下细胞外通量分析仪上的程序“START”按钮，并根据屏幕上的提示插入传感器微板进行校准。</li>
	<li>校准结束后，根据屏幕上的提示，将校准板替换为含有视网膜样本的板。</li>
	<li>按预设程序运行。运行结束后，根据屏幕提示取出组织板。查看运行结果并保存数据文件。</li>
	<li>使用弯曲的20号针头和镊子，将所有膜插件从孔中取出，留下视网膜打孔组织。</li>
	<li>小心吸除组织中的培养基，用 0.5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织两次。每次洗涤后吸除 PBS。</li>
	<li>向每孔加入 100 µL 裂解缓冲液，用移液器吹打数次以充分匀浆组织。</li>
	<li>根据总双链DNA（dsDNA）或总蛋白含量定量输入量。 
	注意： 以下内容基于一种市售的双链DNA检测试剂盒。</li>
	<li>将裂解后的样品用100 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:1比例稀释，并取100 µL稀释后的样品转移至96孔板中。
	<ol>
		<li>每孔加入 100 µL 检测缓冲液。混匀 2–5 分钟后，在激发波长 480 nm、发射波长 520 nm 条件下测定荧光强度，并根据标准曲线进行定量分析。</li>
		<li>将原始细胞外通量轨迹数据根据孔内DNA含量进行归一化处理。 
		注意： 在本研究展示的结果中，样品已归一化至50 ng dsDNA——相当于1 mm视网膜打孔组织中的典型含量。因此，本文提供的绝对值可与以相似数据形式呈现的研究进行比较 &#34;每片视网膜 punch&#34;将轨迹数据归一化至内部标准，例如在5 mM葡萄糖浓度下获得的基线运行数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用所述技术，通过生物分析仪可轻松测量离体视网膜组织的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。该方法在多个关键步骤上与其他研究团队的方法有所不同。视网膜组织通过大角膜切口分离，而无需摘除眼球，此方法最初由 Winkler15 描述。这种视网膜分离方法可实现从活体眼球快速转移至组织捕获板（通常在5分钟内完成）。整个过程中组织始终保持在37 °C，相较于置于冰上更有利于维持细胞呼吸功能。初始测量采用添加成分最少的培养基，避免使用任何缓冲剂（如HEPES或碳酸氢钠）、血清或过量宏量营养素，以便更可靠地测量基础能量代谢，并且不会干扰ECAR的评估。视网膜组织 punch 样本最好采用24孔板格式进行记录，而非96孔板，以尽量减少对组织的损伤。将视网膜组织置于孔中央的组织微室中，并用网格插件固定。这样做可准确记录ECAR和OCR，防止运行过程中组织过度移动，并无需使用其他试剂（如组织粘合剂）。建议在检测过程中进行载剂注射，尤其是在首次设置记录实验时，这有助于判断组织在捕获板中的固定情况。采用该技术进行的OCR记录不受视网膜在孔中方向的影响，但在同一批实验的各样本之间必须保持方向一致。所有测量均...

视网膜是中枢神经系统中能量需求最高的组织之一1与大多数组织一样，它能生成三磷酸腺苷（ATP） 通过 细胞质中的糖酵解或 通过 线粒体中的氧化磷酸化。通过氧化磷酸化与糖酵解产生ATP的能量效率差异显而易见：每分子葡萄糖经氧化磷酸化可生成36分子ATP 与 后者产生2分子ATP。因此，视网膜神经元主要依赖线粒体呼吸作用提供能量，这在其高密度的线粒体中得到体现2然而，即使在氧气充足的情况下，视网膜也高度依赖糖酵解机制。这种有氧糖酵解过程最初由奥托·瓦尔堡（Otto Warburg）在癌细胞中描述。3曾指出，视网膜是唯一能够进行这种代谢形式的终末分化组织4自最初观察以来，许多终末分化组织被发现除了通过氧化磷酸化外，还以不同程度进行糖酵解来满足其ATP需求。
光转导、视觉色素循环、感光细胞外节的生物合成以及突触活动均为感光细胞中高度耗能的过程，而感光细胞是视网膜中主要的神经元亚类。然而，神经元中最消耗能量的过程是主动将离子逆其电势梯度和浓度梯度进行转运的需求。1. 光感受器是一种特殊的神经元，其特点是在无刺激状态下处于去极化状态（即， 在黑暗中），而光刺激会引发通道关闭及随后的超极化。因此，在黑暗中，视网膜消耗大量ATP以维持其去极化状态 &#34;暗电流&#34; 正如其通常所称，从适应性角度来看，提供如此大量ATP的主要挑战在于生物体需要通过光学轴保持视觉清晰。现代生物中所见的视网膜倒置结构是占主导地位的解决方案，因为它将为感光细胞供能的密集毛细血管网络远离光线路径。但这一自然生物工程的奇迹也使视网膜在代谢储备方面处于临界状态。即使对视网膜造成轻微损伤，也可能破坏能量供需之间微妙的平衡，进而迅速导致视觉功能障碍甚至完全失明。
鉴于神经视网膜具有独特的能量需求，同时其血管供应受到严格限制，准确测量视网膜中的ATP消耗及其在疾病过程中的变化，可能对理解与治疗致盲性疾病（如视网膜色素变性及糖尿病视网膜病变）产生深远影响。传统上，此类测量需要昂贵且定制设计的设备，大多数相关研究仅由少数专门致力于代谢活性测量的实验室开展2,5,6,7,8。相关技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用放射性标记前体的示踪研究、利用克拉克电极记录耗氧量，以及代谢组学分析9。
随着高通量技术的进步以及商用设备的日益普及，记录视网膜代谢的技术正变得越来越易于获取且成本低廉。本文所述方法利用离体组织和一种市售的细胞外通量分析仪，同时测量视网膜的氧化磷酸化和糖酵解过程9,10,11,12。该分析仪可分别记录耗氧速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR），二者分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标13。这些测量通过浸没在覆盖于目标组织上方所形成的微室中的探针完成。本方法在先前已发表技术的基础上进行了改进，采用原本为胰岛（Langerhans岛）设计的捕获板，用于记录小块圆形小鼠视网膜组织的代谢活性。由于系统为每个样品孔配备了4个注射口，因此可在单次记录过程中向组织施加多种药物干预。结合分别优化用于ECAR和OCR检测的实验方案，可将野生型视网膜的反应与缺乏transducin（Gnat1-/-）的视网膜进行比较，后者是人类先天性静止性夜盲症的致病原因14。

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 细胞外通量分析仪</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 胰岛捕获通量试剂盒（包含：胰岛捕获微孔板、传感器盒和校准液）</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>包含胰岛捕获微孔板、传感器盒和校准液</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（粉末状培养基）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>含 L-谷氨酰胺、不含葡萄糖和碳酸氢钠的 RPMI 1640 培养基</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M 过滤灭菌 D-葡萄糖，用于培养基配制</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>线粒体应激实验方案组分</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>线粒体应激实验方案组分</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>线粒体应激实验方案组分</td></tr><tr><td>2-脱氧葡萄糖</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>糖酵解实验方案组分</td></tr><tr><td>1 mm 带推杆皮肤活检打孔器</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>视网膜组织外植块工具</td></tr><tr><td>Dumont 小型直头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-10</td><td>视网膜组织外植块工具</td></tr><tr><td>Dumont 医用 #5/45 镊子 - 45 度弯头</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>视网膜组织外植块工具</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子 - 弯头型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>视网膜组织外植块工具</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen 双链 DNA 检测试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>上样归一化检测</td></tr><tr><td>Trizma 碱（Tris 碱）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>Triton X-100（聚乙二醇叔辛基苯基醚）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>&amp;nbsp;品系 000664</td><td>实验动物</td></tr><tr><td>Gnat1&lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt; 及背景匹配的 Gnat1&lt;sup&gt;+/+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td><td>实验动物</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞外通量分析法测量离体视网膜组织中的能量代谢

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

高敏锐度视觉是一个高度耗能的过程，视网膜已进化出多种独特适应机制，以精确满足这一需求，同时保持视觉轴的透明性。这种精细平衡的破坏会导致致盲性疾病，例如糖尿病视网膜病变。因此，理解视网膜在疾病过程中能量代谢的变化，对于开发针对多种视力丧失原因的合理疗法至关重要。近年来，商用的细胞外通量分析仪的出现使视网膜能量代谢的研究变得更加便捷。本实验方案描述了如何利用此类分析仪，通过定量氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）作为这两条通路的替代指标，来评估视网膜能量供应的两个主要途径——氧化磷酸化和糖酵解——各自的贡献。该技术可直接应用于离体视网膜组织，便于在单次实验中评估多种药理学试剂的作用。本方法用于比较缺乏视杆光感受器信号传导的动物视网膜与野生型对照组的代谢特征。该技术的一个主要局限性在于无法区分明适应与暗适应状态下的能量利用情况，而这是视网膜组织中一个重要的生理学考量。

采用所述技术（总结于图1），将8周龄野生型（WT）小鼠的视网膜外植体与年龄和遗传背景相匹配的转导素基因敲除小鼠（Gnat1-/-）进行了比较。由于Gnat1-/-动物缺乏在光刺激下关闭环核苷酸门控离子通道的机制，其视杆细胞即使在光照条件下仍保持去极化状态14。持续维持钾离子外流的需求将导致大量ATP消耗，从而引发生物能量应激。为了确定这种能量需求的变化是否会增加氧化磷酸化或糖酵解通量，使用细胞外通量分析仪对野生型小鼠和Gnat1-/-小鼠的组织进行了比较。在基础状态下，存在5 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸的条件下，野生型动物的视网膜组织与Gnat1-/-突变体的酸外排速率相似。在添加20 mM葡萄糖和糖酵解抑制剂2-DG后，也观察到类似的趋势（图2A<...

本技术描述了利用细胞外通量分析仪对小鼠离体视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化速率进行实时记录的方法。

高敏锐度视觉是一个高度耗能的过程，视网膜已进化出多种独特的适应机制，以精确满足这种能量需求，同时……

该方法有助于回答一些关键问题，例如不同生物样本之间视网膜组织中的能量代谢差异，或在药物处理后的变化。该技术的主要优势在于利用离体的器官型视网膜组织，同时测量糖酵解和氧化磷酸化的速率，并可在体外实时评估干预效应。在进行细胞外通量检测前，需对仪器进行校准：向24孔传感器微板的每孔中加入1毫升校准液，并在37摄氏度、无CO2的培养箱中孵育过夜。将线粒体应激实验方案或糖酵解实验方案所需的添加剂加入传感器微孔板的各个注射孔中，并根据孔内体积变化进行调整。假设初始孔体积为 450 微升，一次典型的检测需向第一个注射孔加入 45 微升添加剂，第二个孔加入 49.5 微升，第三个孔加入 54.5 微升，最后一个孔加入 60 微升。在前几次实验中，将基础培养基加入 A 孔，以评估注射后组织移动伪影的程度。将加载好的传感器板置于37摄氏度的非二氧化碳培养箱中孵育至少60分钟。开始分离新鲜的小鼠视网膜组织，使用刚处死的小鼠。用一对中号弯镊在视神经处夹住眼球后部，并轻轻施加向前的压力使眼球突出。使用干净的剃须刀片，以刀片单次果断地从角膜缘到角膜缘做一次贯穿角膜的切口。用精细的弯头McPherson式镊子夹住眼球后部，将晶状体及前部玻璃体膜从角膜切口处挤出。重复使用镊子进行夹捏操作，以挤出神经视网膜。然后，使用镊子像勺子一样将视网膜从角膜切口处轻轻抬起。将视网膜直接放入盛有温热培养基的3厘米培养皿或6孔组织培养板中。接着，使用两对精细的弯头McPherson型镊子，轻轻剥离视网膜上残留的玻璃体。最佳操作方法是抓住视网膜杯周边部的玻璃体，向中心方向牵拉，最终整体将玻璃体从中心处分离。然后，从视网膜的光感受器表面去除残留的视网膜色素上皮细胞。用刀片切割P1000移液器吸头，形成一个约4毫米的开口，以防止在转移操作过程中对 delicate 的视网膜组织造成过度损伤。然后，使用剪去尖端的移液管头将分离的视网膜组织转移至新鲜培养基中。最后，使用配有推杆的1毫米活检打孔器，在视神经周围切割视网膜组织小片。将视网膜组织小片置于洁净的培养基中，并放置在37°C金属块或加热垫上备用。收集完所需数量的组织穿孔后，使用剪去尖端的 P1000 吸头吸取 450 微升培养基中的单个穿孔组织，并将其转移至置于 37 摄氏度加热垫或加热块上的 24 孔带环捕获微孔板中。使用精细的直头镊子轻轻将穿孔组织调整至微孔板孔的中央位置，并保持所有穿孔组织方向一致。例如，将视网膜节细胞侧朝上放置。每次实验需预留三到四个空白孔，每孔加入450 µL基础培养基，作为阴性对照。在避免产生气泡或过度移动的情况下，轻柔地将网状捕获膜插入每个孔中，并使用金属推杆或剪切的P1000移液枪头固定插入物。尽管微型培养室具有足够的深度以容纳典型的小鼠视网膜，但有时网格插件的机械缺陷会导致组织在插入筛网时被过度压缩。如果发生这种情况，只需记录该压碎的组织，并在最终分析中排除该样本。将组织板置于37°C、无二氧化碳的培养箱中孵育至少60分钟。使用混匀、等待、检测和重复命令来设置细胞外通量分析仪。例如，一项典型的视网膜组织实验可能包括以下步骤：混匀2分钟，等待2分钟，检测5分钟。对于基础值记录以及每种待测化合物注射后，均需重复上述三个步骤五到八次。按下细胞外通量分析仪上的程序启动按钮，并根据屏幕提示插入传感器微板进行校准。校准结束后，按照屏幕指示将校准板替换为含有视网膜样本的微板，然后按预设程序运行实验。运行结束后，按照屏幕上的提示弹出组织板。查看运行结果并保存数据文件。使用弯曲的20号针头和镊子将所有膜插件从孔中取出，留下视网膜打孔组织。小心吸除组织中的培养基，并用 0.5 毫升冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织两次。在吸除第二次 PBS 清洗液后，向每次洗涤中加入 100 微升裂解缓冲液，反复吹打以均质化组织。最后，将裂解后的样品与 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液按 1:1 比例稀释，取 100 微升稀释后的样品转移至 96 孔板，根据总双链 DNA 含量定量上样量。然后，向每个孔中加入100微升检测缓冲液，混匀2至5分钟。最后，在激发波长480纳米、发射波长520纳米条件下测定荧光强度，并通过标准曲线进行定量。将原始的细胞外通量信号根据孔内DNA含量进行归一化处理。在基线条件下，存在5 mM葡萄糖和10 mM丙酮酸时，通过细胞外酸化率测得的酸外流速率在野生型动物的视网膜组织与缺乏在光刺激下关闭环核苷酸门控离子通道机制的基因敲除小鼠视网膜组织之间无显著差异。在添加20 mM葡萄糖和糖酵解抑制剂2DG后，也观察到类似模式。这些数据可通过数学方法转换为相对于基线的分数变化，这种形式可能有助于更好地比较不同的实验干预。在基线时，对照组和突变型视网膜组织的绝对耗氧率也相当。加入 20 毫摩尔葡萄糖可增加线粒体呼吸，但在绝对定量或相对于基线的变化方面，各组之间未观察到差异。加入一毫摩尔的FCCP（一种解偶联剂）以检测线粒体最大呼吸速率，并未使对照组和突变型视网膜组织在高葡萄糖条件下的氧消耗率（OCR）显著升高。然而，两组小鼠组织的信号在加入RAA混合物后均急剧下降。综上所述，我们展示了一种用于定量测定小鼠视网膜器官型外植体中氧化磷酸化和糖酵解速率的技术。通过高效分离视网膜组织，该技术可获得可靠且可重复的测量结果。可实时评估暴露因素（如解偶联剂）的作用效果。除本实验步骤外，还可对解剖过程中剩余的组织进行其他方法分析，如定量RT-PCR和蛋白质印迹法，以获取与视网膜代谢研究相关的平行信息。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定

本方案提供了一种利用细胞外通量分析法测定原代白血病细胞胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）的生化方法。对这些细胞代谢特征的评估有助于明确其代谢需求，从而实现个体化治疗。...

细胞外通量测定：一种用于测量细胞代谢特征的方法

本视频展示了利用细胞外通量分析仪分析活化人自然杀伤（NK）细胞能量代谢的方法。电子传递链复合物的不同抑制剂会影响ATP合成，该过程通过氧消耗率（OCR）进行测量，从而提供关于细胞代谢和生物能量学的见解。...

利用细胞外通量分析仪实时监测人自然杀伤细胞的能量代谢

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

本方案提供了一种经济有效的方法，用于分离和鉴定小鼠原代肾小管细胞，随后可对这些细胞进行传代培养，以评估肾脏生物学功能...

小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

本文介绍了一种详细的实验方案，用于开展线粒体应激检测和糖酵解速率检测 离体...

Ex Vivo 视网膜组织样本中线粒体呼吸和糖酵解的测定

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。...

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

这些实验方案将帮助研究人员利用Seahorse细胞外通量分析技术，探究三维培养的癌细胞系来源类球体中的线粒体能量代谢。...

利用细胞外通量分析探索单个三维微组织球体的线粒体能量代谢

人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了其健康状况和功能。本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法检测H-RPE实时代谢通量的优化方案。...

利用高分辨率呼吸测定法对原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学进行实时分析

本文详细描述了从骨髓、脾脏和梗死心脏中提取巨噬细胞的方法，并进一步评估活细胞中代谢通量的实验流程。...

分析 离体 脾脏和心脏巨噬细胞及骨髓单核细胞中的代谢流

本方案描述了一种经济高效的方法，用于进行糖酵解应激测试，以量化原代小鼠小胶质细胞中的代谢重编程。在细胞分离并接受炎症刺激后，使用 freshly prepared、pH...

利用细胞外通量分析法研究原代小胶质细胞中的糖酵解

本文中，我们描述了一种用于定量测定氧消耗率和细胞外酸化率的详细方案 离体...

评估完整再生斑马鱼心室的代谢活性 离体 使用细胞外通量分析法

学习使用细胞外通量分析仪实时测定小鼠视网膜组织的氧消耗率和细胞外酸化率，评估糖酵解与氧化磷酸化水平，为研究视网膜能量代谢及眼部疾病机制提供可靠方法。

利用细胞外通量分析法测量离体视网膜组织中的能量代谢

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