利用细胞外通量分析法测量离体视网膜组织中的能量代谢

该方法有助于回答一些关键问题，例如不同生物样本之间视网膜组织中的能量代谢差异，或在药物处理后的变化。该技术的主要优势在于利用离体的器官型视网膜组织，同时测量糖酵解和氧化磷酸化的速率，并可在体外实时评估干预效应。在进行细胞外通量检测前，需对仪器进行校准：向24孔传感器微板的每孔中加入1毫升校准液，并在37摄氏度、无CO2的培养箱中孵育过夜。

将线粒体应激实验方案或糖酵解实验方案所需的添加剂加入传感器微孔板的各个注射孔中，并根据孔内体积变化进行调整。假设初始孔体积为 450 微升，一次典型的检测需向第一个注射孔加入 45 微升添加剂，第二个孔加入 49.5 微升，第三个孔加入 54.5 微升，最后一个孔加入 60 微升。在前几次实验中，将基础培养基加入 A 孔，以评估注射后组织移动伪影的程度。

将加载好的传感器板置于37摄氏度的非二氧化碳培养箱中孵育至少60分钟。开始分离新鲜的小鼠视网膜组织，使用刚处死的小鼠。用一对中号弯镊在视神经处夹住眼球后部，并轻轻施加向前的压力使眼球突出。

使用干净的剃须刀片，以刀片单次果断地从角膜缘到角膜缘做一次贯穿角膜的切口。用精细的弯头McPherson式镊子夹住眼球后部，将晶状体及前部玻璃体膜从角膜切口处挤出。重复使用镊子进行夹捏操作，以挤出神经视网膜。

然后，使用镊子像勺子一样将视网膜从角膜切口处轻轻抬起。将视网膜直接放入盛有温热培养基的3厘米培养皿或6孔组织培养板中。接着，使用两对精细的弯头McPherson型镊子，轻轻剥离视网膜上残留的玻璃体。

最佳操作方法是抓住视网膜杯周边部的玻璃体，向中心方向牵拉，最终整体将玻璃体从中心处分离。然后，从视网膜的光感受器表面去除残留的视网膜色素上皮细胞。用刀片切割P1000移液器吸头，形成一个约4毫米的开口，以防止在转移操作过程中对 delicate 的视网膜组织造成过度损伤。

然后，使用剪去尖端的移液管头将分离的视网膜组织转移至新鲜培养基中。最后，使用配有推杆的1毫米活检打孔器，在视神经周围切割视网膜组织小片。将视网膜组织小片置于洁净的培养基中，并放置在37°C金属块或加热垫上备用。

收集完所需数量的组织穿孔后，使用剪去尖端的 P1000 吸头吸取 450 微升培养基中的单个穿孔组织，并将其转移至置于 37 摄氏度加热垫或加热块上的 24 孔带环捕获微孔板中。使用精细的直头镊子轻轻将穿孔组织调整至微孔板孔的中央位置，并保持所有穿孔组织方向一致。

例如，将视网膜节细胞侧朝上放置。每次实验需预留三到四个空白孔，每孔加入450 µL基础培养基，作为阴性对照。在避免产生气泡或过度移动的情况下，轻柔地将网状捕获膜插入每个孔中，并使用金属推杆或剪切的P1000移液枪头固定插入物。

尽管微型培养室具有足够的深度以容纳典型的小鼠视网膜，但有时网格插件的机械缺陷会导致组织在插入筛网时被过度压缩。如果发生这种情况，只需记录该压碎的组织，并在最终分析中排除该样本。将组织板置于37°C、无二氧化碳的培养箱中孵育至少60分钟。

使用混匀、等待、检测和重复命令来设置细胞外通量分析仪。例如，一项典型的视网膜组织实验可能包括以下步骤：混匀2分钟，等待2分钟，检测5分钟。

对于基础值记录以及每种待测化合物注射后，均需重复上述三个步骤五到八次。按下细胞外通量分析仪上的程序启动按钮，并根据屏幕提示插入传感器微板进行校准。校准结束后，按照屏幕指示将校准板替换为含有视网膜样本的微板，然后按预设程序运行实验。

运行结束后，按照屏幕上的提示弹出组织板。查看运行结果并保存数据文件。使用弯曲的20号针头和镊子将所有膜插件从孔中取出，留下视网膜打孔组织。

小心吸除组织中的培养基，并用 0.5 毫升冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织两次。在吸除第二次 PBS 清洗液后，向每次洗涤中加入 100 微升裂解缓冲液，反复吹打以均质化组织。最后，将裂解后的样品与 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液按 1:1 比例稀释，取 100 微升稀释后的样品转移至 96 孔板，根据总双链 DNA 含量定量上样量。

然后，向每个孔中加入100微升检测缓冲液，混匀2至5分钟。最后，在激发波长480纳米、发射波长520纳米条件下测定荧光强度，并通过标准曲线进行定量。将原始的细胞外通量信号根据孔内DNA含量进行归一化处理。

在基线条件下，存在5 mM葡萄糖和10 mM丙酮酸时，通过细胞外酸化率测得的酸外流速率在野生型动物的视网膜组织与缺乏在光刺激下关闭环核苷酸门控离子通道机制的基因敲除小鼠视网膜组织之间无显著差异。在添加20 mM葡萄糖和糖酵解抑制剂2DG后，也观察到类似模式。

这些数据可通过数学方法转换为相对于基线的分数变化，这种形式可能有助于更好地比较不同的实验干预。在基线时，对照组和突变型视网膜组织的绝对耗氧率也相当。加入 20 毫摩尔葡萄糖可增加线粒体呼吸，但在绝对定量或相对于基线的变化方面，各组之间未观察到差异。

加入一毫摩尔的FCCP（一种解偶联剂）以检测线粒体最大呼吸速率，并未使对照组和突变型视网膜组织在高葡萄糖条件下的氧消耗率（OCR）显著升高。然而，两组小鼠组织的信号在加入RAA混合物后均急剧下降。综上所述，我们展示了一种用于定量测定小鼠视网膜器官型外植体中氧化磷酸化和糖酵解速率的技术。

通过高效分离视网膜组织，该技术可获得可靠且可重复的测量结果。可实时评估暴露因素（如解偶联剂）的作用效果。除本实验步骤外，还可对解剖过程中剩余的组织进行其他方法分析，如定量RT-PCR和蛋白质印迹法，以获取与视网膜代谢研究相关的平行信息。