Name: 利用笼子分子胶作为可活性标记的活细胞中的贵宾的时空控制核移位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解利用光触发笼状分子胶标签实现活细胞中量子点等客体的核移位技术。该方法通过紫外光或双光子近红外光精确控制药物靶向递送，为基因治疗和低副作用治疗方案的开发提供新途径。

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我们感谢东京大学纳米生物集成研究中心。本研究得到了日本青年科学家研究基金（B）（26810046）对K.O.的资助，以及特别推进行研究基金（25000005）对T.A.的部分资助。R.M.感谢日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究奖学金以及领先研究生院计划（GPLLI）的支持。

1. 准备带有笼锁型Glue-R标签的客体分子
<ol>
	<li>配制光笼型Glue-NBD 溶液。
	<ol>
		<li>按照先前描述的方法合成光笼型Glue-NBD（图1）20。</li>
		<li>用无水二甲基亚砜（DMSO）配制光笼型Glue-NBD 的储备液（10 mM）。 
		注意：将储备液避光保存。使用时可用水性缓冲液或细胞培养基稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制光笼型Glue-QD 溶液。
	<ol>
		<li>按照先前描述的方法合成光笼型Glue-二苯并环辛炔（光笼型Glue-DBCO）（图1）20。</li>
		<li>用无水DMSO配制光笼型Glue-DBCO的储备液（10 mM）。</li>
		<li>为配制光笼型Glue-QD，首先制备叠氮功能化的量子点（叠氮-QD；图3）。将100 µL叠氮-PEG4-NHS酯的二甲基甲酰胺（DMF，125 µM）溶液（图3）加入400 µL胺基功能化聚乙二醇包覆的量子点（Amine-QD；图3）的DMF溶液（500 nM）中。室温下搅拌混合物1小时。</li>
		<li>将所得溶液使用截留分子量为3,500的再生纤维素透析膜，在800 mL DMF中透析24小时。</li>
		<li>用DMF将光笼型Glue-DBCO储备液稀释至50 µM。取200 µL该溶液加入透析后的溶液中（图3），室温下搅拌3小时。</li>
		<li>将所得溶液使用截留分子量为25,000的再生纤维素透析膜，在800 mL DMF中透析24小时。</li>
		<li>用DMF将所得溶液稀释至200 nM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="量子点修饰过程；化学反应图示；胺基到叠氮基的修饰；键合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：CagedGlue-QD 制备过程的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 显微观察用 Hep3B 细胞样品的制备
<ol>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下，将人肝细胞癌 Hep3B 细胞培养于含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 Eagle 最低必需培养基 (EMEM) 中。</li>
	<li>实验前一天接种细胞。每孔加入 5.0 × 103 个 Hep3B 细胞至 8 孔玻璃底培养板中，每孔培养体积为 200 µL EMEM（含 10% FBS），于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。</li>
	<li>吸除培养基，用 100 µL Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (D-PBS) 洗涤细胞样本两次。</li>
</ol>
3. 紫外光诱导小分子客体核转位的观察
<ol>
	<li>将细胞样品（步骤 2.3 中制备）供给 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-NBD (10 µM）并将所得细胞样品孵育于 37 °C 5% CO₂条件下2 3小时。 
	注意：在无FBS的EMEM中孵育细胞样品超过4 h会导致严重的细胞损伤。</li>
	<li>移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。</li>
	<li>为了可视化内体，向细胞样品中加入 200 µL 含红色荧光染料的 EMEM（10% FBS）例如，LysoTracker Red，100 nM），将所得细胞样品于 37 °C 5% CO₂条件下2 20分钟。移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。向细胞样品中加入 200 µL 含10% FBS的EMEM</li>
	<li>核转位 笼锁型Glue-NBD，将细胞样本暴露于紫外光下 2 分钟 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯光源通过光纤照射。对于无需紫外照射的对照细胞样品，将其置于避光条件下保存。 
	注意：可取下玻璃基板的盖子以实现高效的紫外光照射。长时间暴露于紫外光下可能对细胞产生细胞毒性。</li>
	<li>为可视化细胞核，添加 1 µL 加入Hoechst 33342（1 mg/mL）至培养基中，并将所得细胞样品于 37 °C 5% CO₂条件下2 10分钟。</li>
	<li>将细胞样品进行共聚焦激光扫描显微镜观察，并在488 nm激发光下记录显微图像（λ观察 = 500-530 nm），543 nm（λ观察 = 565-620 nm）和 710 nm（双光子； λ观察 分别为NBD、红色荧光染料和Hoechst 33342提供390–465 nm的激发光。</li>
</ol>
4. 双光子近红外光触发的小分子客体核转位观察
<ol>
	<li>向细胞样品（步骤 2.3 中制备）中加入 200 µL 含有 CagedGlue-NBD（10 µM）的无 FBS EMEM 培养基，并将细胞样品在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。</li>
	<li>移除培养基，用 100 µL D-PBS 洗涤细胞样品两次。向细胞样品中加入 200 µL 含 10% FBS 的 EMEM 培养基。</li>
	<li>对细胞样品进行共聚焦激光扫描显微观察，在 488 nm 激发下记录显微图像（λobs = 500–530 nm）。</li>
	<li>为实现 CagedGlue-NBD 的核转位，使用安装在显微镜上的双光子激发激光（710 nm）照射包含目标细胞的区域，持续 2 分钟（30 秒 × 4 次）。按照步骤 4.3 所述方法观察转位过程。</li>
</ol>
5. 紫外光触发的大分子客体核转位观察
<ol>
	<li>将细胞样品（步骤 2.3 中制备）供给 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-QD（10 nM）避光孵育细胞样本 37 °C 5% CO₂条件下2 3小时。</li>
	<li>移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。向细胞样品中加入 200 µL 含10% FBS的EMEM</li>
	<li>核转位 笼锁型Glue-QD，将细胞样本暴露于紫外光下 2 分钟 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯作为光源，通过光纤照射样品。对于无需紫外照射的对照细胞样品，应将其置于避光条件下保存。</li>
	<li>为可视化细胞核，添加 1 µL 加入Hoechst 33342（1 mg/mL）至培养基中，并将所得细胞样品置于培养条件下孵育 37 °C 二氧化碳浓度低于5%2 10 分钟。</li>
	<li>将细胞样品进行共聚焦激光扫描显微镜观察，并在405 nm激发光下记录显微图像（λ观察 = 430-520 nm）和 488 nm（λ观察 = 625–680 nm），分别用于Hoechst 33342和量子点（QDs）。</li>
</ol>
6. 细胞活力检测
<ol>
	<li>在 EMEM（10% FBS）中培养人肝细胞癌 Hep3B 细胞 37 °C 5% CO₂条件下2.</li>
	<li>实验前一天接种细胞。接种 5.0 × 103 96孔培养板中每孔接种Hep3B细胞，使用EMEM培养基（含10% FBS） 200 µL），并在指定条件下孵育细胞样品 37 °C 低于 5% CO₂2 24 h。</li>
	<li>移除培养基，并用缓冲液冲洗细胞样本 100 µL 用 D-PBS 洗涤两次。</li>
	<li>向细胞样品中加入 200 µL 不含FBS的EMEM 笼锁型Glue-NBD（0.1–100 µM）并将所得细胞样品孵育于 37 °C 5% CO₂条件下2 3 小时。</li>
	<li>将细胞样品暴露于紫外光下 2 min 通过 使用配备365 nm带通滤光片的100 W氙灯光源通过光纤照射。对于未进行紫外照射的对照细胞样品，将其置于避光环境中。</li>
	<li>添加 10 µL 细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）试剂10 µL) 加入培养基中，并将所得的细胞样品在 37 °C 低于 5% CO₂2 2小时。</li>
	<li>将细胞样品进行吸收光谱分析（λ 使用酶标仪在 450 nm 波长下检测。</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
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<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

先前关于光触发蛋白质转位至细胞核的研究是通过使用笼锁型核定位信号（caged NLS）实现的7,8,9。如前所述，这些方法需要额外的技术手段将带有NLS标签的蛋白质导入细胞质。相比之下，我们的CagedGlue-R标签不仅能够实现光诱导的核转位，还可促进客体分子的细胞摄取。这一特性使CagedGlue-R标签在活体（in vivo）应用中具有显著优势。
的 笼锁型Glue-R标签可将大分子客体（如量子点）递送至细胞核内。此处使用的量子点直径较大（DH 比核孔（约5 nm）更大（15-20 nm）24，表明了递送其他无法被动扩散进入细胞核的大分子的可能性。已有成熟的方案可用于在生物大分子表面功能化修饰叠氮基团。2...

细胞核携带遗传信息，是重要的细胞器之一，也是亚细胞药物递送的关键靶点，因为调控基因的复制和表达对于治疗包括癌症和遗传性疾病在内的多种疾病具有显著效果1,2,3。为了实现药物向细胞核的递送，研究人员已广泛探索将肽类标签（如核定位信号，NLS）4,5,6与药物偶联的策略。然而，为了减少不必要的副作用，对核转位过程进行时空控制十分必要。
此前，已有研究通过使用笼锁型核定位信号（caged NLS）实现光触发蛋白向细胞核的转位7,8,9。核定位信号（NLS）通过与细胞质转运蛋白结合而进入细胞核6。在已报道的方法中，携带笼锁型NLS的客体蛋白通常通过显微注射直接导入细胞质8，或利用遗传密码子扩展技术在靶细胞内表达9。因此，能够同时实现细胞摄取和光诱导核转位的方法在实际应用中更具优势。
本文中，我们描述利用树状笼状分子胶实现活细胞中客体分子光触发核转位的方法笼锁型Glue-R 图1）标签。水溶性分子胶10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23 含有多个胍基+ 已开发出可紧密附着于蛋白质的悬挂物11,12,13,14,15,16,17核酸18,19,20磷脂膜21和黏土纳米片22,23 通过其胍基之间形成多个盐桥+ 靶标上的悬挂基团和含氧阴离子基团。Gu+ 吊坠 笼锁型Glue-R 由一种阴离子型光裂解基团保护，即丁酸取代的硝基愈创木氧羰基（BANVOC）。用标记的客体分子 笼锁型Glue-R 被活细胞摄取 通过 内吞作用并在内体中停留（图2）。在光照下， BANVOC基团 笼锁型Glue-R 解笼释放出未结合的分子胶（解笼含多个 Gu 的 Glue-R）+ 悬挂基团，从而促进标记的客体分子迁移至细胞质，随后进入细胞核（图2）。该 笼锁型Glue-R 标签可通过暴露于紫外光或双光子近红外（NIR）光进行解笼，且无明显光毒性。我们展示了大分子客体以及小分子客体的时空可控核递送， 笼锁型以量子点（QDs）和荧光染料（硝基苯并噁二唑；NBD）分别作为Glue-R标签的示例。
<img alt="笼锁型Glue-R化学反应示意图，紫外光或近红外光解笼，有机合成过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：CagedGlue-R的结构示意图。 CagedGlue-R的9个胍基阳离子（Gu+）侧链被丁酸取代的硝基愈创木氧羰基（BANVOC）基团保护。BANVOC基团可通过紫外光或双光子近红外光照射裂解。CagedGlue-R的核心部分可修饰硝基苯并二唑（NBD）或二苯并环辛炔（DBCO）。经参考文献20许可转载。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分子标记的内吞作用示意图；包括光触发去笼和核转位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：与CagedGlue-R标签偶联的客体分子光触发核转位的示意图。 客体分子与CagedGlue-R的偶联物通过内吞作用被活细胞摄取。via 光照后，CagedGlue-R标签发生去笼反应，生成UncagedGlue-R标签，从而促进标记客体分子从内体中逃逸。随后，该标记的客体分子迁移进入细胞核。经参考文献20许可重印。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>叠氮-PEG4-活性酯</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>再生纤维素膜（截留分子量 3,500）</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>再生纤维素膜（截留分子量 25,000）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B 细胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>8孔玻璃底培养皿</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>伊格尔最小必需培养基（EMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>配备双光子激发激光器（Mai Tai 激光器，Spectra-Physics）</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>氙灯光源</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Paradigm</td><td></td></tr></tbody></table>

利用笼锁型分子胶作为光激活标签在活细胞中实现客体蛋白的时空可控核转位

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

细胞核作为亚细胞药物递送的重要靶点之一，因其基因复制与表达的调控在治疗多种疾病中具有显著效果。本文展示了利用笼锁型分子胶实现光触发的客体分子向细胞核转位笼锁型Glue-R) 标签，其含有多个胍基离子（Gu+) 由阴离子光解基团（丁酸取代的硝基愈创木氧羰基）保护； BANVOC)。标记有 笼锁型Glue-R 被活细胞摄取 通过 内吞作用并保留在内体中。然而，在光照后， 笼锁型Glue-R 被转化为去笼化分子胶（uncaged molecular glue）去封闭携带多个Gu的Glue-R）+ 悬挂基团，有助于客体分子的内体逃逸及其后续向细胞核的转运。该方法在位点选择性靶向细胞核的药物递送方面具有潜力，因为只有在光照条件下，带标记的客体分子才能依次迁移进入细胞质和细胞核。 笼锁型Glue-R 标签可递送大分子客体（如量子点（QDs））以及小分子客体。 笼锁型Glue-R标签不仅可被紫外光解笼，还可被双光子近红外（NIR）光解笼，后者可深入穿透组织。

在光照射前，与CagedGlue-NBD共同孵育的Hep3B细胞在其内部呈现点状荧光发射（λext = 488 nm；图4A和4C，绿色）。在543 nm激发下，红色荧光染料也获得了类似的显微图像（图4B和4C，红色），表明CagedGlue-NBD定位于内体中。相应地，归属于CagedGlue-NBD的荧光发射（图4D，绿色）出现在细胞核外，细胞核由Hoechst 33342染色显示（λext = 710 nm，双光子；图4D，蓝色）。紫外光照射后，细胞在细胞核区域（图4E，蓝色）也发出来自NBD的荧光（<stron...

本方案描述了利用笼锁型分子胶标签在活细胞中实现光触发客体分子核转位的方法。该方法在位点选择性核靶向药物递送方面具有广阔前景。

细胞核作为亚细胞药物递送的重要靶点之一，因其对基因复制和表达的调控作用而具有关键意义。

该方法有助于解答药物递送领域中的关键问题，例如如何将药物递送至特定的细胞颗粒结构。该技术的主要优势在于，可通过光照诱导气体发生核转位。本次实验操作将由本课题组的研究生 Rina Mogaki 和 Akio Arisaka 进行示范。首先，通过合成与二苯并环辛炔连接的笼状分子胶来制备量子点连接的笼状分子胶，具体合成方法可参见其他文献的详细描述。用无水DMSO配制10毫摩尔/升的笼状分子胶连接二苯并环辛炔储备液。然后，通过首先制备末端功能化的量子点，来制备量子点连接的笼状分子胶。为此，将100微升浓度为125微摩尔的aseye PEG4 NHS酯DMF溶液加入400微升DMF溶液中，该DMF溶液含有500纳摩尔表面包被胺基功能化PEG的量子点。室温下搅拌混合物1小时。将所得溶液置于再生纤维素透析膜中，用800毫升DMF透析24小时。接下来，用DMF将笼状分子胶连接的二苯并环辛炔储备液稀释至50微摩尔，并取200微升加入透析后的溶液中。室温下搅拌混合物3小时。然后将所得混合物用截留分子量为25000的再生纤维素膜，在800毫升新鲜DMF中透析24小时。24小时后，用DMF将所得溶液稀释至200纳摩尔。在标准培养条件下，将人肝细胞癌HEP3B细胞维持于含10%胎牛血清的Eagle最小必需培养基中。实验前一天，将5000个HEP3B细胞接种于8孔玻璃培养板的每个孔中，每孔体积为200微升培养基。然后盖上盖片，将载玻片放入培养箱中孵育24小时。第二天，移除培养基，并用100微升预热的PBS洗涤细胞两次。向8孔载玻片的每个孔中加入200微升含10微摩尔荧光标记的笼状分子胶的胎牛血清（FBS）无血清培养基。孵育3小时后，移除培养基，并用100微升PBS将细胞样品冲洗两次。为观察内体，加入含有100纳米浓度红色荧光染料（如LysoTracker Red）的200微升培养基。将处理后的细胞样品继续孵育20分钟。然后吸去培养基，用100微升PBS将细胞样本冲洗两次。随后将细胞重新置于200微升培养基中。为诱导荧光标记的笼状分子胶发生核转位，将细胞置于配备365纳米带通滤光片的100瓦氙灯光源下照射。将细胞暴露于紫外光下照射 2 分钟。在此期间，将对照细胞样品置于黑暗环境中，避免紫外光照射。为实现有效的紫外光照射，可取下玻璃基板的盖子，但需注意，长时间暴露于紫外光下可能导致细胞死亡。为了观察细胞核，向培养基中加入一微升 Hoechst 染料。将处理后的细胞样本孵育 10 分钟，然后将样本置于共聚焦激光扫描显微镜的载物台上。记录荧光标记的笼状分子胶、LysoTracker Red 和细胞核染色剂的显微图像。如先前所示，将5000个人类肝细胞癌HEP3 B细胞接种到8孔细胞培养板的每个孔中，在标准条件下培养24小时。向细胞样品中加入200 µL含荧光标记的笼状分子胶的无FBS培养基。将

spatiotemporally-controlled-nuclear-translocation-guests-living-cells

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科研

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Chemistry

化学

利用笼子分子胶作为可活性标记的活细胞中的贵宾的时空控制核移位

对表达 SNAP-tag 融合蛋白的 COS-7 活细胞进行荧光标记以用于活细胞成像

单分子显微镜技术为核转运过程提供了新的见解。...

单分子成像技术观察核转运

本文描述了一种利用光控小GTP酶活性的时空调控方法。该方法基于雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化及光敏保护基团系统。通过优化光照条件，可实现亚细胞水平上小GTP酶活性的时空精确控制。...

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。...

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

本方案描述了如何高效地建立并执行活细胞成像数据的自动化分析，这些数据是通过光遗传学工具追踪核质运输获得的。...

利用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具及自动化图像分析定量活细胞中核质运输动态

了解利用光触发笼状分子胶标签实现活细胞中量子点等客体的核移位技术。该方法通过紫外光或双光子近红外光精确控制药物靶向递送，为基因治疗和低副作用治疗方案的开发提供新途径。

利用笼锁型分子胶作为光激活标签在活细胞中实现客体蛋白的时空可控核转位

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