Name: 基于多步法链位移光刻的基因功能表面固定化研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习多步法链位移光刻技术，用于基因长度DNA表面固定化及无细胞基因表达研究。该方法具有可重复性强、组件商业化易得等优势，可应用于合成生物学与生物芯片开发。

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我们衷心感谢大众基金会（资助编号：89 883）和欧洲研究理事会（资助协议编号：694410 - AEDNA）对本项目提供的资金支持。M.S.-S. 感谢德国研究基金会通过 GRK 2062 项目提供的支持。

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

光刻前是一种用于DNA或RNA图案化固定的强大且多功能的技术。然而，该过程包含多个步骤，如果这些步骤发生改变，可能会导致系统失败或性能降低。
Bephore芯片制备过程中的一个关键步骤是基底的PEG化，该步骤可提供表面的生物相容性。此处，采用RCA程序进行清洗步骤至关重要，因为该步骤还能活化表面，以利于后续的硅烷化反应。在实际的PEG化过程中，基底必须始终保持湿润，不得干燥。此外，Silane-PEG-Biotin必须妥善保存，以维持其反应活性（见第1.2节），并避免发生交联。为评估PEG化的效果，可将基底与荧光标记的链霉亲和素孵育，并与未进行PEG化的对照组进行比较。成功完成PEG化的基底应比对照组结合显著更多的链霉亲和素。
此外，在光刻工艺的后期阶段，芯片的干燥会产生不利影响，导致 例如 已结合DNA的去除，或DNA向底物未曝光区域的更高吸附。
如上文（第3.2节）所述，光刻工艺的分辨率和所需的曝光时间取决于实验装置（物镜、光源， 等等。</...

无细胞基因表达反应在生物化学、生物技术及合成生物学的多种应用中备受关注。无细胞蛋白质表达对于制备高纯度蛋白质样品起到了关键作用，这些样品是大量结构生物学研究的基础。例如，无细胞系统已成功用于表达使用基于细胞的表达方法难以制备的蛋白质复合物1或膜蛋白2。值得注意的是，无细胞基因表达反应还被用于解析遗传密码的结构，始于1961年Nirenberg和Matthaei的开创性实验3。
近年来，无细胞方法在生物技术和合成生物学领域重新受到关注4,5,6无细胞系统可加入非生物化合物，且更易于组合不同生物来源的组分。7。尽管无细胞系统明显存在缺乏完整细胞环境的缺点 &#34;生长与分裂&#34;可以设想制备具有基本代谢功能的开放式无细胞生物反应器，在提供简单的碳源和能源输入后，使其合成代谢产物。8在合成生物学这一新兴领域中，无细胞系统有望表现出更高的可预测性 &#34;底盘&#34; 用于实现合成生物学功能。
目前，无细胞基因表达反应通常采用来自不同来源（如细菌、酵母、昆虫）的细胞提取物，或针对不同应用优化的转录/翻译系统来完成。例如， 原核生物 与 真核基因表达，膜蛋白生产 等等。）。V. Noireaux 及其同事最近提供了一种制备细菌细胞提取物（通常称为 TXTL）的常用方案9其生物物理特性已被充分表征10，并且TXTL系统已成功用于执行一系列复杂的生化任务： 例如， 功能性噬菌体的组装 通过 噬菌体基因组的无细胞表达11细菌蛋白质丝状结构的合成12，或无细胞基因线路的构建与应用13,14.
在无细胞合成生物学中，另一个广受欢迎的系统是PURE系统，该系统由纯化的组分重新构建而成15,16。与TXTL系统相比，PURE系统不含核酸酶或蛋白质降解机制。虽然在线性DNA、RNA分子或蛋白质的降解方面，PURE系统的问题较少，但降解通路对于实现动态功能实际上具有重要意义。为了减少TXTL系统中线性基因模板因RecBCD导致的外切核酸酶降解，必须添加具有末端保护功能的GamS蛋白。TXTL系统和PURE系统目前均有商业化供应。
一个与无细胞生物学密切相关的话题是研究区室化对生化反应的影响，并进一步构建类似细胞的人工结构或原始细胞17,18,19,20。人工细胞的研究通常涉及将生化反应系统包裹在由磷脂或其他两亲性分子形成的囊泡结构内部。尽管这类系统有助于探索区室化的基础特性，或细胞特性及自复制结构的形成机制，但它们面临封闭系统常见的问题：在缺乏功能性代谢系统和适当的膜转运机制的情况下，难以使区室内的反应长时间持续进行——燃料分子被消耗殆尽，而代谢废物不断积累。
利用光刻技术在类似细胞的区室内部实现遗传物质的空间组织，是区室化的一种有趣替代方案。十多年前，魏茨曼科学研究所的Bar-Ziv团队率先实现了将&#34;基因固定在芯片上&#34;的技术21。该技术需要解决的主要问题包括DNA在芯片表面的非特异性吸附以及蛋白质在芯片表面可能发生变性。Bar-Ziv 等人开发了一种专用的光刻胶，称为&#34;Daisy&#34;，其结构包含一个用于将光刻胶分子固定在二氧化硅表面的反应性末端硅烷，一个确保生物相容性的长聚乙二醇（PEG）间隔臂，以及一个光可裂解的头基团；该头基团在紫外光（UV）照射下会转化为反应性胺基。研究表明，Daisy可用于将长度为数个千碱基对（kbp）的基因级DNA分子固定在芯片表面。从高分子物理的角度来看，该体系代表了接枝在固体基底上的高分子刷结构。由于DNA具有聚电解质特性，这些高分子刷的构象受到渗透压及其他离子特异性效应的显著影响22,23。
最重要的是，已有研究表明，固定在基底上的基因仍然具有功能，能够被转录并翻译成RNA和蛋白质。溶液中的RNA聚合酶可以接触到基因刷24，且转录/翻译过程中复杂的生物大分子混合物在表面不会发生变性。将遗传组分固定在基底上的优势之一是，可在开放的微流控反应系统中对其进行操作，该系统可持续供给小分子前体，并能移除废物产物25,26。
我们最近开发了该方法的一种变体，称为Bephore（意为生物相容性电子束和光刻胶）27，该方法完全基于商业化组件，并利用序列特异性的DNA链侵入反应，实现了一种易于实施的多步光刻工艺，用于构建基于芯片的人工细胞。该工艺的示意图如下所示 图1基于含有光裂解基团的DNA发夹分子，这些分子被固定在生物相容性PEG上&#160;层。发夹结构的光解会暴露出单链的趾部序列，通过该序列可使目标DNA分子（含有 &#34;置换&#34; DIS序列）可以连接 通过 由趾部介导的链入侵
尽管Bephore在实施上可能更为简单，但Daisy能够实现非常密集且清晰的&#34;基因刷&#34;，这在某些应用中具有优势。然而从原理上讲，Daisy和Bephore光刻技术可以很容易地结合使用。Huang et al.此前曾开发出一种利用DNA链置换在金表面构建DNA刷的相关光刻方法，但该方法尚未应用于无细胞基因表达的场景中28,29。
在以下实验方案中，我们详细描述了利用Bephore方法制备用于无细胞基因表达的DNA刷的过程。我们介绍了基因芯片的制备方法，并演示了如何通过多步光刻技术实现基因在芯片上的空间有序固定。此外，我们还讨论了反应腔室的制备，以及如何应用微流控技术在芯片上进行基因表达反应。

<table><tbody><tr><td>带50 nm二氧化硅的硅片（Bephore基底）</td><td>Siegert Wafer</td><td></td><td>厚度（&amp;micro;m）：525 &amp;plusmn;25，直径（mm）：100</td></tr><tr><td>硅片（用于PDMS主模具）</td><td>Siegert Wafer</td><td></td><td>厚度（&amp;micro;m）：525 &amp;plusmn;25，直径（mm）：76.2（3&amp;rdquo;）</td></tr><tr><td>4号载玻片</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm × 50 mm</td></tr><tr><td>1.5号载玻片</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm × 24 mm</td></tr><tr><td>生物素-PEG-硅烷</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>分子量 5,000</td></tr><tr><td>无水甲苯</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion高保真PCR预混液（含HF缓冲液）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>PCR试剂盒</td></tr><tr><td>Wizard SV凝胶和PCR纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>离心柱式PCR纯化试剂盒</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>无细胞表达系统</td></tr><tr><td>PDMS&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管（内径：0.8 mm，外径：1.6 mm）</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>micro resist technology&amp;nbsp;GmbH</td><td></td><td>光刻胶</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>micro resist technology&amp;nbsp;GmbH</td><td></td><td>光刻胶显影液</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>粘附促进剂</td></tr><tr><td>双组分硅胶</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紫外防护黄色胶片</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻用掩膜板</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64,000 dpi，180 mm × 240 mm</td></tr><tr><td>正置显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>用于光刻和荧光成像</td></tr><tr><td>60倍水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.9</td></tr><tr><td>20倍水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.5</td></tr><tr><td>相机</td><td>Photometrics</td><td>Coolsnap HQ</td><td>与Olympus BX51联用</td></tr><tr><td>光源</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>与Olympus BX51联用</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>用于基因表达的荧光成像</td></tr><tr><td>4倍物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>与Nikon Ti2-E联用</td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>与Nikon Ti2-E联用</td></tr><tr><td>光源</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>与Nikon Ti2-E联用</td></tr><tr><td>培养箱笼式孵育器</td><td>Okolab</td><td>bold line</td><td>与Nikon Ti2-E联用</td></tr><tr><td>压力控制器</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td></td><td>用于DNA浓度测定</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W，法拉第笼内操作，气压0.8 mbar</td></tr></tbody></table>

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

将基因固定在光刻结构化表面上，可在开放式的微流控生物反应器系统中研究区室化的基因表达过程。与其他构建人工细胞系统的方法相比，该装置可实现基因表达试剂的持续供给以及代谢废物的同步排出。这有助于长时间维持无细胞基因表达过程，对于实现动态基因调控反馈系统具有重要意义。本文提供了一种利用基于DNA链置换反应的简易光刻技术制备基因芯片的详细方案，该技术仅使用商业化组件。同时，我们还提供了将区室化基因与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控系统集成的操作流程。此外，我们证明该系统可与全内反射荧光（TIRF）显微镜兼容，可用于直接观察DNA与表达混合物中分子之间的分子相互作用。

两步光刻： 图5 展示了在载玻片上进行两步光刻工艺的结果，该载玻片上具有重叠的荧光标记DIS链图案。
基因刷中荧光蛋白的表达：图6展示了从固定化DNA中表达荧光蛋白YPet的结果。我们在多个时间点通过部分漂白荧光蛋白并观察荧光信号的恢复情况来评估基因表达速率，忽略立即发生的恢复（该恢复并非由蛋白质表达引起）。在表达2小时后首次漂白时，荧光强度迅速恢复并超过漂白前的水平；而在表达4小时和6小时后，荧光强度未能恢复至先前水平，表明在没有新鲜表达混合物供应的情况下，反应在约3–4小时后终止。
与微流控技术联用：通过向表达区室持续供给额外的前体分子，可延长基因表达的持续时间 通过 微流控技术 <stron...

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。

将基因固定在光刻结构化表面上，可实现对开放微流控系统中区室化基因表达过程的研究。

DNA生物芯片是一种用于自合成生物学的有吸引力的研究平台，最初由BASF集团开发，可实现体外基因线路在较长时间内的运行。通过本方案，我们希望使该技术能够被更广泛的研究人员所使用。我们的方法称为bephore光刻技术，代表了一种基于DNA链置换反应的DNA固定化策略。该技术的优势在于其多步光刻能力、操作简便且可重复，以及所有组件均可商业化获得。与其他生物芯片解决方案类似，bephore 可与不同技术结合使用。例如，可在微区室中组装功能性基因刷以实现蛋白质表达。首先，在玻璃烧杯中将五份水与一份30%氨水溶液混合，配制RCA溶液。在加热板上边搅拌边将混合物加热至70摄氏度。当温度达到70摄氏度时，加入一份30%过氧化氢。然后将一片直径为100毫米的硅片放入溶液中，以去除其上的有机物和颗粒。30分钟后，取出基底，用洗瓶中的水彻底冲洗，并用氮气枪吹干。随后立即进行基底的聚乙二醇化（PEGylation）处理。为此，首先将生物素-PEG-硅烷溶于干燥甲苯中，配制成浓度为 5 毫克/毫升的溶液，并涡旋振荡至充分混匀。将基底置于玻璃培养皿中，缓慢用移液器将溶液滴加到基底表面，确保覆盖整个表面，但避免溶液溢出边缘。表面完全覆盖后，盖上培养皿盖，再额外加盖一层覆盖物。30分钟后，移去盖子，向培养皿中加入约40毫升异丙醇。然后取出基底，再次用异丙醇彻底冲洗，并用氮气枪吹干。干燥后，将基底避光保存，直至需要时使用。使用玻璃刀或手术刀制备一厘米见方的基底材料。然后，在基底中心向边缘处轻轻划一道短划痕，作为简单的对齐标记。使用氮气枪吹去芯片表面的微小颗粒。接下来，混合两滴双组分硅胶，将胶涂抹在芯片表面，但留出划痕尖端周围的区域不涂胶。此处的胶可形成疏水屏障，使水溶液保留在芯片上。这有助于后续的洗涤步骤，并减少孵育所需的DNA用量。在后续步骤中，胶水可轻松剥离。在接下来的操作中，光裂解 DNA 仅在黄光环境下进行处理。在室温下，将约 10 微升的 bephore 混合物覆盖于芯片上，并将芯片置于部分装有水的盒子中，以减少蒸发。一小时后，用 PBS 多次洗涤芯片，以去除未结合的偶联混合物。接着，向芯片中加入 10 µL 封闭混合物。两小时后，用 PBS 多次洗涤芯片，以去除未结合的封闭试剂。将打印好的光刻掩模裁剪至合适尺寸，以适配相应的掩模 holder。将其插入视场光阑的位置，并利用对准标记在 holder 中对准掩模。将基底放置在显微镜载物台上，在照明光路中插入红色滤光片，并聚焦到基底表面。然后，移动至将要曝光的基底区域。接着，插入掩模架，遮挡照明光源，并更换为紫外滤光片。在较低光照强度下打开快门，利用相机快速将掩模聚焦到基底上。在基底已对准且掩模清晰对焦后，遮挡通往相机的光路，并以所需的曝光时间用高强度光照照射基底。曝光后，将样品从显微镜上取下，小心地尽可能去除基底上的缓冲液，但不得使其干燥。随后，加入10至20微升含有用于表面附着序列的DNA。将底物置于湿盒中以防止干燥，并在室温下孵育两小时，使 DNA 固定在底物上。为了在倒置显微镜下观察分区的基因表达，首先需分别准备样品 holder 的两个部分。先使用双面胶带将带有固定化基因刷的 bephore 芯片粘接到芯片 holder 上。接下来，在夹具底部中央孔周围涂抹一些真空脂，然后插入芯片夹具。现在组装夹具的上部。用刀片切割出带有尽可能小腔室的薄PDMS芯片，并在其中一侧留出一个开放通道，以便后续通过扩散交换废液和前体分子。接着，使用氧气等离子体对PDMS芯片背面的玻璃盖玻片进行等离子体处理。处理后立即把PDMS芯片放置在载玻片中央，使微室朝上。然后将载玻片与PDMS在70摄氏度下烘烤一小时。在组装整个样品 holder 前不久，用等离子体处理带有PDMS芯片的载玻片，方法同前。然后，在上部固定器的大孔周围涂抹一些真空脂，将带有 PDMS 的玻片放置其上。轻轻将玻片压向真空脂。小心地从芯片中移除缓冲液，并用 10 微升自表达系统清洗一次。接下来，将60微升的自表达系统加入芯片中，并去除边缘的双组分硅胶。然后，在PDMS上加入20微升表达系统。将液滴放置到PDMS上后，应立即在体视显微镜下检查，确保各微室充分润湿且无气泡。如果有气泡，请尝试将其冲洗掉。在体视显微镜下进行操作，以组装支架的两个部分，并对齐样品室和DNA刷。使用夹持臂固定底部支架，以便双手可以方便地接触到两个螺钉和翼形螺母。将上部夹具插入下部夹具中，并向下移动，直至无细胞表达体系的液滴发生融合。然后，检查确保各个腔室及对齐标记在XY平面上处于相似的位置。从底部拧紧翼形螺母，直至其接触到夹具的底侧。在将腔室与芯片在 XY 平面内对齐时，应轻轻拧紧翼形螺母。此步骤需要一定的操作经验，并取决于样品 holder 的具体结构。应仅施加轻微的作用力，使 PDMS 轻柔地压在芯片上。接下来，用清水喷洒防蒸发腔室内的海绵，然后将样品台插入盒中。随后，用5毫升注射器吸取双组分硅胶，并用其密封盒子。最后，将盒子转移至温控显微镜下，通过荧光显微镜观察DNA刷及反应过程。一种两步光刻工艺，在此以石英玻璃载片为基底进行，可产生重叠的荧光标记DNA链图案。在此芯片上基因表达的演示中，DNA被固定在左侧腔室中。当暴露于表达混合物时，黄色荧光蛋白YPet即由固定的DNA合成。为了评估基因表达系统的活性，在漂白步骤后观察荧光的恢复情况。在两小时时，荧光强度迅速恢复；然而，在四小时和六小时时，荧光未恢复，表明若无新鲜表达混合物的补充，反应在约四小时左右终止。尽管在封闭系统中基因表达受到限制，但通过微流控技术向表达区室持续补充前体分子，可使基因表达维持更长时间。bephore 方法可用于固定寡核苷酸或基因长度的 DNA，该技术可应用于构建相互作用的 DNA 刷系统，以实现自驱动的基因表达。该技术还可用于生物物理学中的其他应用，例如单分子荧光研究。观看本视频后，您应能够利用晶圆或载玻片制备生物芯片，并将其整合到您的科研项目中。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

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