基于多步法链位移光刻的基因功能表面固定化研究
October 25th, 2018
我们描述了一种简单的光刻程序, 用于固定在表面上的基因长度 DNA 分子, 可用于在生物芯片上执行无细胞基因表达实验。
DNA生物芯片是巴斯夫集团最初开发的自合成生物学的有吸引力的研究平台，它允许在较长时期内进行体外基因回路的运行。通过这个协议，我们希望使这项技术提供给更广泛的研究人员。我们的方法，即贝福光刻，代表了基于DNA链位移反应的DNA固定策略。
该技术的优势在于其多步平版学功能、简单的可重复性以及所有组件的商业可用性。与其他生物芯片解决方案类似，贝福可以与不同的技术结合使用。例如，功能基因刷可以组装在微室中进行蛋白质表达。
首先，在玻璃杯中将五个部分的水与 30% 氨溶液的一部分混合，来准备 RCA 混合物。搅拌时，在热盘上将混合物加热至70摄氏度。一旦达到70摄氏度，加入一部分30%过氧化氢。
然后将直径为 100 毫米的硅晶片放入溶液中，从溶液中去除有机材料和颗粒。30 分钟后，拿出基材，用洗涤瓶中的水彻底冲洗，然后用氮气枪擦干。立即进行基材的PEGylation。
为此，首先将干甲苯中的生物素PEG-Silane稀释至每毫升5毫克，然后涡旋溶液，直到混合良好。将基板放在玻璃培养皿中时，缓慢移液将溶液移液到基材上，覆盖整个表面，但避免让溶液流过边缘。覆盖表面后，关闭培养皿，然后添加额外的盖。
30分钟后，取下盖子，在培养皿中加入约40毫升的异丙醇。然后拿出基材，用异丙醇再次彻底冲洗，然后用氮枪擦干。干燥时，将基板存放在黑暗中，直到需要。
使用玻璃切割机或手术刀准备基材，形成一厘米一厘米的碎片。然后，通过从中心向基板边缘进行短划，添加一个简单的对齐标记。使用氮气枪将任何小颗粒从芯片上吹下来。
接下来，混合两个两组分硅胶液滴，将胶水涂抹在芯片表面，使划痕尖端周围的区域空白。在那里，胶水提供了一个疏水屏障，保持水溶液在芯片上。这有利于后续的洗涤步骤，并减少孵育所需的DNA量。
在稍后的步骤中，胶水可以很容易地剥离掉。在以下步骤中，光可回收的DNA仅在黄光环境中处理。在室温下用约10微升的贝福混合物盖住芯片，将芯片放在部分装满水的盒子里，以减少蒸发。
一小时后，用 PBS 清洗芯片几次，以去除任何未绑定的贝福混合。接下来，向芯片中加入10微升的钝化混合物。两小时后，用 PBS 清洗芯片几次，以去除未绑定钝化剂。
将打印的照片蒙版切割到适当的尺寸，以便适合合适的蒙版支架。将其插入到场止步位置，并使用对齐标记在支架中对齐蒙版。将基板放置在显微镜阶段时，将红色滤光片插入照明路径，并聚焦到基板表面。
然后，导航到将暴露的基板区域。接下来，插入蒙版支架，遮挡照明，然后更改为 UV 滤镜。在低光照强度下，打开快门，然后使用相机快速将蒙版对焦在基板上。
现在，当基板对齐且蒙版对焦时，阻断摄像机的光路，并在高光照强度下照亮基板，以达到所需的曝光时间。曝光后，从显微镜上取出样品，在不干燥的情况下小心地从基材上取出尽可能多的缓冲液。然后，添加 10 到 20 微升的 DNA 与序列附着到表面。
将基板放在湿盒中，防止其干燥，并在室温下在基材上孵育DNA两小时。为了观察倒置显微镜上的分节基因表达，首先分别准备样品支架的两个部分。首先，使用双面胶带，用固定基因刷将贝福片粘在芯片支架上。
接下来，在支架底部的中心孔周围添加一些真空润滑脂，然后插入芯片支架。现在组装支架的顶部。切割一个尽可能小的薄PDMS芯片，将通道开到一侧，以便以后通过扩散交换废物和前体分子。
治疗后，立即将 PDMS 芯片放在玻璃滑梯的中心，隔间朝上。然后，用 PDMS 将玻璃杯在 70 摄氏度下烘烤一小时。在组装整个样品架之前，等离子处理玻璃幻灯片与PDMS芯片一样。
然后，在顶部支架的大孔周围添加一些真空润滑脂，并将带 PDMS 的玻璃滑梯放在上面。轻轻将玻璃压在润滑脂上。小心地从芯片上取出缓冲液，用10微升的自重表达系统清洗一次。
接下来，在芯片上添加60微升的自再表达系统，从边缘去除双组分硅胶。现在，在 PDMS 上添加 20 微升表达式系统。将液滴放置到 PDMS 上后，快速在立体显微镜中检查隔间是否湿润且无气泡。
如果有气泡，试着把它们洗掉。要组装支架的两块，并对齐腔室和DNA刷，在立体显微镜下工作。用抓手臂固定底部支架，以便用双手轻松接触到两个螺钉和翼子奶。
将顶部支架插入底部支架，然后将其降低，直到无细胞表达系统熔断熔断。然后，检查以确保隔间和对齐标记位于 XY 平面中的相似区域中。从底部拧紧翼子板，直到它们接触支架的底部。
对齐 XY 平面中的隔间和芯片时，轻轻拧紧翼子。此步骤需要一些经验，并取决于样品支架的构造。PDMS 应仅以温和力压在芯片上。
接下来，在防蒸发外壳中用水喷洒海绵，并将支架插入包装盒中。然后，用两组糖胶填充五毫升注射器，并用它来密封盒子。最后，将盒子转移到温度控制显微镜，并使用荧光显微镜对DNA刷和反应进行成像。
两步光面图过程，在这里执行的贝福玻璃幻灯片，产生重叠的荧光标记DNA链模式。在这个芯片上基因表达的演示中，DNA在左边的腔室中固定。当暴露在表达混合物中时，黄色荧光蛋白YPet从固定DNA合成。
为了评估基因表达系统的活性，在漂白步骤后观察到荧光的恢复。两小时后，荧光强度迅速恢复。然而，经过4和6个小时，它并没有恢复，表明没有新的供应的表达组合，反应终止约第四小时。
虽然基因表达在封闭系统中是有限的，但可以通过微流体向表达室提供额外的前体分子，可以持续更长时间。bephore方法用于固定寡核苷酸或基因长度DNA，可用于构建相互作用的DNA刷系统，用于自我再基因表达。该技术还可用于生物物理学的其他应用，如单分子荧光研究。
看完此视频后，您应该能够从晶圆或玻璃幻灯片中制造贝福生物芯片，并将其集成到您的研究项目中。
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概述
本文介绍了一种用于在表面上固定基因长度DNA分子的光刻术程序，便于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。该方法被称为bephore光刻术，利用DNA链置换反应进行有效的固定。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 遗传学
- 生物工程学
背景
- DNA生物芯片对于自我复制的合成生物学至关重要。
- 最初由BASF集团开发，它们实现了体外基因电路操作。
- 该技术旨在扩大研究人员的可及性。
- Bephore光刻术是一种新的DNA固定方法。
研究目的
- 介绍一种简单且可重复的DNA固定方法。
- 增强生物芯片在基因表达研究中的功能。
- 为各种生物技术应用提供一个多功能平台。
使用的方法
- 用于DNA固定的Bephore光刻术技术。
- 多步骤光刻能力用于复杂结构。
- 与功能基因刷结合用于蛋白质表达。
- 使用商业可获得的组件以便于使用。
主要结果
- 成功在表面上固定基因长度DNA。
- 证明了该方法的可重复性和有效性。
- 潜在的体外基因电路延长操作能力。
- 与各种生物技术方法的兼容性。
结论
- Bephore光刻术为DNA固定提供了一种有前景的方法。
- 这种技术可以显著推进无细胞基因表达研究。
- 它为合成生物学应用开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Functional surface-immobilization of genes enables sustained cell-free expression systems, supporting the development of dynamic gene regulatory networks and synthetic biology constructs. This approach provides a reproducible platform for mechanistic de-risking of genetic circuit behavior prior to cellular implementation. Compatibility with microfluidics and TIRF microscopy allows real-time monitoring of molecular interactions, enhancing predictive confidence in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through compartmentalized gene expression in defined microenvironments.
- Operational Value: Supports biological de-risking by isolating genetic variables and clarifying pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by allowing sustained expression of gene-length constructs for functional screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via stable DNA brush immobilization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through lithographically defined surface patterns.
- Scalability: Enables platform reuse and integration with microfluidic systems for continuous reagent supply and waste removal.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene circuit validation to preclinical modeling through sustained expression dynamics.
- Mechanistic De-risking: Supports predictive confidence by enabling observation of fluorescence recovery and decay kinetics under controlled conditions.
- Disease-Relevant System: Applicable to constructing interacting DNA brushes that mimic self-regulating gene networks for target pathway analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification through immobilized gene expression systems, supporting lead identification via sustained protein output.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing controlled, compartmentalized expression of gene-length DNA to test regulatory interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through stable, fluorescently labeled DNA immobilization compatible with TIRF-based readouts.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence recovery measurements that enable comparison of expression system performance over time.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling dynamic gene regulatory feedback relevant to pathway modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable lithographic platform for constructing diverse genetic circuits across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genetic circuit behavior, reduction of mechanistic ambiguity in synthetic biology design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via commercially available components and simple lithographic steps.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through sustained expression data, capital efficiency via reduced reliance on cellular systems.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of genetic constructs based on expression stability and feedback dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA handling, lithography, and fluorescence microscopy.
- Needs access to UV illumination systems, microfluidic chip fabrication tools, and temperature-controlled imaging platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent surface preparation and compartment alignment.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different substrate materials or compartment geometries.
- Practical limitation: Gene expression duration is constrained by reagent depletion, requiring microfluidic supply for extended operation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Chip Fabrication
2:43
Substrate Preparation for Photolithography
4:11
Projection Lithography
5:40
Holder Assembly for Compartmentalized Gene Expression
7:17
Setup for Gene Expression Analysis
9:23
Results: Bephore Lithography and Compartmentalized Gene Expression
10:29
Conclusion
