Name: 喷墨打印机辅助自动跳棋阵列和手动消时法的抗菌协同试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 了解喷墨打印机辅助自动跳棋阵列法与手动消时法在抗菌协同试验中的应用。该方法可快速筛选多粘菌素与米诺环素等抗生素组合，为应对耐药菌感染提供高效解决方案。

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Thea Brennan-Krohn 获得了尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所儿科传染病研究培训基金（T32HD055148）、国立过敏与传染病研究所培训基金（T32AI007061）、波士顿儿童医院教师发展办公室教师职业发展奖学金，以及国立过敏与传染病研究所职业发展奖（1K08AI132716）的支持。J.E.K. 获得了美国国立卫生研究院国立过敏与传染病研究所资助号 R33 AI119114 的资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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D300 数字分配仪及相关耗材由位于美国莫里斯维尔的Tecan公司提供。Tecan公司在本研究的设计、数据收集与解释、稿件撰写或发表决定方面均未参与。

本文所述的两种方法均可提供有关联合使用抗菌药物时其活性相对于各自单独使用时活性的信息。自动化喷墨打印机辅助数字分配法是对《临床微生物学操作手册》中所述方法的一种改进33，而时间-杀菌法则更严格遵循同一参考文献中的相应方案34。
在棋盘格阵列法中，确定每孔所需添加的抗菌剂储备液体积以及这些体积的分配均由自动化完成，从而消除了手动操作棋盘格阵列时可能遇到的一些主要误差来源。然而，研究者仍必须确保原始储备液的配制浓度符合预期，并且目标终浓度已正确输入D300软件中。将抗菌剂悬液加入384孔板的孔中起初可能具有挑战性，需格外小心，以确保移液器吸头准确进入相应孔位，并防止液体溅至孔壁边缘。可使用自动化液体处理仪替代手持多通道移液器，以提高细菌悬液加入孔板的速度和准确性。如实验方案所述，D300系统需要添加表面活性剂聚山梨酯20（P-20），以实现正常的液体处理。已有文献指出，在标准肉汤微量稀释法中，使用浓度为0.002%的另一种表面活性剂聚山梨酯80可降低对多粘菌素MIC &#60;2 µg/mL的微生物的多粘菌素MIC值。35,36 我们实验室先前已证实，与参考BMD方法相比，浓度高达0.0015%的P-20对D300辅助测定的MIC结果无影响14。在本实验示例中，P-20的最高浓度为0.0014%。
我们在进行某些棋盘式阵列实验时遇到的一个问题是大量孔位被跳过。这种情况在某些抗生素中出现的比例明显偏高。具体而言，在针对一组碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）的药物联用筛选中，我们发现521次试验中有49次（9.4%）因多个孔位被跳过而无法使用，其中12种测试抗生素中的2种（磷霉素和头孢吡肟）占到了46次（94%）。此类较高发生率可能更常见于对接种量效应特别敏感的药物31,32,37。值得注意的是，美国临床与实验室标准协会（CLSI）不推荐使用肉汤稀释法检测磷霉素的敏感性25，原因是该方法所得结果的可靠性存疑，这可能解释了本研究中该药物结果不稳定的现象。根据研究者的偏好，可对自动化棋盘法进行一些修改。例如，若实验室工作流程需要，可将抗菌药物直接加入已含有细菌悬液的孔板中，而非加入空孔中。尽管本研究使用了384孔板，但该方法也可在96孔板中进行，只需相应调整孔内液体体积。采用96孔板格式可能有助于减少对接种量微小变化特别敏感的抗生素出现跳孔现象。在计算FICI时，可能会遇到最小抑菌浓度（MIC）超出检测范围（即高于所测试浓度）的情况，包括被测药物对目标微生物单独作用时无活性的情形。在此类情况下，可假设MIC为比最高测试浓度高一个稀释度的值来计算FIC。这是一种最保守的策略，因为它假设在协同作用测试中观察到抑制效应的任何稀释度下，FIC均取可能的最大值。例如，若实际MIC比最高测试浓度高出两个倍比稀释度，则相应的FIC值将比保守估计值低两倍，依此类推。
为了在时间-杀菌实验中准确评估药物的杀菌活性，必须确保细菌处于对数生长期，尤其是在测试细胞壁活性抗生素时尤为关键28。对于本示例中使用的快速生长细菌（K. pneumoniae），在振荡条件下培养3小时即可达到该生长阶段，但不同微生物可能需要不同的培养时间。通常情况下，菌液应呈现明显但不过度的浑浊。可通过在连续时间点（例如每30分钟一次，持续4–6小时）取样进行菌落计数，绘制生长曲线，以确定合适的培养时间38。时间-杀菌实验中初始接种量的设定也至关重要。目标初始接种浓度约为5 × 105 至1 × 106 CFU/mL。本文所述的稀释方法（将100 μL 1.0麦氏浊度标准的菌悬液加入10 mL培养基中）适用于肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）及其他我们已测试过的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）菌种。若在使用其他微生物的实验中，初始接种菌液密度显著高于或低于此范围，则可能需要调整稀释比例。（可通过测定0.5或1.0麦氏浊度菌悬液的平板菌落计数，确定该浊度对应的活菌数量，再计算初始菌悬液需稀释的倍数，以获得目标终浓度。）在分析协同作用实验的平板计数结果时，若发现含抗生素试管的初始接种量显著低于生长对照组的初始接种量，可能提示存在抗生素残留效应，或在将细菌加入含抗生素试管至取样涂板的短暂时间内发生了极快速的细菌杀灭。若在系列稀释中，未稀释样本点的菌落数量低于后续稀释度的菌落数量，则提示可能存在抗生素残留效应。已有多种方法被提出用于避免该效应，包括将单次取样液均匀涂布于整块平板38，或在涂板前将样本离心、弃去上清液，并用无菌生理盐水重悬39。在时间-杀菌实验的每个时间点，研究者均需高效且准确地从每支培养管中取出等份样本，并进行系列稀释。操作过程中的延迟，尤其是在连续且早期的时间点，可能导致培养物在非培养、非振荡条件下停留过久；而粗略的加样或稀释操作则可能导致平板计数结果不准确。与涂布平板法（将每种稀释液100 μL均匀涂布于整块琼脂平板）相比，本研究所描述的滴液平板法速度更快，所需琼脂平板数量显著减少，且计数更迅速，因为每个液滴的最大可计数菌落数为30，而涂布平板通常可计数多达300个菌落。然而，若研究者更熟悉涂布平板法，也可选择该方法。若使用多通道移液器加样后液滴发生相互融合，可改用单通道移液器分别点加间距更大的液滴。根据我们的经验，在加样前将平板冷却至4 °C，似乎可减少液滴过度扩散现象。
本文所述技术的一个局限性在于，两种协同作用检测方法（棋盘格阵列法和时间-杀菌法）的结果并不总是一致。由于大多数已发表的协同作用研究仅使用其中一种方法，而非同时结合两种方法，因此可能难以整合这两类检测的数据。由于我们开发的自动化棋盘格阵列法操作简便且通量高，我们实际上将其作为一种筛选手段，用于在更多分离株中测试药物组合，并确定哪些浓度组合具有协同作用。随后，我们针对在棋盘格阵列中表现有效的组合和浓度，开展了少量的时间-杀菌实验。值得注意的是，由于棋盘格检测通常在微量肉汤稀释体系中进行，而时间-杀菌检测使用较大的反应体积（类似于宏量肉汤稀释），我们发现两种方法所得的FIC值有时存在差异，通常在时间-杀菌实验中需要更高的浓度才能观察到活性。此前已有报道指出，当比较革兰阴性杆菌的宏量与微量肉汤稀释MIC检测结果时26，以及当时间-杀菌实验中使用的较大接种量与微量肉汤稀释和棋盘格阵列检测中标准接种量进行比较时32，也会出现类似现象。棋盘格阵列检测的一个具体局限性在于微量肉汤稀释MIC测试本身固有的变异性22。尽管协同作用的FICI 判断阈值已在数学上对这种变异性进行了校正6，但这种变异性仍不可避免地引发人们对棋盘格阵列结果可靠性和一致性的担忧。
由于所有体外协同作用检测方法本身存在局限性（包括在人工培养基中培养细菌、抗生素浓度恒定以及作用时间有限），通过这些方法获得的结果必须通过补充技术进行验证和进一步评估。此类方法包括体外药代动力学/药效学（PK/PD）研究（例如中空纤维感染模型40）、动物模型，以及最终的人体PK/PD和疗效研究。本文所述的自动化棋盘格阵列方法提供了一种快速筛选潜在协同作用组合的手段，从而更有针对性地利用上述技术。进一步实现这些方法的自动化，以及更系统地研究体外参数与临床结果之间的关系，对于扩大协同作用检测的应用规模并提高其临床适用性具有重要意义。

多重耐药（MDR）细菌病原体的传播，特别是碳青霉烯类耐药肠杆菌科（CRE）等多重耐药革兰阴性菌，使临床医生在成功实施抗感染治疗方面面临越来越有限的选择1，而新型抗菌药物研发进展缓慢进一步加剧了这一问题2,3。抗菌协同作用是指两种药物联用时产生的效应大于各自单独作用之和，这种机制为挽救现有抗生素用于治疗多重耐药菌感染提供了可能，即使这些细菌对其中一种或两种抗生素单独使用时具有耐药性。本文所述技术提供了两种互补的体外协同作用检测方法：联合使用时，可使研究人员高效地筛选感兴趣的抗菌药物组合是否具有协同活性（自动化棋盘格阵列法），并进一步评估在筛选阶段发现的有前景组合所表现出的抑制和杀菌动力学特征（手工时间-杀菌法）。
体外协同作用检测最常用的方法之一是棋盘格阵列法，该方法是最低抑菌浓度（MIC）检测的一种改进形式，通过一系列浓度组合来检测两种不同抗生素对某种细菌分离株的抑制活性4,5。当两种药物联合使用时若其活性超过相加效应，则认为该组合具有协同作用6。然而，手动设置棋盘格阵列涉及一系列计算以及稀释和移液步骤，操作繁琐且容易引入人为误差。这些限制因素导致协同作用检测主要局限于对少量抗生素组合和细菌分离株进行回顾性评估，且不同研究之间的结果并不总是一致7,8,9,10,11。此外，协同作用检测的复杂性也导致其在临床微生物学实验室中难以开展，并使得临床联合治疗研究中几乎缺乏体外协同作用检测的数据12,13。
为了提高棋盘格阵列法的效率和通量，我们采用了一种本实验室先前开发的自动化MIC检测技术，该技术利用喷墨打印技术将抗生素储备液精确且一致地分配至微孔板的孔中14。该平台消除了复杂计算和多次移液步骤的需要。只要用户输入所需抗生素的浓度范围及其储备液浓度，配套软件即可自动计算并分配相应的抗生素体积，从而生成二维棋盘格阵列。我们最初在一组碳青霉烯类耐药肠杆菌（CRE）分离株上测试了该方法15，随后重点研究了含多粘菌素（colistin）的药物组合对多粘菌素耐药分离株的抗菌活性16。多粘菌素通常作为最后手段的药物，主要用于治疗多重耐药（MDR）革兰阴性病原菌感染17,18，而多粘菌素耐药会使原本已为多重耐药的细菌几乎成为泛耐药菌19，因此这类细菌成为开发新型治疗策略的理想对象，即通过联合使用细菌对其单独不敏感的药物来实现协同作用。我们发现，多粘菌素与蛋白合成抑制剂类抗生素米诺环素（minocycline）联用时表现出极高的协同作用率，即使对这两种药物各自耐药的菌株亦是如此，这可能是由于多粘菌素对即使耐多粘菌素的细菌仍具有亚抑制浓度下的通透化效应。本文选择该组合作为示例进行阐述。值得注意的是，协同作用测试也可用于评估两种单独使用时均有效的药物联用后是否具有增强的疗效。
自动化棋盘格阵列法可实现快速、高通量的协同作用检测。然而，棋盘格阵列法也存在局限性。作为一种改良的最小抑菌浓度（MIC）检测方法，该法仅能提供关于细菌生长抑制的数据，而无法反映杀菌效果，且不能提供抗生素随时间变化的作用信息。相比之下，手工操作的时间-杀菌协同试验虽然更为耗时费力，但可在24小时的时间过程中提供关于抑制和杀菌的双重信息20,21。我们对少量分离株进行了时间-杀菌分析，以验证棋盘格阵列法的结果，并确定所发现的协同组合是否同样具有杀菌作用。
棋盘式阵列法和时间-杀菌协同作用方法均可提供有关药物组合活性的重要信息，尤其适用于评估针对高度耐药细菌病原体的潜在新型治疗方案。这些方法也存在固有的局限性。标准的微量肉汤稀释法最小抑菌浓度（MIC）检测已知存在一个两倍稀释度的预期误差范围22，当两种药物在棋盘式阵列中联合检测时，该误差范围会进一步增大。协同作用的标准定义仅将药物联合使用时在各自MIC的四分之一浓度下仍具有活性的情况视为协同作用6，这一定义已考虑了预期的变异性；但这种变异性（被认为源于生物和实验技术波动的共同作用23）不可避免地导致对协同作用结果可靠性的不确定性。目前协同作用检测尚缺乏建立完善的质量控制标准，这也是当前的一大局限。或许所有协同作用检测方法中最显著的局限在于，体外检测结果与临床治疗效果之间尚缺乏明确的相关性，即当药物组合用于患者治疗时，其体外结果与实际临床结局之间的关联尚未确立24。更简单且更快速的协同作用检测方法，例如本文所述的自动化棋盘式阵列法，可能有助于将体外协同作用检测整合到临床试验或其他患者结局评估中，从而在未来更好地阐明体外与体内效应之间的关系。
我们在此介绍的自动化棋盘阵列法为多种组合的高通量筛选提供了可行方案，并可快速评估非常规、 &#34;高风险-高回报&#34; 无需投入大量时间和资源即可实现组合。随后我们将演示的时间-杀灭法可为组合的协同活性提供额外支持性信息，并有助于表征其杀菌活性及抗菌动力学特征。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 菌株 ATCC 25922</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td>质控菌株</td></tr><tr><td>0.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>1 L 0.22 &amp;micro;m 瓶顶过滤器</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>597-4520</td><td></td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 硼硅酸盐玻璃圆底培养管</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Phenix</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>15 × 100 mm 或 15 × 150 mm 水解酪蛋白琼脂平板</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01620 或 R04050</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 不锈钢密封盖（用于 25 × 150 mm 玻璃培养管）</td><td>Bellco</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>25 × 150 mm 硼硅酸盐玻璃圆底培养管</td><td>Bellco</td><td>2011-25150</td><td></td></tr><tr><td>348 孔无菌透明平底未处理微孔板（带盖）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781186</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Phenix</td><td>SS-PH50</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌试剂储液槽</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>96 深孔聚丙烯微孔板（每孔 2 mL）</td><td>Fisherbrand</td><td>12-566-612</td><td></td></tr><tr><td>96 孔无菌透明圆底未处理微孔板（带盖）</td><td>Evergreen</td><td>222-8032-01R</td><td></td></tr><tr><td>阳离子调节水解酪蛋白肉汤</td><td>BD Diagnostics</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>硫酸多粘菌素</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60915</td><td></td></tr><tr><td>D300e 控制软件</td><td>HP/Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DensiCHEK Plus McFarland 比浊仪</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>21250</td><td></td></tr><tr><td>Excel 电子表格软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超长 SHARP 10 &amp;micro;L 精密屏障吸头</td><td>Denville Scientific</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>HP D300 数字分配仪</td><td>HP/Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HP D300 T8+ 加样卡盒</td><td>HP/Tecan</td><td>30097370</td><td></td></tr><tr><td>盐酸米诺环素</td><td>Chem-Impex</td><td>14302</td><td></td></tr><tr><td>Picus 12 通道 10–300 &amp;micro;L 移液器</td><td>Sartorius</td><td>735461</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP-337</td><td>商品名：Tween 20</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Xplorer 12 通道 50–1200 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>2231000328</td><td></td></tr></tbody></table>

通过喷墨打印机辅助的自动化棋盘阵列法与手工时间-杀菌法进行抗菌协同作用测试

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

随着多重耐药（MDR）病原体的发病率持续上升，且超过了新型抗菌药物的研发速度，针对多重耐药细菌的治疗亟需新的策略。其中一种策略是联合用药，即联合使用两种或多种抗生素来治疗单药可能无效或对其中一种或两种药物均无效的感染。当两种药物联用产生的效应大于各自效应之和时，即被视为具有协同作用。体外协同活性的研究是评估药物组合潜在疗效的重要第一步。目前已有两种主要的体外协同作用检测方法：棋盘格法和时间-杀菌试验。本文介绍了一种利用喷墨打印技术实现自动化的棋盘格法，可提高该技术的效率与准确性，同时介绍了一种标准的手动时间-杀菌协同试验方法。自动化棋盘格法可用于高通量筛选，而手动时间-杀菌试验则可提供关于协同活性及杀菌效果的额外补充数据。
棋盘法阵列是标准最低抑菌浓度（MIC）检测的一种改进方法，该方法将细菌与不同浓度组合的抗生素共同孵育，并在过夜孵育后评估其生长抑制情况。手动进行棋盘法阵列实验需要一系列繁琐且易出错的计算和稀释步骤。本文介绍的自动化方法利用喷墨打印技术，实现了所需抗生素储备液体积的自动计算与分配。在时间-杀菌协同试验中，将细菌与目标抗生素单独或联合孵育，并在24小时过程中定时取样进行定量培养。该实验结果可判断抗生素组合是否具有协同作用，是否具有杀菌效应，并提供随时间变化的细菌抑制和杀灭数据。

图1A 展示了一项棋盘法协同作用实验的网格图，其中米诺环素（浓度范围为 0–32 μg/mL）与多粘菌素E（浓度范围为 0–16 μg/mL）联用，对大肠杆菌（E. coli）菌株 FDA-CDC 0494 进行测试。数值表示在 600 nm 光密度（OD600）下的分光光度读数。OD600 值低于 0.07 的孔（肉眼观察无细菌生长）以红色阴影表示，而 OD600 值 ≥ 0.07 的孔（肉眼观察有细菌生长）以绿色阴影表示。对于每种药物，最低抑菌浓度（MIC；加粗表示）是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。米诺环素的 MIC 为 32 μg/mL，多粘菌素E 的 MIC 为 8 μg/mL。图1B 保留了相同的着色方式，但将抑制生长的孔中的数值替换为部分抑菌浓度指数（FICI）值。其计算方法如下：在每个孔中，每种药物的部分抑菌浓度（FIC）通过该孔中抗生素浓度除以其 MIC 得到，FICI 则通过将两种药物的 FIC 相加获得。FICI 值为 0.5 的孔（通常作为协同作用的阈值）以虚线边框标出，FICI 值最低的孔（0.094）以加粗表示。由于最低 FICI 值处于协同作用范围内，因此该药物组合被认为具有协同作用。
图2A 和 图2B 显示与下图类似的网格 图1A 和 图1B，但在本例中，该组合对所测试的分离株未表现出协同作用（K. pneumoniae 分离 BIDMC 4），因为其最低 FICI 生长受到抑制的程度为1，即 &gt;0.5.
图3展示了棋盘式协同试验中出现多个跳过孔的光密度读数结果（Enterobacter cloacae 复合群分离株 BIDMC 27）。跳过孔是指尽管相邻孔中抗生素浓度更高但仍出现细菌生长抑制的孔。这一现象在标准 MIC 测试中亦有报道，可能归因于不同孔之间细菌生长特性的生物学差异，以及某些抗生素对细菌接种量微小变化的敏感性23,31,32。若在棋盘式阵列中出现一个以上的跳过孔，则舍弃该次实验结果并重新进行检测。
图4 展示三种组合对测试菌株的时间-杀灭协同作用结果示例 K. pneumoniae 分离BIDMC 32。菌落计数以对数刻度表示于 y-轴和时间（小时） x-轴。红色条形和数字表示含药物组合的试管中初始接种量与24小时时细菌浓度之间的差异，而蓝色条形和数字表示含药物组合的试管与仅含最有效单一药物的试管在24小时时细菌浓度之间的差异。 图 4A 显示多粘菌素与米诺环素联用的结果；该联用方案具有协同作用（联用组与单药最高效药物处理组间细菌浓度差值 ≥2 log）10 24 小时时的菌落形成单位/mL）以及杀菌效果（从初始接种量到 24 小时浓度下降 ≥3 log）10 CFU/mL 图 4B 显示了多粘菌素与克林霉素联用的结果，该组合具有协同作用但无杀菌效果。该组合抑制了细菌的生长——单独使用任一药物均无此效果——但并未杀死细菌。 图 4C 显示了多粘菌素与红霉素联用的结果，该组合既无杀菌作用也无协同效应。
<img alt="抗生素协同作用棋盘法检测示意图；米诺环素、多粘菌素浓度的生长分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：棋盘法阵列结果展示协同作用（米诺环素 + 多粘菌素联合检测对抗） E. coli 菌株 FDA-CDC 0494 (A) 棋盘式阵列的分光光度读数与生长结果解读。表格中各单元格内的数值为 600 nm 处的光密度读数（OD600). OD值的细胞600 0.07 以下的数值（目视观察无生长）以红色标示，而 OD600 数值0.07（对应于通过肉眼观察的生长情况）以绿色标示。B)部分抑菌浓度指数（FICI）计算。表示生长或无生长的阴影部分已保留。沿纵轴和横轴的多粘菌素和米诺环素数值 x- 和 y-轴分别表示部分抑菌浓度（FIC），即该列或该行中药物浓度与其单独使用的最小抑菌浓度（MIC）的比值。每个单元格中的数值即为FICI，或该孔中两种药物的FIC之和。虚线大框内包含具有FIC的孔I 0.5。粗边框的孔表示FIC值最低的孔I 生长受抑制，或最低FICI由于最低FICI 为0.5时，该组合被视为具有协同作用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="米诺环素-多黏菌素协同作用热图，药物浓度对细菌生长的影响，示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：无协同作用的组合棋盘法结果（米诺环素 + 多粘菌素测试针对 K. pneumoniae 分离 BIDMC 4 (A600 nm 处的光密度值及棋盘格阵列结果的生长解释，如所述 图1A. (B) 部分抑菌浓度指数（FICI）计算，方法如前所述 图1A由于最低FICI 是 &gt;0.5时，该组合不被视为具有协同作用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="抗生素疗效热图；米诺环素与多粘菌素浓度对比；细菌生长结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：由于跳过孔位导致无法解读的棋盘式阵列结果（米诺环素 + 黏菌素对中国台湾分离株进行测试） 阴沟肠杆菌 复合分离株 BIDMC 27 600 nm 处的光密度值及棋盘式阵列结果的生长情况解读，方法如所述 图1A出现多个跳孔现象，即尽管相邻孔中抗生素浓度更高但仍有细菌生长，而这些孔中细菌生长却受到抑制。结果无法解读，需重复实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长抑制曲线图，CFU/mL 与时间的关系，显示抗生素作用效果，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：三种组合对测试菌株的时间-杀灭协同作用结果 K. pneumoniae 分离 BIDMC 32 菌落数量以对数尺度表示在 y-轴和时间（小时） x-轴。组合组在24小时时的细菌浓度与试管中初始接种量之间的差异以红色条形和数字表示。若从初始接种量到24小时浓度的下降值≥3 log10 CFU/mL，该组合被视为具有杀菌作用。含有组合的试管与仅含最有效单一药物的试管在24 h时细菌浓度之间的差异以蓝色条形和数字表示；若差异≥2 log10 CFU/mL 降低，该组合被视为具有协同作用。A) 多粘菌素（CST）+ 米诺环素（MIN），一种具有协同作用且为杀菌性的组合。B）多粘菌素 + 克林霉素（CLI），一种具有协同作用但非杀菌性的组合。C）多粘菌素 + 红霉素（ERY），该组合既无协同作用也无杀菌效果。这些结果最初作为一项研究的一部分发表，该研究探讨含多粘菌素组合对多粘菌素耐药菌的协同活性 肠杆菌科，其中我们证明了多粘菌素与多种抗生素具有协同作用，这些抗生素单独使用时仅对革兰氏阳性菌有效（如克林霉素）或主要对革兰氏阳性菌有效（如红霉素）16。（需要注意的是，红霉素对该图所示菌株在棋盘格稀释法中显示协同作用，但在时间-杀菌试验中未显示协同作用，因此本文将其选为非协同组合的示例。）我们假设，多粘菌素E（colistin）已知通过破坏革兰阴性菌外膜通透性发挥作用，其在亚抑制浓度下可对耐多粘菌素E的革兰阴性菌产生通透化效应，从而允许克林霉素等通常无法进入革兰阴性菌细胞的药物进入。本图A部分经 Brennan-Krohn、Pironti 和 Kirby 2018 年研究修改而来16，版权 © 美国微生物学会，《抗菌剂与化疗》，62(10)，2018，pii: e00873-18，doi: 10.1128/AAC.00873-18。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

抗菌药物协同作用测试用于评估两种或多种抗生素联合使用的效果，通常采用以下两种方法之一进行：棋盘格稀释法或时间-杀菌试验。本文介绍了一种基于自动喷墨打印机辅助的棋盘格稀释法协同作用技术，以及一种经典的时间-杀菌协同作用研究方法。

随着多重耐药（MDR）病原体的发病率持续上升，且超过新型抗菌药物的研发速度，针对MDR……的治疗亟需新的方法

手动棋盘格阵列协同作用检测是一种劳动密集且易出错的方法。相比之下，我们基于自动喷墨打印机的棋盘格方法显著提高了检测速度、准确性和通量。自动化棋盘格方法使得大规模筛选药物的协同组合成为可能，而时间-杀菌法可用于验证并进一步探究这些组合的活性。新型抗生素的发现速度未能跟上耐药性传播的步伐，而对抗菌药物协同组合的研究为挽救现有药物以治疗耐药菌提供了可能。尽管本视频以抗菌药物为例进行演示，但该技术也可用于其他类型的抗菌药物，甚至适用于其他种类的药物或化合物联合测试。在本视频中，我们展示了自动化棋盘格阵列法和手动时间-杀灭法。我们建议首先进行棋盘格阵列研究以确定有前景的组合，然后通过时间-杀菌研究进一步探究这些组合。首先，制备多粘菌素和米诺环素的抗菌储备液，然后按照随附文本方案中所述对储备液进行质量控制。接下来，向12毫米×75毫米的圆底玻璃培养管中加入约1毫升0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。从细菌的过夜培养平板上挑选一至两个单菌落，放入培养管中。轻轻涡旋振荡培养管，使细菌悬浮于溶液中。使用麦氏比浊仪检测细菌的浓度。通过添加更多生理盐水或更多细菌，调整浓度以达到0.5麦氏浊度标准。然后，在50毫升锥形管中，将100微升菌液加入30毫升阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤中，使菌液稀释1:300，最终细胞密度为每毫升5×10⁵菌落形成单位。接下来，请参照随附的文字版实验方案，准备用于打印的抗菌剂。保存方案，然后单击左上角的“运行”按钮，接着单击“开始”按钮。将一块384孔板装入板架中，并在“加载板1 Synergy”提示下按“已加载”。随后，将一个T8+盒式夹放入盒式插槽中，并在“加载T8+盒式夹”提示下按“已加载”。当系统提示时，将抗生素储备液加入卡盒上指定的储液槽中。每加入一种溶液后，按下“已加满”按钮。当 D300 分配仪已将适当体积的抗生素储备液加入各孔，且出现“运行完成”对话框时，点击“关闭”，取出微孔板，并关闭 D300 仪器。接下来，将先前制备的细菌悬液倒入无菌试剂储液槽中。使用多通道移液器向棋盘格阵列中的所有孔中加入 50 µL 悬液。然后，向一个空孔中加入 50 µL 不含细菌的阳离子调节 Mueller-Hinton 肉汤。此孔将作为阴性对照，以确认培养基的无菌性。在35°C的常温空气培养箱中孵育16至20小时。分析检测时，请参照随附的文字版实验方案进行。进行时间-杀菌协同试验时，需再次按照文本方案中所述方法配制抗菌剂储备液。然后，在无菌生理盐水中制备待测菌株的0.5麦氏浊度悬浮液。取100 µL的0.5麦氏浊度菌悬液，加入含有5 mL CAMHB培养基的25 mm × 150 mm玻璃圆底试管（带不锈钢密封盖）中，并轻轻涡旋混匀。使用无菌接种环，将一滴稀释后的悬液在血琼脂平板上进行划线分离，并将平板置于35摄氏度的空气中培养，以确认接种物的纯度。盖好试管盖，将试管放置于试管架中，在35摄氏度的空气中振荡培养至少3小时，直至达到对数生长期。在初始培养物培养期间，向五个已灭菌的玻璃培养管中各加入10毫升阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤。进行时间-杀菌协同作用研究时，至少应有一种药物的浓度在其单独使用时对生长曲线无影响。该浓度可通过在协同作用研究前评估各药物单独浓度的影响来确定。向第一支试管中加入10微升浓度为1毫克/毫升的多粘菌素母液，使多粘菌素的终浓度为1微克/毫升，因为该浓度对本示例中所用菌株无效。对于第二个试管，加入10 µL浓度为1 mg/mL的米诺环素储备液，以获得终浓度为1 µg/mL的溶液。该浓度在此示例所用菌株中同样无效。向第三个试管中加入10 µL浓度为1 mg/mL的米诺环素储备液和10 µL浓度为1 mg/mL的多粘菌素储备液。该剂量与第一管和第二管中使用的多粘菌素和米诺环素相同。在第四管和第五管中不添加任何抗生素，分别作为生长对照管和阴性对照管。接下来，使用多通道移液器将900微升无菌生理盐水加入第1至第4列的B至H行，为连续稀释准备带有2毫升孔的96孔深孔聚丙烯板。当培养物处于对数生长期时，从摇床中取出培养管，轻轻涡旋混匀。将1毫升悬浮液转移至12 mm × 75 mm玻璃培养管中，并使用McFarland比浊仪检测其密度。如果密度小于1.0麦氏单位，将试管放回摇床继续孵育更长时间。如果密度大于1.0麦氏单位，则向试管中加入阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤，轻轻涡旋混匀，并重新取样，直至菌液浓度达到1.0麦氏单位。在制备初始接种物时，务必确保培养物处于对数生长期。可以通过构建生长曲线来确定生物体何时进入此阶段。然后，向1至4号试管中各加入100微升的1.0麦氏浊度标准菌悬液，并轻轻涡旋混匀。在混匀后立即以及1小时、2小时、4小时、6小时和24小时时，将试管倾斜，仅使无菌吸头尖端进入试管，避免移液器杆部等非无菌部分接触试管，从中各取出150微升等分试样。分别将等分试样加入先前准备好的96深孔板第一行的连续孔中。每次在各时间点取样后，立即将试管放回35摄氏度恒温空气培养箱中摇床上的试管架内。使用多通道移液器从板的A行移除100 µL，加入含有900 µL生理盐水的B行，制成1:10稀释液。用移液器将溶液上下吹打混合4到5次，然后丢弃吸头。首先，用将要涂布的抗生素条件和稀释度标记Mueller-Hinton琼脂平板。接着，使用多通道移液器配合超长吸头，采用滴板法将稀释后的样品涂布于平板上进行菌落计数。从第一列的每个孔中移除10微升，并小心地按行加样至相应标记的培养板上。重复此操作，直至所有行的样品均加样至培养板。此外，在24小时时间点，取10微升直接来自阴性对照管的液体，滴加到培养板上为此预留的位置，以检测无菌性。然后，将所有平板倒置，在常温空气中35摄氏度下过夜培养。接着，计数每个区域的菌落数量，并计算细胞密度。使用细头永久性记号笔在平板背面标记已计数的菌落，以避免重复计数或遗漏菌落。对于每个稀释系列，识别含有3至30个菌落的液滴。计数这些液滴中的菌落，并记录菌落数量及对应的稀释倍数。图中显示的是棋盘格阵列协同实验的一个网格，其中米诺环素以0至32 µg/mL的浓度与多粘菌素E以0至16 µg/mL的浓度组合，用于测试对抗大肠杆菌（E.coli）菌株的效果。OD600 值低于 07 的孔表示无生长，以红色标示；而 OD600 值大于或等于 07 的孔表示有生长，以绿色标示。对于每种药物，最低抑菌浓度是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。对于米诺环素，该浓度为 32 微克/毫升，而对于多粘菌素，则为 8 微克/毫升。此处保留了底色，但在生长被抑制的孔中，其数值被替换为部分抑菌浓度（FIC）指数值。每个孔中每种药物的 FIC 指数通过将该孔中抗生素的浓度除以该药物的最低抑菌浓度（MIC）来计算。FIC 指数小于或等于 0.5 的孔（该值被视为协同作用的临界值）以虚线边框标示，其中 FIC 指数最低的孔以粗体标出。由于最低FIC值处于协同作用范围内，因此该组合被视为具有协同作用。此处展示了一个不表现出协同作用的示例，因为抑制生长的最低FIC指数为1，大于0.5。最后，在此示例中出现了多个跳过孔，这表示尽管相邻孔中抗生素浓度更高并存在细菌生长，但这些孔中的细菌生长仍被抑制。如果棋盘式阵列中出现多个跳过的孔，则应舍弃结果并重复实验。此处展示了一个显示时间-杀灭协同作用实验结果的图表示例。有关时间-杀灭协同作用实验结果解读的详细信息，请参见配套的文字实验方案。通过药代动力学和药效动力学评估以及动物模型的体内研究，可进一步获得有关协同组合活性的信息。在处理细菌时，应始终遵循适当的安全操作规程，包括使用个人防护装备。若产生气溶胶或使用高风险病原体，所有操作均须在生物安全柜中进行。

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