通过喷墨打印机辅助的自动化棋盘阵列法与手工时间-杀菌法进行抗菌协同作用测试

手动棋盘格阵列协同作用检测是一种劳动密集且易出错的方法。相比之下，我们基于自动喷墨打印机的棋盘格方法显著提高了检测速度、准确性和通量。自动化棋盘格方法使得大规模筛选药物的协同组合成为可能，而时间-杀菌法可用于验证并进一步探究这些组合的活性。

新型抗生素的发现速度未能跟上耐药性传播的步伐，而对抗菌药物协同组合的研究为挽救现有药物以治疗耐药菌提供了可能。尽管本视频以抗菌药物为例进行演示，但该技术也可用于其他类型的抗菌药物，甚至适用于其他种类的药物或化合物联合测试。在本视频中，我们展示了自动化棋盘格阵列法和手动时间-杀灭法。

我们建议首先进行棋盘格阵列研究以确定有前景的组合，然后通过时间-杀菌研究进一步探究这些组合。首先，制备多粘菌素和米诺环素的抗菌储备液，然后按照随附文本方案中所述对储备液进行质量控制。接下来，向12毫米×75毫米的圆底玻璃培养管中加入约1毫升0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。

从细菌的过夜培养平板上挑选一至两个单菌落，放入培养管中。轻轻涡旋振荡培养管，使细菌悬浮于溶液中。使用麦氏比浊仪检测细菌的浓度。

通过添加更多生理盐水或更多细菌，调整浓度以达到0.5麦氏浊度标准。然后，在50毫升锥形管中，将100微升菌液加入30毫升阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤中，使菌液稀释1:300，最终细胞密度为每毫升5×10⁵菌落形成单位。接下来，请参照随附的文字版实验方案，准备用于打印的抗菌剂。

保存方案，然后单击左上角的“运行”按钮，接着单击“开始”按钮。将一块384孔板装入板架中，并在“加载板1 Synergy”提示下按“已加载”。随后，将一个T8+盒式夹放入盒式插槽中，并在“加载T8+盒式夹”提示下按“已加载”。

当系统提示时，将抗生素储备液加入卡盒上指定的储液槽中。每加入一种溶液后，按下“已加满”按钮。当 D300 分配仪已将适当体积的抗生素储备液加入各孔，且出现“运行完成”对话框时，点击“关闭”，取出微孔板，并关闭 D300 仪器。

接下来，将先前制备的细菌悬液倒入无菌试剂储液槽中。使用多通道移液器向棋盘格阵列中的所有孔中加入 50 µL 悬液。然后，向一个空孔中加入 50 µL 不含细菌的阳离子调节 Mueller-Hinton 肉汤。

此孔将作为阴性对照，以确认培养基的无菌性。在35°C的常温空气培养箱中孵育16至20小时。分析检测时，请参照随附的文字版实验方案进行。

进行时间-杀菌协同试验时，需再次按照文本方案中所述方法配制抗菌剂储备液。然后，在无菌生理盐水中制备待测菌株的0.5麦氏浊度悬浮液。取100 µL的0.5麦氏浊度菌悬液，加入含有5 mL CAMHB培养基的25 mm × 150 mm玻璃圆底试管（带不锈钢密封盖）中，并轻轻涡旋混匀。

使用无菌接种环，将一滴稀释后的悬液在血琼脂平板上进行划线分离，并将平板置于35摄氏度的空气中培养，以确认接种物的纯度。盖好试管盖，将试管放置于试管架中，在35摄氏度的空气中振荡培养至少3小时，直至达到对数生长期。在初始培养物培养期间，向五个已灭菌的玻璃培养管中各加入10毫升阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤。

进行时间-杀菌协同作用研究时，至少应有一种药物的浓度在其单独使用时对生长曲线无影响。该浓度可通过在协同作用研究前评估各药物单独浓度的影响来确定。向第一支试管中加入10微升浓度为1毫克/毫升的多粘菌素母液，使多粘菌素的终浓度为1微克/毫升，因为该浓度对本示例中所用菌株无效。

对于第二个试管，加入10 µL浓度为1 mg/mL的米诺环素储备液，以获得终浓度为1 µg/mL的溶液。该浓度在此示例所用菌株中同样无效。向第三个试管中加入10 µL浓度为1 mg/mL的米诺环素储备液和10 µL浓度为1 mg/mL的多粘菌素储备液。

该剂量与第一管和第二管中使用的多粘菌素和米诺环素相同。在第四管和第五管中不添加任何抗生素，分别作为生长对照管和阴性对照管。

接下来，使用多通道移液器将900微升无菌生理盐水加入第1至第4列的B至H行，为连续稀释准备带有2毫升孔的96孔深孔聚丙烯板。当培养物处于对数生长期时，从摇床中取出培养管，轻轻涡旋混匀。将1毫升悬浮液转移至12 mm × 75 mm玻璃培养管中，并使用McFarland比浊仪检测其密度。

如果密度小于1.0麦氏单位，将试管放回摇床继续孵育更长时间。如果密度大于1.0麦氏单位，则向试管中加入阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤，轻轻涡旋混匀，并重新取样，直至菌液浓度达到1.0麦氏单位。在制备初始接种物时，务必确保培养物处于对数生长期。

可以通过构建生长曲线来确定生物体何时进入此阶段。然后，向1至4号试管中各加入100微升的1.0麦氏浊度标准菌悬液，并轻轻涡旋混匀。在混匀后立即以及1小时、2小时、4小时、6小时和24小时时，将试管倾斜，仅使无菌吸头尖端进入试管，避免移液器杆部等非无菌部分接触试管，从中各取出150微升等分试样。

分别将等分试样加入先前准备好的96深孔板第一行的连续孔中。每次在各时间点取样后，立即将试管放回35摄氏度恒温空气培养箱中摇床上的试管架内。使用多通道移液器从板的A行移除100 µL，加入含有900 µL生理盐水的B行，制成1:10稀释液。

用移液器将溶液上下吹打混合4到5次，然后丢弃吸头。首先，用将要涂布的抗生素条件和稀释度标记Mueller-Hinton琼脂平板。接着，使用多通道移液器配合超长吸头，采用滴板法将稀释后的样品涂布于平板上进行菌落计数。

从第一列的每个孔中移除10微升，并小心地按行加样至相应标记的培养板上。重复此操作，直至所有行的样品均加样至培养板。此外，在24小时时间点，取10微升直接来自阴性对照管的液体，滴加到培养板上为此预留的位置，以检测无菌性。

然后，将所有平板倒置，在常温空气中35摄氏度下过夜培养。接着，计数每个区域的菌落数量，并计算细胞密度。使用细头永久性记号笔在平板背面标记已计数的菌落，以避免重复计数或遗漏菌落。

对于每个稀释系列，识别含有3至30个菌落的液滴。计数这些液滴中的菌落，并记录菌落数量及对应的稀释倍数。图中显示的是棋盘格阵列协同实验的一个网格，其中米诺环素以0至32 µg/mL的浓度与多粘菌素E以0至16 µg/mL的浓度组合，用于测试对抗大肠杆菌（E.coli）菌株的效果。

OD600 值低于 07 的孔表示无生长，以红色标示；而 OD600 值大于或等于 07 的孔表示有生长，以绿色标示。对于每种药物，最低抑菌浓度是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。对于米诺环素，该浓度为 32 微克/毫升，而对于多粘菌素，则为 8 微克/毫升。

此处保留了底色，但在生长被抑制的孔中，其数值被替换为部分抑菌浓度（FIC）指数值。每个孔中每种药物的 FIC 指数通过将该孔中抗生素的浓度除以该药物的最低抑菌浓度（MIC）来计算。FIC 指数小于或等于 0.5 的孔（该值被视为协同作用的临界值）以虚线边框标示，其中 FIC 指数最低的孔以粗体标出。

由于最低FIC值处于协同作用范围内，因此该组合被视为具有协同作用。此处展示了一个不表现出协同作用的示例，因为抑制生长的最低FIC指数为1，大于0.5。最后，在此示例中出现了多个跳过孔，这表示尽管相邻孔中抗生素浓度更高并存在细菌生长，但这些孔中的细菌生长仍被抑制。

如果棋盘式阵列中出现多个跳过的孔，则应舍弃结果并重复实验。此处展示了一个显示时间-杀灭协同作用实验结果的图表示例。有关时间-杀灭协同作用实验结果解读的详细信息，请参见配套的文字实验方案。

通过药代动力学和药效动力学评估以及动物模型的体内研究，可进一步获得有关协同组合活性的信息。在处理细菌时，应始终遵循适当的安全操作规程，包括使用个人防护装备。若产生气溶胶或使用高风险病原体，所有操作均须在生物安全柜中进行。