Name: 利用磁性纳米粒子丰富和扩大罕见抗原特异性 t 细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解利用磁性纳米粒子同时富集和扩增罕见抗原特异性T细胞的E加E技术。该方法通过纳米粒子人工抗原呈递细胞实现高效细胞扩增，为癌症免疫治疗中的新抗原研究及个性化细胞治疗提供可扩展的技术平台。

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J.W.H. 感谢约翰斯·霍普金斯大学纳米生物技术研究所的 NIH 癌症纳米技术培训中心、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1232825）以及 ARCS 基金会提供的奖学金支持。本工作得到了美国国立卫生研究院（P01-AI072677、R01-CA108835、R21-CA185819）、TEDCO/马里兰创新计划以及考尔特基金会（JPS）的资助。

所有小鼠的饲养均遵循约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准的指南。
1. 使用目标抗原肽序列负载二聚体主要组织相容性复合物免疫球蛋白融合蛋白（MHC-Ig）。
注意：如果使用 H-2Kb:Ig，则遵循步骤 1.1 中详述的方案；如果使用 H-2Db:Ig，则遵循步骤 1.2 中详述的方案。
<ol>
	<li>将肽序列主动加载至 H-2Kb:Ig。
	<ol>
		<li>准备所需缓冲液。通过将 150 mM NaCl 和 15 mM Na2CO3 溶解于去离子水中，配制变性缓冲液，并将 pH 调至 11.5。通过将 250 mM Tris HCl 溶解于去离子水中，配制复性缓冲液，并将 pH 调至 6.8。 
		注意：通常，每 1 mg H-2Kb:Ig 需要约 5 mL 的变性缓冲液和复性缓冲液。</li>
		<li>使 H-2Kb:Ig 变性以增强肽结合能力。用磷酸盐缓冲液（PBS）将 H-2Kb:Ig 的浓度调节至 0.5–2 mg/mL。然后用 5–10 倍体积的变性缓冲液将 H-2Kb:Ig 稀释至终浓度为 100–200 µg/mL，并在室温下孵育 15 分钟。</li>
		<li>向 H-2Kb:Ig 溶液中加入 50 倍摩尔过量的肽序列（通常肽储备液保存于 -80 °C，浓度为 1 mM）。 
		注意：通常肽抗原需溶于至少 10% 的二甲基亚砜（DMSO）中，然后缓慢加入 PBS 以保持其溶解性。根据氨基酸序列的不同，可能需要增加 DMSO 的比例。</li>
		<li>用肽复性 H-2Kb:Ig。在加入肽后立即加入复性缓冲液，使溶液 pH 达到 7.4。将中和后的溶液在 4 °C 下孵育 48 小时。</li>
		<li>浓缩并洗涤负载肽的 H-2Kb:Ig。使用截留分子量为 50 kDa 的离心浓缩器，按照制造商说明，用 PBS 对负载肽的 H-2Kb:Ig 溶液进行 3 次洗涤，浓缩至浓度至少为 1 mg/mL，并用分光光度计测定其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肽序列主动加载至 H-2Db:Ig。
	<ol>
		<li>准备所需缓冲液。通过将 131 mM 柠檬酸、150 mM NaCl 和 124 mM Na2HPO4 溶解于去离子水中，配制变性缓冲液，并将 pH 调至 6.5。通过将 120 mM Tris HCl 溶解于去离子水中，配制复性缓冲液，并将 pH 调至 8.8。 
		注意：通常，每 1 mg H-2Db:Ig 需要约 5 mL 变性缓冲液和 1 mL 复性缓冲液。</li>
		<li>使 H-2Db:Ig 变性以增强肽结合能力。用 PBS 将 H-2Db:Ig 的浓度调节至终浓度为 0.5–2 mg/mL。然后用 5–10 倍体积的变性缓冲液将 H-2Db:Ig 稀释至终浓度为 100–200 µg/mL。</li>
		<li>向 H-2Db:Ig 溶液中加入 50 倍摩尔过量的肽序列（通常肽储备液保存于 -80 °C，浓度为 1 mM），并在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>加入 β2 微球蛋白并用肽复性 H-2Db:Ig。加入 2 倍摩尔过量的 β2 微球蛋白。然后加入复性缓冲液，使溶液 pH 达到 7.4。将中和后的溶液在 4 °C 下孵育 24 小时。</li>
		<li>浓缩并洗涤负载肽的 H-2Db:Ig。使用截留分子量为 50 kDa 的离心浓缩器，按照制造商说明，用 PBS 对负载肽的 H-2Kb:Ig 溶液进行 3 次洗涤，浓缩至浓度至少为 1 mg/mL，并用分光光度计测定其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将MHC-肽复合物和共刺激分子偶联到磁性纳米颗粒表面，形成纳米颗粒人工抗原呈递细胞。根据颗粒大小和应用选择以下三种不同方法之一。
注意：可采用多种不同技术将蛋白质偶联至颗粒表面。本文描述了三种独立的方法：胺基包被颗粒（步骤 2.1）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）包被颗粒（步骤 2.2）以及抗生物素包被颗粒（步骤 2.3）。这些方法也已在两篇已发表论文的方法部分进行了详细描述6,7。所有操作均须在生物安全通风橱中使用无菌溶液进行，以维持储备 aAPC 颗粒的无菌状态。
<ol>
	<li>将抗原特异性信号和共刺激信号包被到氨基修饰的磁性颗粒上（图2）。以下步骤以100 nm、氨基修饰的超顺磁性纳米颗粒为例进行说明。 
	注意：&#160;有关将抗体连接至氨基修饰颗粒表面的详细方案，可参见 https://www.micromod.de/en/technotes-2.html。其中，技术说明201描述了如何对抗体进行巯基化修饰，并将其偶联至马来酰亚胺功能化的颗粒；技术说明202则描述了如何将氨基修饰的颗粒功能化为带有马来酰亚胺基团的颗粒。此处仅重点说明MHC-Ig和共刺激信号与这些颗粒连接时的微小调整。
	<ol>
		<li>使用Traut's试剂对抗体进行巯基化修饰（技术说明201）。
		<ol>
			<li>配制10倍浓度的磷酸盐缓冲液-乙二胺四乙酸（PBS-EDTA）缓冲液（0.1 M PBS和100 mM EDTA）。将10倍浓度的PBS-EDTA缓冲液按1:10比例加入抗体中，以防止添加至抗体上的游离巯基被氧化。</li>
			<li>向抗体中加入20倍摩尔过量的Traut's试剂（2-亚氨基硫醇），室温下混匀孵育2小时。在化学通风橱中称取Traut's试剂（干粉），避免吸入，因其可将氨基转化为巯基。</li>
			<li>使用截留分子量为50 kDa的离心浓缩器，用1×PBS-EDTA缓冲液彻底清洗3次，按照制造商说明操作，浓缩至终体积为500 µL。使用分光光度计测定抗体溶液的浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯（Sulfo-SMCC，技术说明202）将磁性纳米颗粒表面的氨基转化为马来酰亚胺基团。
		<ol>
			<li>将10倍浓度的PBS-EDTA缓冲液按1:10比例加入颗粒中。</li>
			<li>将Sulfo-SMCC溶于去离子水中，涡旋重悬至浓度为1 mg/mL。在化学通风橱中称取Sulfo-SMCC（干粉），避免吸入，因其可将氨基转化为马来酰亚胺基团。</li>
			<li>每平方毫米颗粒表面积加入0.016 nmol的Sulfo-SMCC溶液。对于1 mg的100 nm颗粒，使用0.3 mg的Sulfo-SMCC。室温反应1.5小时。</li>
			<li>使用磁铁柱结合磁场，用1×PBS-EDTA缓冲液清洗颗粒3次，并重悬于500 µL的1×PBS-EDTA缓冲液中。 
			注意：若使用小于200 nm的颗粒（如本文所述的100 nm颗粒），普通永磁体可能无法提供足够的磁力以实现洗涤或浓缩。因此，在洗涤较小颗粒时，应使用由铁磁性小球组成的磁铁柱以增强磁场。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将马来酰亚胺功能化的颗粒与巯基化抗体反应（技术说明201）。
		<ol>
			<li>将颗粒加入玻璃闪烁瓶中，加入微型磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上方约一英寸处，启动磁力搅拌使颗粒溶液充分混合。</li>
			<li>将巯基化抗体（每1 mg颗粒加入0.5 mg抗体）逐滴加入搅拌中的溶液中，室温下过夜反应。</li>
			<li>使用磁场用1×PBS缓冲液清洗3次，重悬于500 µL的1×PBS中。标记后于4 °C保存，最长可保存6个月。 
			注意：当马来酰亚胺功能化的颗粒与巯基化蛋白立即混合时，偶联效率最高。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将抗原特异性信号和共刺激信号包被到NHS修饰的磁性颗粒上（图3）。以下步骤以200 nm、NHS修饰的超顺磁性纳米颗粒为例进行说明。
	<ol>
		<li>配制重悬缓冲液、淬灭缓冲液和储存缓冲液。重悬缓冲液为pH 6.0的25 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）溶液，含0.01% Tween 20。淬灭缓冲液为pH 7.4的100 mM Tris-HCl溶液。储存缓冲液为pH 7.4的10 mM PBS溶液，含0.01% Tween。</li>
		<li>将冻干颗粒重悬于1 mL重悬缓冲液中。剧烈涡旋至少15分钟，直至无可见聚集体。</li>
		<li>将磁性颗粒置于磁力架上以去除上清液，用0.5 mL重悬缓冲液重悬后转移至玻璃闪烁瓶中。涡旋至无可见聚集体。</li>
		<li>每1 mg重悬的颗粒中加入0.1 mg总蛋白。涡旋混匀，室温下边混合边反应2.5小时。</li>
		<li>加入0.1 mL淬灭缓冲液，室温下边混合边反应30分钟。</li>
		<li>将闪烁瓶置于磁力架上洗涤颗粒。待上清液澄清后再移除。将颗粒从磁力架上取下，加入1 mL重悬缓冲液，涡旋至无可见聚集体。重复该过程三次，最后将颗粒重悬于1 mL重悬缓冲液中。4 °C保存，最长可保存6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将抗原特异性信号和共刺激信号包被到抗生物素修饰的磁性颗粒上（图4）。以下步骤以50–100 nm、抗生物素修饰的超顺磁性纳米颗粒为例进行说明。
	<ol>
		<li>对MHC-Ig或共刺激分子进行生物素化修饰。
		<ol>
			<li>将蛋白浓度调整为0.5–2 mg/mL的PBS缓冲液。将磺基-NHS-生物素溶于去离子水中，配制成10 mg/mL的溶液，并以20倍摩尔过量加入共刺激抗体中。室温孵育45分钟。</li>
			<li>使用截留分子量为50 kDa的离心浓缩器，用PBS彻底清洗3次，按照制造商说明操作，浓缩至终体积为500 µL。使用分光光度计测定抗体溶液的浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将生物素化的MHC-Ig和/或共刺激信号偶联至抗生物素纳米颗粒。对于500 µL的抗生物素颗粒储备液，加入0.5 nmol的共刺激抗体，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>洗涤偶联后的aAPC纳米颗粒。由于这些颗粒小于200 nm，需润湿磁铁柱并置于磁力架上。</li>
		<li>将颗粒/蛋白悬液加入柱中，确保所有蛋白/颗粒完全进入柱内。</li>
		<li>向柱中加入0.5 mL PBS，重复洗涤三次。</li>
		<li>洗脱时，将柱从磁力架上取下，向柱中加入0.5 mL PBS，用推杆将颗粒aAPC挤出至玻璃闪烁瓶中。4 °C保存，最长可保存6个月。 
		注意：颗粒在4 °C下稳定（不应冷冻），最长可保存6个月。较高温度会降低颗粒功能，并可能出现一定程度的颗粒聚集（数据未显示）。避免长时间置于室温，否则会显著缩短颗粒的有效保存期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用荧光抗体检测法表征人工抗原呈递细胞纳米颗粒上的蛋白质含量。
注意：这是对所制备的人工抗原呈递细胞进行质量控制的有效方法。此外，通过刺激信号的量可在不同批次及不同类型的人工抗原呈递细胞（例如，不同大小）之间制备等效剂量的aAPC。
<ol>
	<li>测定包被的 aAPC 的颗粒浓度。
	<ol>
		<li>从储备液中取未偶联的颗粒，用 PBS 溶液在 96 孔平底组织培养板中进行 1:2 倍比稀释，每孔 100 µL。</li>
		<li>使用酶标仪在 405 nm 处读取颗粒吸光度，根据已知颗粒浓度绘制标准曲线。</li>
		<li>取一份偶联后的 aAPC 样品，用 PBS 稀释至总体积为 100 µL，然后在酶标仪上读取吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取一部分制备好的 aAPC，用荧光抗体染色。
	<ol>
		<li>为计算需取出的样品量，需估算颗粒表面的抗体数量。 
		注：对于这些技术，假设颗粒表面积上的抗体密度约为 1000 个抗体/µm2。为了能够检测到荧光，每次荧光检测总共需要约 1011 个 MHC-Ig 或 CD28 分子。</li>
		<li>将 aAPC 总体积调至 100 µL（PBS 中），加入染色抗体（1:100 稀释），4 °C 孵育 1 小时。 
		注：成功使用的抗体示例包括：FITC 标记的抗大鼠 Ig λ1、λ2、λ3 轻链抗体（克隆 R26-46），用于检测 MHC-Ig；以及 FITC 标记的抗小鼠 Armenian/Syrian 仓鼠 IgG 抗体（克隆 G192-1），用于检测抗小鼠 CD28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤颗粒，并在荧光酶标仪上读取荧光信号。
	<ol>
		<li>使用磁珠洗涤法（如步骤 2 所述），用 0.5 mL PBS 对染色后的 aAPC 组分洗涤三次。</li>
		<li>用 0.5 mL PBS 洗脱洗涤后的 aAPC。</li>
		<li>取 100 µL 洗脱液加入 96 孔平底板中，通过吸光度测定浓度（方法同步骤 3.1）。</li>
		<li>将剩余的 400 µL 分成两份 200 µL 等分试样，加入黑色聚苯乙烯 96 孔平底板的两个孔中。以 1:2 比例沿板进行梯度稀释：取 100 µL 溶液与下一孔中已含 100 µL PBS 的溶液混合，至少连续稀释四次。 
		注：对多次重复测量取平均值，以降低测量噪声。</li>
		<li>在同一块黑色 96 孔板上，用用于染色的荧光抗体制作标准曲线：将抗体以 1:200 稀释加入含 200 µL PBS 的孔中，并以 1:2 比例至少向下稀释 12 个孔。</li>
		<li>当 aAPC 和荧光抗体均加入板中后，使用荧光酶标仪读取板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算每个颗粒上的蛋白含量。通过与已知抗体浓度的标准曲线比较，确定抗体浓度，假设染色抗体与被检测抗体为 1:1 结合比例。然后将该检测抗体浓度除以通过吸光度实验测定的颗粒浓度，即可得到每个颗粒上的抗体数量。</li>
</ol>
4. 使用制备的纳米颗粒人工抗原呈递细胞富集抗原特异性CD8+ T细胞。
<ol>
	<li>分离 CD8+ T 细胞。
	<ol>
		<li>通过暴露于异氟烷后行颈椎脱位法处死实验动物。</li>
		<li>从野生型 C57BL/6j 小鼠中取出脾脏和淋巴结，并置于 PBS 溶液中。研磨组织，并用 PBS 频繁冲洗，使细胞通过无菌的 70 µm 细胞筛网滤出。</li>
		<li>为去除非 CD8+ T 细胞，使用非接触式 CD8+ T 细胞分离试剂盒，并按照制造商说明书操作。 
		注意：每种抗原条件至少需要 3 × 106 个 CD8+ T 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入纳米颗粒人工抗原呈递细胞（aAPCs），使其与 CD8+ T 细胞结合。
	<ol>
		<li>分离完成后，将细胞浓缩至 100 µL PBS（含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA）中。</li>
		<li>根据每 106 个 CD8+ T 细胞加入 1011 个与 aAPC 结合的肽段负载型 MHC-Ig 的比例，计算所需添加的 aAPC 数量。</li>
		<li>将 aAPC 颗粒与 CD8+ T 细胞在无菌的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，于 4 °C 条件下持续混匀孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制添加补充成分的培养基和 T 细胞生长因子（TCGF），用于洗脱和培养 CD8+ T 细胞。
	<ol>
		<li>配制补充培养基：在完全 RPMI 1640 培养基（含谷氨酰胺）中添加 1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、0.4× 维生素溶液、92 µM 2-巯基乙醇、10 µM 环丙沙星以及 10% 胎牛血清（FBS）。</li>
		<li>制备 TCGF 时，请遵循此处已建立并引用的方案9。 
		注意：TCGF 是一种实验室自制的人源免疫细胞因子混合物，对提供 T 细胞生长所需的额外刺激信号至关重要。TCGF 可替换为已知的 T 细胞刺激性细胞因子，如 IL-2、IL-7 或 IL-15；但每种因子可能相应地诱导 T 细胞应答的极化。本文所述方案未针对这些细胞因子组合进行优化；因此，若不使用 TCGF，应参考其他技术文献以确定合适的浓度和组合方式10,11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤并富集 aAPC 与 CD8+ T 细胞的混合物。
	<ol>
		<li>按照步骤 2 所述方法洗涤磁性颗粒 aAPCs。但需依次使用含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS 缓冲液、补充培养基、以及含 1% TCGF 的补充培养基进行三次洗涤。</li>
		<li>用 500 µL 含 1% TCGF 的补充培养基洗脱 aAPCs 及富集后的 CD8+ T 细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞以每孔 160 µL 含 1% TCGF 的补充培养基接种至 96 孔 U 型底板中，细胞浓度为 2.5 × 105 个 CD8+ T 细胞/mL。</li>
		<li>若使用的 aAPCs 表面仅携带肽段负载型 MHC-Ig（无共刺激信号），则执行步骤 4.5；若使用的 aAPCs 表面同时携带肽段负载型 MHC-Ig 和共刺激信号，则直接进入步骤 5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向富集后的细胞中加入表面包被共刺激信号的磁性颗粒，并施加磁场，使刺激信号在 T 细胞表面发生共聚集。
	<ol>
		<li>向富集的细胞中加入与颗粒上肽段负载型 MHC-Ig 数量等摩尔（或根据应用需求更高，参见关于 aAPC 特性调控的部分）的刺激性抗体。</li>
		<li>在 4 °C 条件下孵育 1 小时，使共刺激磁性颗粒与富集的 CD8+ T 细胞结合。</li>
		<li>通过将培养板置于两个长度为 1.9 cm（0.75 英寸）的 N52 钕铁硼圆盘磁铁之间来施加磁场。 
		注意：N52 圆盘磁铁具有极强的磁场。储存时应使用隔片将磁铁分开，以免难以分离；放置于培养板时也需小心操作。为避免磁铁吸附培养箱中的金属部件，可将磁铁分别置于 50 mL 锥形管上下两端的泡沫塑料容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用制备好的纳米颗粒人工抗原提呈细胞扩增并检测抗原特异性CD8+ T细胞。
<ol>
	<li>将含有aAPCs和CD8+ T细胞的96孔U型底板置于含5% CO2、37 °C、加湿的培养箱中培养3天。第3天时，每孔加入80 µL含2% TCGF的完全培养基进行换液，并放回培养箱继续培养至第7天。</li>
	<li>第7天时，将刺激后的细胞收集至5 mL圆底离心管中进行细胞计数。</li>
	<li>待所有液体收集完毕后，离心收集的细胞，并重悬于含0.05%叠氮化钠和2% FBS的0.5 mL PBS中。使用台盼蓝染色，并通过血细胞计数板计数活细胞。</li>
	<li>取50,000–500,000个已计数的细胞，分别转移至两个新的5 mL圆底离心管中，用于抗原特异性染色。其中一管用于同源肽-MHC染色，另一管用于非同源染色以确定背景染色水平。</li>
	<li>在100 µL含0.05%叠氮化钠和2% FBS的PBS中，向相应的同源和非同源管中各加入1 µg生物素标记的MHC-Ig（采用步骤2中所述方法制备），并同时加入藻红蛋白-别藻青蛋白（APC）偶联的大鼠抗小鼠CD8a抗体（克隆号53-6.7，稀释比例为1:100），4 °C孵育1小时。</li>
	<li>加入二抗链霉亲和素及活死细胞染料。通过离心洗涤去除未结合的生物素化MHC-Ig。随后，所有样本在4 °C避光孵育15分钟，加入PE标记的链霉亲和素（1:350稀释）和可固定的绿色活死细胞染料（1:1000稀释）。</li>
	<li>使用流式细胞仪检测所有样本，以确定抗原特异性及抗原特异性细胞的数量。
	<ol>
		<li>通过离心去除未结合的二抗和活死染料，将细胞重悬于150 µL含0.05%叠氮化钠和2% FBS的PBS缓冲液中，用于流式细胞仪检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数据分析软件确定抗原特异性细胞的数量和百分比。
	<ol>
		<li>为确定抗原特异性细胞的百分比，依次设置以下门控：活细胞阳性（live+）、淋巴细胞（前向散射 vs. 侧向散射）、CD8+、Dimer+。Dimer+门的设定需通过比较非同源与同源染色样本确定。</li>
		<li>通过从同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比中减去非同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比，计算出样本中抗原特异性细胞的实际百分比。</li>
		<li>将该抗原特异性细胞百分比乘以实际计数的细胞总数，即可获得富集与扩增后产生的抗原特异性细胞数量。 
		注：由于本实验所用荧光染料存在光谱重叠，需在流式细胞仪上进行补偿调节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((immunotherapy%3A+Tisagenlecleucel-the+first+approved+Car-t-cell+therapy%3A+implications+for+payers+and+policy+makers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).</li>
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作者声明存在以下竞争性财务利益：根据NexImmune公司与约翰斯·霍普金斯大学之间的许可协议，Jonathan Schneck有权分享该大学因本文所述产品销售所获得的特许权使用费。他同时也是NexImmune公司的联合创始人，并持有该公司股权。他担任NexImmune公司董事会及科学顾问委员会成员。上述安排的条款已经过约翰斯·霍普金斯大学审查并批准，符合该校的利益冲突政策。

我们开发了一种基于纳米颗粒人工抗原呈递细胞（aAPC）的新型抗原特异性T细胞分离技术。纳米颗粒aAPC表面携带负载肽的MHC分子，可实现抗原特异性T细胞的结合与激活，同时提供共刺激信号。此外，aAPC具有顺磁性，因此可通过外加磁场富集稀有的抗原特异性T细胞。我们已对纳米颗粒的关键特性（包括粒径、配体密度和配体选择）进行了优化与研究，并分析了这些参数对T细胞结合、富集、活化及细胞富集效率的影响（补充文件1-方框1）。
因此，富集与扩增过程可实现抗原特异性CD8+ T细胞数千倍的扩增，获得高达60%的抗原特异性细胞比例，并可用于小鼠及人类体系（补充文件2-框2）。如此高数量和高比例的抗原特异性T细胞，使得针对疾病（例如，癌症、自身免疫性疾病等）的免疫应答特征得以表征，有助于发现新的免疫靶点和作用机制，并为过继性免疫治疗提供了可能。一个具体应用实例是：对患者的肿瘤进行测序，识别突变位点，从突变序列中定位潜在的MHC结合肽段，利用这些优选抗原制备人工抗原呈递细胞（aAPCs），再使用aAPCs来确定患者体...

随着多种免疫疗法的兴起，人们需要能够表征并调控免疫应答。特别是适应性免疫应答备受关注，因其具有细胞特异性和持久性。近年来，嵌合抗原受体T细胞疗法已获准用于癌症治疗；然而，这些抗原受体基于常见的细胞表面抗原CD19，而非癌症特异性抗原1。除了特异性之外，免疫疗法还可能受限于缺乏有效调控手段，以及对癌症或自身免疫疾病中动态免疫应答的理解有限。
研究抗原特异性反应的挑战之一在于其频率极低， 例如，抗原特异性T细胞为每10个中1个4 至 106 T细胞2,3因此，为了研究存在或正在应答的T细胞，需要对这些细胞进行富集与扩增，或对其信号进行放大。目前用于扩增抗原特异性T细胞的技术依赖饲养细胞，成本高昂且操作困难。而专注于放大抗原特异性T细胞信号的现有技术，如酶联免疫斑点（ELISPOT）检测，则限制了这些T细胞的重复使用。4最后，由于灵敏度较低，通常需要将这两种技术结合使用，以实现抗原特异性细胞的计数。
为了解决这些问题，我们开发了基于磁性纳米颗粒的人工抗原呈递细胞（aAPC）5,6,7,8可将抗原特异性信号肽负载的主要组织相容性复合体（pMHC）及共刺激分子功能化于人工抗原呈递细胞（aAPC）上例如，一种抗CD28抗体，用于富集抗原特异性T细胞，并随后刺激其扩增（图1因此，这些微粒可作为一种经济高效的即用型产品，既能根据抗原特异性刺激需求进行定制，又能在不同实验和患者间保持标准化。通过富集与扩增过程，抗原特异性CD8+ T细胞可扩增数百至数千倍，仅一周时间即可达到高达60%的频率，从而实现对大量细胞的表征或用于治疗。本文将介绍如何制备纳米颗粒人工抗原呈递细胞（aAPCs），选择纳米颗粒特性的若干关键设计考量，并展示利用这些颗粒分离和扩增稀有抗原特异性CD8+ T细胞的一些典型结果。

<table><tbody><tr><td>DimerX I：重组可溶性二聚体人 HLA-A2:Ig 融合蛋白</td><td>BD 生物科学</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I：重组可溶性二聚体小鼠 H-2D[b]:Ig</td><td>BD 生物科学</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I：重组可溶性二聚体小鼠 H-2K[b]:Ig 融合蛋白</td><td>BD 生物科学</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 超滤离心管，分子截留量 50 000</td><td>GE生命科学</td><td>28932362</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 分子截留量 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>纯化的人β2-微球蛋白</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-D-spio，NH2，100 nm 纳米颗粒</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS 活化磁珠，0.2 &amp;micro;m</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SN0200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>磺基-SMCC 交联剂&amp;nbsp;</td><td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td>2-亚氨基硫醇盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96孔半面积微孔板，黑色聚苯乙烯</td><td>康宁</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 Ig &amp;lambda;1, &amp;lambda;2, &amp;& &amp;lambda;3 轻链&amp;nbsp; 克隆 &amp;nbsp;R26-46&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记小鼠抗亚美尼亚和叙利亚仓鼠 IgG&amp;nbsp; 克隆 &amp;nbsp;G192-1</td><td>BD 生物科学</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J（转基因PMEL）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>005023</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J（B6野生型）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>小鼠CD8a+ T细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>MS色谱柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-藻红蛋白，SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>直径0.75英寸的N52圆盘磁铁&amp;nbsp;</td><td>K&amp;&J 磁学</td><td>DX8C-N52</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记的抗小鼠 CD8a 抗体，克隆株 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定绿色死细胞染色试剂盒（适用于488 nm激发）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性t细胞

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

我们开发了一种工具，可用于富集并扩增抗原特异性T细胞。该工具在以下情况中具有重要价值：A）检测抗原特异性T细胞的存在；B）探究抗原特异性免疫应答的动力学特征；C）理解抗原特异性应答如何影响疾病状态（如自身免疫病）；D）解析抗原特异性T细胞应答的异质性；或E）将抗原特异性T细胞用于治疗。该工具基于一种磁性颗粒，我们在其表面偶联了抗原特异性信号和T细胞共刺激信号，并将其称为人工抗原呈递细胞（aAPCs）。由于该技术制备简便，其他实验室可轻松采用；因此，本文旨在详细描述aAPCs的制备方法及其后续应用。我们将说明如何将抗原特异性信号和共刺激信号连接至aAPCs，如何利用aAPCs富集抗原特异性T细胞，以及如何扩增这些细胞。此外，我们还将基于在表征抗原特异性T细胞过程中积累的实验与生物学经验，重点介绍相关的工程设计考量。

为了成功富集和扩增抗原特异性T细胞，必须将负载肽的MHC-Ig和共刺激分子成功连接到人工抗原呈递细胞（aAPC）颗粒上。根据三种颗粒连接方法，我们提供了连接步骤成功结果的一些代表性数据（图5a）。事实上，如果配体密度太低，则无法有效刺激抗原特异性的CD8+ T细胞；根据我们的经验，当配体之间的线性间距超过100 nm时，即会出现此情况（图5b）7。
除了定量荧光抗体检测和转基因CD8+ T细胞扩增外，还可通过掺入同源转基因抗原特异性CD8+ T细胞来对纳米颗粒aAPC进行质量控制检测。该方法可通过从转基因小鼠（如Pmel小鼠，其含有gp100特异性抗原特异性CD8+ T细胞）中分离CD8+ T细胞，并以1:1000的比例掺入B6背景小鼠中实现。富集前后进行计数和染色，可计算富集倍数（<s...

由于抗原特异性T细胞频率极低，因此难以对其进行表征或用于治疗。本文中，我们提供了一种磁性微粒的制备方案，该微粒可结合抗原特异性T细胞，用于富集这些细胞，并将其扩增数百倍，从而用于后续的表征与治疗应用。

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

我们开发了一种工具，可用于富集和扩增抗原特异性T细胞。该工具在以下情况下可能具有帮助作用：A）检测……的存在

因此，我们这项新技术的主要优势在于，我们将其称为“E加E”（E plus E），即富集加扩增，能够同时实现对这些稀有抗原特异性细胞的富集与扩增。这使我们能够获得足够数量的细胞，用于研究它们在不同环境及不同临床条件下的作用，甚至使我们现在能够制备大量细胞，用于此前无法实现的免疫治疗。我们所开发的这种“E加E”方法，有助于回答基础免疫学中关于新抗原表位（neoepitopes）存在与否的关键问题。什么是新表位？新表位是一类个性化的抗原表位，目前已知在癌症免疫治疗、抗原特异性免疫应答动态过程以及这些因素对疾病状态的影响中具有重要意义，同时也关系到有效的细胞治疗。该技术的应用前景涵盖免疫治疗领域，因为纳米颗粒人工抗原呈递细胞有望成为一种即用型产品，可便捷地针对个体患者的免疫应答进行定制化调整。为了制备纳米颗粒人工抗原呈递细胞，将冻干的颗粒重悬于1毫升重悬缓冲液中，并剧烈涡旋振荡至少15分钟，直至肉眼不可见任何聚集体。若颗粒在与蛋白反应前未充分涡旋和重悬，将形成无法解离的大颗粒聚集体。将磁性颗粒置于磁力架上以去除上清液，再用0.5毫升新鲜重悬缓冲液重悬颗粒。将颗粒悬浮液转移至玻璃闪烁瓶中，涡旋振荡直至无可见聚集体，然后每1毫克重悬颗粒加入0.1毫克总刺激信号分子。涡旋后，将悬浮液在室温下于旋转仪中反应2.5小时，期间持续混匀；随后加入0.1毫升淬灭缓冲液，在室温下继续孵育30分钟，同时保持混匀。第二次反应结束后，将闪烁瓶置于磁力架上，用1毫升重悬缓冲液洗涤颗粒四次，每次洗涤待缓冲液变澄清后弃去，并更换新鲜的重悬缓冲液进行下一次磁力洗涤。最后一次洗涤后，吸除溶液并将颗粒从磁力架上取下，随后将颗粒置于1毫升新鲜重悬缓冲液中，在4摄氏度条件下保存，最长可保存六个月。为分离抗原特异性的CD8+T细胞，将野生型C57BL/6J小鼠的脾脏和淋巴结通过无菌的70微米细胞筛网研磨，并频繁用PBS冲洗，然后根据制造商说明书使用非接触式CD8+T细胞分离试剂盒去除非CD8+T细胞。计数后，通过离心收集分离的CD8+T细胞，将细胞沉淀重悬于含0.5%牛血清白蛋白和2毫摩尔EDTA的100微升PBS中，随后将细胞与纳米颗粒人工抗原呈递细胞共同孵育，每1×10⁶个分离的CD8+T细胞加入1×10¹¹个负载肽段的MHC-ig，在无菌的5毫升聚苯乙烯圆底试管中，4摄氏度条件下持续混匀孵育1小时。孵育结束后，按照演示方法在磁力架上将纳米颗粒细胞悬液洗涤三次，最后一次洗涤后，用500微升新鲜的完全培养基重悬人工抗原呈递细胞和富集的CD8+ T细胞，培养基中添加1% T细胞生长因子。为最大程度回收细胞，关键步骤是将颗粒和细胞在磁柱上静置至少两分钟，并小心吸除缓冲液，避免扰动处于磁场作用下的颗粒和细胞。计数后，将每160微升完全培养基（含1% TCGF）中接种2.5 × 10⁵个富集的CD8+ T细胞与磁

enrich-expand-rare-antigen-specific-t-cells-with-magnetic

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

利用磁性纳米粒子丰富和扩大罕见抗原特异性 t 细胞

本文介绍了一种利用人工抗原呈递细胞（aAPC）从大量T细胞群体中激活并扩增人源NKT细胞的方法。采用基于CD1d的aAPC可提供一种标准化的方法，用于大量生成具有功能活性的NKT细胞。...

人工抗原呈递细胞（aAPC）介导的自然杀伤T细胞活化与扩增

本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体...

基于肽段-MHC四聚体的表位特异性T细胞富集

本视频介绍了通过磁性分离器利用负向选择法从小鼠脾脏中富集T细胞的技术。该技术通过使用针对特定细胞表面抗原的抗体或配体，靶向去除样本中的其他细胞，从而实现T细胞的富集。...

T细胞富集：利用磁性分离技术从混合细胞群体中分离T细胞的方法

本视频介绍了一种利用磁性纳米颗粒为基础的磁性人工抗原提呈细胞（aAPCs）分离稀有抗原特异性CD8+ T细胞的实验方案，该aAPCs经抗原肽负载的MHC-Ig复合物及抗CD28抗体功能化修饰。aAPCs可特异性结合表达靶向该抗原肽的T细胞受体的CD8+ T细胞，并实现其后续扩增 体外，导致该 CD8+ T...

基于纳米颗粒的抗原特异性CD8+ T细胞富集与扩增

本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。...

免疫靶向磁-等离子体纳米簇的合成

本文介绍了一种经过优化的实验方案，可用于从小鼠脾脏中大量生成小鼠不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）。该方案详细阐述了富集、分离和扩增脾脏iNKT细胞的方法。 体外 使用有限数量的动物和试剂。...

一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤T细胞的优化方法

本文介绍了一种掺钴磁性铁蛋白的合成与阳离子化方案，以及利用阳离子化磁性铁蛋白快速磁化干细胞的方法。...

合成阳离子化磁铁蛋白用于细胞的超快速磁化

本文介绍了一种简单而有效的方法，该方法利用磁性纳米颗粒来检测并富集抗原反应性B细胞，以进行功能和表型分析。...

稀有抗原特异性B细胞的检测与富集用于表型和功能分析

我们描述了一种快速且稳健的方案，用于从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，并在体外扩增至适合体外和体内研究的细胞数量。...

用于体外和体内研究的小鼠不变的自然杀伤T细胞的纯化与扩增

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。...

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

了解利用磁性纳米粒子同时富集和扩增罕见抗原特异性T细胞的E加E技术。该方法通过纳米粒子人工抗原呈递细胞实现高效细胞扩增，为癌症免疫治疗中的新抗原研究及个性化细胞治疗提供可扩展的技术平台。

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

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