Name: 利用毛细管区电泳串联质谱技术进行大尺度自上而下蛋白质组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习利用毛细管区电泳串联质谱技术进行大规模自上而下蛋白质组学分析，实现蛋白质异构体与翻译后修饰的高分辨率表征。该方法可高效分离完整蛋白质并灵敏检测，适用于复杂样本中蛋白质形态鉴定。

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作者感谢密歇根州立大学化学系Heedeok Hong课题组慷慨提供实验所用的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。作者感谢美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of Health）通过资助项目R01GM118470（授予X. Liu）和R01GM125991（授予L. Sun和X. Liu）提供的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种详细的方案，利用毛细管区带电泳-串联质谱法（CZE-MS/MS）对简单蛋白质样品中的蛋白质变体进行高分辨率表征，并对复杂蛋白质组样品中的蛋白质变体进行大规模鉴定。图示为CZE-ESI-MS/MS系统的示意图 图1该方案中有四个关键步骤。首先，在分离毛细管内壁上制备高质量的LPA涂层至关重要。经LPA涂层处理的分离毛细管可降低毛细管内的电渗流，拓宽毛细管区带电泳的分离窗口，并减少蛋白质在其内壁上的吸附19. 制备LPA涂层的聚合反应进行如下 通过 将毛细管填充入丙烯酰胺（单体）与过硫酸铵（聚合引发剂）的混合物，随后将毛细管置于水浴中加热以引发反应22水浴中的反应时间至关重要。反应时间过短会导致反应不完全，涂层质量差。我们通常将反应时间延长至50分钟，以确保反应充分进行，获得更佳的涂层效果。若反应时间过长，毛细管可能发生堵塞，此时可能需要使用高效液相色谱（HPLC）泵通过水冲洗将毛细管内的聚合物推出。根据文献报道及我们的经验，一根LPA涂层毛细管可连续使用...

自上而下的蛋白质组学（TDP）旨在对蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。由于蛋白质组具有高度复杂性和宽广的浓度动态范围，TDP依赖于在电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）分析之前对完整蛋白质进行高效的液相分离1,2,3,4,5。毛细管区带电泳（CZE）是一种基于生物分子荷质比实现分离的强有力技术6。CZE方法相对简单，仅需一根开放式熔融石英毛细管、背景电解质（BGE）和电源即可完成。完整蛋白质样品可通过压力或电压加载至毛细管中，通过将毛细管两端浸入BGE并施加高电压来启动分离过程。CZE在生物分子分离中可达到极高的分离效率（&#62;一百万理论塔板数）7。与广泛使用的反相液相色谱（RPLC）-MS相比，CZE-MS在完整蛋白质分析中具有显著更高的灵敏度8。尽管CZE-MS在大规模自上而下蛋白质组学中具有巨大潜力，但其在蛋白质组学中的广泛应用仍受到若干问题的限制，包括样品负载量低和分离时间窗口窄。CZE中的典型样品加载体积约为毛细管总体积的1%，通常对应于不足100 nL9,10,11。由于强烈的电渗流（EOF），CZE的分离时间窗口通常少于30分钟9,10。这些问题限制了CZE-MS/MS从复杂蛋白质组中鉴定大量蛋白质变体以及低丰度蛋白质变体的能力。
人们已付出大量努力以提高毛细管区带电泳的样品加载体积 通过 在线样品浓缩方法例如，固相微萃取 [SPME]12,13场增强样品堆积 [FESS]9,11,14，以及动态 pH 连接15,16,17,18）。FESS 和动态 pH 界面比 SPME 更简单，仅需样品缓冲液与背景电解质（BGE）在电导率和 pH 值上存在显著差异。FESS 采用电导率远低于 BGE 的样品缓冲液，导致分析物在毛细管中样品区带与 BGE 区带交界处发生堆积。动态 pH 界面则利用一个碱性样品塞（例如，50 mM 碳酸氢铵，pH 8）和酸性BGE（例如，5% [v/v] 乙酸，pH 2.4）置于样品塞的两侧。在毛细管进样端施加高正电压后，碱性样品塞发生滴定反应，使分析物聚焦为一个紧密的样品塞，随后进行CZE分离。近期，Sun课题组系统比较了FESS与动态pH junction在线富集完整蛋白质的性能，结果表明，当样品进样体积为毛细管总体积的25%时，动态pH junction在完整蛋白质的在线浓缩中表现显著优于FESS19.
已采用中性涂层分离毛细管（例如，线性聚丙烯酰胺 [LPA]），以减少毛细管中的电渗流（EOF），从而减缓毛细管区带电泳（CZE）的分离速度并拓宽分离时间窗口20,21。最近，Dovichi 研究组开发了一种简便的方法，利用过硫酸铵（APS）作为引发剂，并通过温度（50 °C）引发自由基生成和聚合反应，从而在毛细管内壁形成稳定的 LPA 涂层22。更近的研究中，Sun 研究组将 LPA 涂层分离毛细管与动态 pH 结合技术相结合，实现了完整蛋白质的毛细管区带电泳分离，样品加载体积达到微升级别，分离时间窗口长达 90 分钟19。该 CZE 系统为大规模自上而下蛋白质组学中应用 CZE-MS/MS 技术开辟了新途径。
CZE-MS 需要一种高度稳定且灵敏的接口，以实现 CZE 与 MS 的联用。在 CE-MS 的发展历程中，已有三种 CE-MS 接口得到充分开发并实现商业化，其中一种为同轴鞘流接口23，采用多孔尖端作为电喷雾电离发射器的无鞘层接口24以及电驱动泵鞘流接口25,26基于电驱动泵控鞘流接口的毛细管区带电泳-串联质谱技术已达到zeptomole级别的肽段检测限9单次运行中从HeLa细胞蛋白质组获得超过10,000个肽段鉴定（IDs）14一种对完整蛋白质进行快速表征的方法11，以及对生物分子进行高度稳定且可重复的分析26最近，LPA 涂层分离毛细管、动态 pH 结合方法以及电驱动泵鞘流接口被用于大规模自上而下蛋白质组学分析 大肠杆菌 (E. coli蛋白质组19,27单次运行中，CZE-MS/MS 平台接近鉴定出 500 种蛋白质变体19 近6,000个蛋白质异构体鉴定结果 通过 与尺寸排阻色谱（SEC）-反相液相色谱（RPLC）分级联用27结果清楚地展示了毛细管区带电泳-串联质谱（CZE-MS/MS）在大规模自上而下蛋白质组学中的应用能力。
本文详细描述了利用毛细管区带电泳-串联质谱法（CZE-MS/MS）进行大规模自上而下蛋白质组学分析的实验流程。该CZE-MS/MS系统采用LPA涂层毛细管以减少毛细管内的电渗流，利用动态pH junction方法实现蛋白质的在线富集，通过电动泵驱动的鞘流接口实现CZE与质谱的耦合，采用Orbitrap质谱仪采集蛋白质的MS和MS/MS谱图，并使用TopPIC（基于自上而下质谱的蛋白质变体鉴定与表征）软件进行蛋白质变体鉴定。 通过 数据库检索

<table><tbody><tr><td>熔融石英毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>50 &amp;micro;m 内径，360 &amp;micro;m 外径</td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>LC-MS 级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA48-1</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td>有毒，健康危害</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6514</td><td>对湿气和热敏感</td></tr><tr><td>氢氟酸</td><td>Acros Organics</td><td>423805000</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>有毒，健康危害</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>健康危害，氧化剂</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素 C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>肌红蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>碳酸酐酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3934</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Alfa Aesar</td><td>36428-36</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>健康危害</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122270250</td><td>健康危害</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>腐蚀性，健康危害</td></tr><tr><td>C4 捕获柱</td><td>Sepax Technologies</td><td>110043-4001C</td><td>3 &amp;micro;m 颗粒，300 &amp;Aring; 孔径，4.0 mm 内径，10 mm 长</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>有毒，氧化剂</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1066-33-7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快流速滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>126-0020</td><td>0.2 &amp;micro;m CN 膜，50 mm 直径</td></tr><tr><td>大肠杆菌细胞</td><td></td><td></td><td>K-12 MG1655</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量测定</td><td>Thermo Scientific</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td></td></tr><tr><td>用于蛋白质脱盐的高效液相色谱系统</td><td>Agilient</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>毛细管电泳自动进样器</td><td>CMP Scientific</td><td>ECE-001</td><td></td></tr><tr><td>电驱动鞘流接口</td><td>CMP Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF 混合四极杆-轨道阱质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutter 火焰/布朗微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>用于细胞裂解的超声波细胞破碎仪</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td>型号 S-250A</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr></tbody></table>

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）已被公认为是一种用于自上而下蛋白质组学研究的有效工具，旨在对复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行表征。然而，由于毛细管区带电泳（CZE）的样品负载量低且分离时间窗口窄，其在大规模自上而下蛋白质组学中的应用受到限制。本文描述了一种采用微升级样品加载体积和90分钟分离时间窗口的CZE-MS/MS方法，适用于大规模自上而下蛋白质组学分析。该CZE-MS/MS平台基于一种涂覆线性聚丙烯酰胺（LPA）的分离毛细管，具有极低的电渗流；采用基于动态pH连接的在线样品富集方法，可高效实现蛋白质堆积；配备电驱动泵式鞘流CE-MS接口，灵敏度极高；并结合具有高质荷比分辨率和扫描速度的离子阱质谱仪。该平台可用于对简单的完整蛋白质样品进行高分辨率分析，以及对多种复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征。例如，利用该平台实现了标准蛋白质混合物的高效分离，并对多种杂质实现了高灵敏度检测。另一个示例表明，在单次CZE-MS/MS运行中，该平台可从大肠杆菌（Escherichia coli）蛋白质组中鉴定出超过500种蛋白质变体和190种蛋白质。

图1 展示了基于动态 pH 界面的毛细管区带电泳-电喷雾质谱联用系统（CZE-ESI-MS）在实验中所用的示意图。将一段较长的、溶于碱性缓冲液中的样品注入内壁涂覆有 LPA 的分离毛细管中，该毛细管预先充满酸性背景电解质（BGE）。施加高电压 I 和 II 后，样品区带中的分析物将被富集 通过 动态pH结方法。为评估CZE-MS系统的性能，通常分析一种标准蛋白质混合物（细胞色素c、溶菌酶、β-酪蛋白、肌红蛋白、CA和BSA）。标准蛋白质混合物的代表性电泳图如下所示 图2A标准蛋白混合物通常至少重复运行两次，以评估系统的分离效率和重现性。分离效率可通过某些蛋白质的理论塔板数来评估，如图所示 图2B可通过蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差来评估重现性。 图3</strong...

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。

毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）已被公认为是一种用于自上而下蛋白质组学研究的有效工具……

该方法有助于提高对细胞中蛋白质异构体及蛋白质翻译后修饰的大规模、高分辨率表征能力。该技术的主要优势在于，毛细管区带电泳质谱法可实现对完整蛋白质的高效分离和高灵敏度检测。进行毛细管预处理时，需在10 psi压力下用氮气干燥至少12小时。然后，使用注射泵将体积分数为50%的甲基丙烯酸丙酯甲醇溶液注入毛细管中。用硅橡胶密封毛细管的两端。在室温下孵育至少24小时后，按照文本方案中的描述，继续在分离毛细管内壁涂覆线性聚丙烯酰胺。使用温和的火焰灼烧毛细管的一端，去除距其一端约四厘米处的聚酰胺外层涂层。轻轻擦拭灼烧过的部位，彻底清除残留的聚酰胺涂层。在200微升离心管的管底钻一个与毛细管外径大小相近的小孔，以便将毛细管穿过该孔后能够稳固固定。将毛细管靠近烧灼端的一端穿过孔洞，直至烧灼部分进入管内。然后，向200微升的管中加入约150微升的HF，使HF溶液在毛细管的烧灼部分上升至约一半位置。将毛细管在室温下于HF溶液中孵育90至100分钟。按照文本方案中的描述制备标准蛋白质混合物和大肠杆菌样品。为建立毛细管区带电泳（CZE）系统，将样品、背景电解质和分离毛细管装入CZE自动进样器中。在CZE自动进样器的手动控制页面中选择样品加载。将背景电解质小瓶装入自动进样器的缓冲液托盘中，并记录其在缓冲液托盘中的位置。然后，将样品小瓶装入自动进样器的样品托盘中，并记录其在样品托盘中的位置。使用手动控制将自动进样器移至对齐位置。现在，使用毛细管未刻蚀的一端，将分离毛细管装入CZE自动进样器中。如果样品体积低于50 µL，请调整毛细管进样端的高度。通过手动控制将自动进样器切换至待机状态。在系统中输入样品位置，并将毛细管移至样品处。将毛细管的进样端进一步下推，直至触及样品瓶底部。继续使用手动控制，以 20 psi 的压力用背景电解质冲洗毛细管 20 分钟。现在，将商用的电驱动泵鞘流接口安装至质谱仪前端。用含有10%（体积分数）甲醇和0.2%（体积分数）甲酸的LCMS级水溶液缓冲液填充鞘流缓冲液储液罐。通过注射器手动加压，用鞘流缓冲液冲洗接口中的T形接头。将外径为1毫米的电喷雾发射器末端穿过套管，并通过接头将发射器与T型接口的一个端口连接。再次使用注射器手动冲洗T型接口，以使鞘液缓冲液充满发射器。借助接口附带的摄像头，调节发射器喷口与质谱仪入口之间的距离至约2毫米。在鞘液缓冲液瓶上施加 2 至 2.2 千伏的电压以产生电喷雾。然后调节喷雾电压，以获得稳定的电喷雾。在此过程中，对毛细管的进样端施加低压，确保毛细管内无气泡。关闭喷雾电压，轻轻将分离毛细管的刻蚀端经T形接头穿入喷雾头，直至无法继续推进。停止毛细管进样端的低压后，用鞘液缓冲液轻微冲洗喷雾头。再次施加2至2.2千伏的喷雾电压以测试喷雾情况。在主仪器界面的文件下拉菜单中选择新方法。随后，为样品进样设置如下参数：进样起始样品瓶和结束样品瓶均选为进样口，样品盘位置设为样品，压力设为 5 psi，千伏设为 0，持续时间为 95 秒。然后，设置分离标准蛋白质混合样品的参数：进样口设为进样瓶，样品盘位置设为缓冲液，压力设为 0 psi，千伏设为 30，持续时间为 4,200 秒。为分离大肠杆菌蛋白质组样品，设置进样口为进样瓶，托盘为缓冲液，压力为0 psi，电压为20 kV，持续时间为6,600秒。最后，设置进样口为进样瓶，托盘为缓冲液，压力为10 psi，电压为30 kV，持续时间为600秒，用于毛细管冲洗。现在，使用四极离子阱质谱仪设置完整蛋白质分析的MS和MS/MS参数。为调整调谐文件设置，请开启完整蛋白质模式，并将捕获压力设为 0.2。将离子传输毛细管温度设置为 320 摄氏度，S-透镜射频水平设为 55。要执行 CZE MS/MS 实验，首先在质谱仪计算机上选择运行序列，然后启动数据采集方法。然后，在毛细管电泳自动进样器的计算机上启动毛细管电泳程序。使用 TopPIC 套件中的 TopPIC 软件及其图形用户界面进行数据库搜索。单击数据库文件，并选择合适的数据库用于搜索。单击质谱文件并选择生成的 ms2.msalign 文件作为输入。选择 MS1 特征文件，并选取生成的特征文件。由于碘乙酰胺处理，将半胱氨酸的羧甲基化（C57）设为固定修饰。选择诱饵数据库功能，在截断值设置中，于谱图水平旁边的下拉菜单中选择错误发现率。将谱图水平的错误发现率设为0.01。保持生成函数未选中状态，并将误差容差设置为百万分之十五。在蛋白质形式水平上，将错误发现率设置为 0.05。在高级参数中，从下拉菜单中选择最大质量偏移数为二。将未知修饰的最大质量偏移设置为 500 道尔顿。其余参数均保持默认值，点击图形用户界面右下角的开始按钮。标准蛋白质混合物的代表性电泳图谱如下所示。标准蛋白质混合物通常至少重复运行两次，以评估系统的分离效率和重现性。分离效率可通过某些蛋白质的理论塔板数来评估。重现性可通过蛋白质信号强度和迁移时间的相对标准偏差来评估。CZE MS/MS 平台可用于对各种复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征，在单次运行中以高置信度鉴定出超过 500 种蛋白质变体和 190 种蛋白质。此处，电泳图的放大视图可用于评估系统的分离窗口。极低的 E 值和谱图 FDR 表明蛋白质变体鉴定具有高置信度。匹配的碎片离子数量较多，进一步说明鉴定结果具有高可信度。在进行该操作时，务必记住要缓慢而轻柔地将刻蚀分离毛细管穿入电喷雾发射器中。可在CZE-MS流程中采用稳定同位素标记或无标记方法，以确定不同条件下细胞中蛋白质异构体丰度的变化。该技术发展后，为自上而下蛋白质组学领域的研究人员探索蛋白质异构体在调控细胞多种生物学过程中的作用铺平了道路。请注意，使用氢氟酸具有极高的危险性，进行该操作时必须采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备，并制定应急处理预案。

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利用毛细管区电泳串联质谱技术进行大尺度自上而下蛋白质组学

由于耳蜗感觉上皮组织体积微小，且膜蛋白难以分离和鉴定，对其进行蛋白质组分析具有较大挑战性。通过结合多种样品制备方法、分离技术以及高分辨率质谱分析，可实现对膜蛋白和可溶性蛋白的鉴定。...

自下而上与鸟枪法蛋白质组学鉴定耳蜗全面蛋白质组

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文描述了双分子互补亲和纯化（BiCAP）的实验方案。该新方法能够特异性地分离任意两个相互作用的蛋白质，并对其进行后续蛋白质组学表征，同时排除未形成复合物的单个蛋白质以及与竞争性结合伴侣形成的复合物。...

通过双分子互补亲和纯化技术（BiCAP）解析多蛋白信号复合物

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TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

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基于细胞谱系引导的质谱蛋白质组学在发育中（青蛙）胚胎中的应用

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一种利用选定组织区域进行质谱法蛋白质组学的简化方法

学习利用毛细管区电泳串联质谱技术进行大规模自上而下蛋白质组学分析，实现蛋白质异构体与翻译后修饰的高分辨率表征。该方法可高效分离完整蛋白质并灵敏检测，适用于复杂样本中蛋白质形态鉴定。

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

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