利用毛细管区电泳串联质谱技术进行大尺度自上而下蛋白质组学
2018年10月24日
通过毛细管区电泳-电喷雾-串联质谱 (CZE-proteoforms), 描述了蛋白质样品中的分离、鉴定和表征的详细协议。该协议可用于简单蛋白样品中 proteoforms 的高分辨率表征和复杂蛋白质组样本中 proteoforms 的大尺度鉴定。
该方法有助于改善蛋白质异构形式和细胞转化后蛋白质的大规模和高分辨率表征。该技术的主要优点是毛细管区电泳质谱仪提供高效分离和高度灵敏的检测完整蛋白质。要预处理毛细管，用氮气在 10 psi 下干燥至少 12 小时。
然后，使用注射器泵将毛细管中 50% 体积的 3 丙基甲基丙烯酸酯填充到甲醇中。用硅橡胶密封毛细管的两端。在室温下孵育至少24小时后，继续在分离毛细管内壁上涂上线性聚丙烯酰胺涂层，如文本协议所述。
使用柔和的火焰燃烧毛细管的一部分，以去除离毛细管一端约四厘米的聚酰胺外涂层。通过擦拭，轻轻清洁毛细管的烧伤部分，以完全去除聚酰胺涂层。在 200 微升管的末端钻一个小孔，其尺寸与毛细管外径相同，一旦毛细管穿过此孔，就足以将毛细管保持到位。
螺纹毛细管的末端，靠近烧伤部分通过孔，直到烧伤部分在管中。然后，在 200 微升管中加入大约 150 微升 HF，使 HF 溶液大约是毛细管上烧伤部分的一半。在室温下孵育HF溶液中的毛细管90至100分钟。
准备标准蛋白质混合物和大肠杆菌样品，如文本协议中所述。要设置毛细管区电泳或 CZE 系统，请将样品、背景电解质和分离毛细管加载到 CZE 自动采样器中。在 CZE 自动采样器的手动控制页中选择样品负载。
将背景电解质小瓶加载到自动采样器的缓冲盘中，注意其在缓冲盘中的位置。然后，将样品小瓶装入自动取样器的样品托盘中，注意其在样品托盘中的位置。使用手动控制将自动采样器置于对齐位置。
现在，使用毛细管的非蚀刻端将分离毛细管加载到 CZE 自动采样器中。如果样品体积小于 50 微升，请调整毛细管喷射端的高度。使用手动控制将自动采样器切换到待机状态。
在系统中键入样品位置，然后将毛细管移动到样品中。将毛细管的喷射端进一步向下推，以到达样品瓶的底部。继续使用手动控制，使用背景电解质冲洗毛细管 20 分钟，压力为 20 psi。
现在，在质谱仪的前面安装一个商用电镀泵护套流接口。在 LCMS 级水中，用含有 10% 体积甲醇和 0.2% 体积甲酸的缓冲液填充护套缓冲液库。通过使用注射器手动施加压力，用护套缓冲液冲洗界面中的 T。
通过套管螺纹电喷雾发射器的一毫米外径端，并通过接头将发射器与 T 的一个端口连接。只需用注射器手动再次冲洗 T，即可用护套缓冲液填充发射器。在接口附带的摄像机的帮助下，将发射器的孔与质谱仪入口之间的距离调整到大约两毫米。
在护套缓冲器小瓶上施加 2 到 2.2 千伏电压进行电喷。然后，调整喷雾电压以达到稳定的电喷。在此过程期间，在毛细管的喷射端施加低压，以确保毛细管中没有气泡。
关闭喷雾电压，通过 T 轻轻将分离毛细管蚀刻端螺纹入发射器，直到无法进一步推。在停止毛细管喷射端的低压后，用护套缓冲器冲洗发射器一点。再次，施加 2 到 2.2 千伏的喷雾电压来测试喷雾。
在主仪器屏幕上的文件下拉菜单下选择新方法。在那里，选择入口作为起始样品小瓶，结束样品小瓶，托盘作为样品，压力为5 psi，千伏为零，持续时间为95秒的样品注射。然后，将进气作为进气瓶，托盘设置为缓冲液，压力为零 psi，千伏为30，持续时间为4，200秒，用于分离标准蛋白混合物样品。
对于大肠杆菌蛋白蛋白组样品的分离，将进气作为入口小瓶，托盘设置为缓冲器，压力为零 psi，千伏为 20，持续时间为 6，600 秒。最后，选择入口作为入口小瓶，托盘作为缓冲器，压力为10 psi，千伏为30，持续时间为600秒毛细管冲洗。现在，使用四离子陷阱掩膜光谱仪设置MS和MS/MS参数，用于完整的蛋白质分析。
要调整调谐文件设置，请打开完整的蛋白质模式并使用 0.2 的陷印压力。将离子传输毛细管温度设置为 320 摄氏度，将 S-镜头 RF 电平设置为 55。要执行 CZE MS/MS 实验，请首先选择运行序列，在质谱仪计算机上启动数据采集方法。
然后，在毛细管电泳自动采样器计算机上启动毛细管电泳序列。在 TopPIC 套件和 TopPIC 图形用户界面中使用 TopPIC 执行数据库搜索。单击数据库文件并选择适当的数据库进行搜索。
单击频谱文件并选择生成的 ms2。作为输入生成的 msalign 文件。选择 MS1 要素文件并选择生成的要素文件。
将半胱氨酸碳基C57设置为固定修饰，由于碘多乙酰胺治疗。选择诱饵数据库功能和截止设置下，在频谱级别旁边的下拉菜单中选择错误发现率。在频谱级别将错误发现率设置为 0.01。
保持生成函数未选中，将误差容差设置为百万分之 15。将错误发现率设置为 0.05 的蛋白质形式级别。在高级参数下，为下拉菜单中的最大质量班次数选择两个。
将未知修改的最大质量移位设置为 500 道尔顿。将所有其他参数保留为默认值，然后单击图形用户界面右下角的"开始"按钮。显示了标准蛋白质混合物的代表性电图。
标准蛋白质混合物通常至少重复运行，以评估系统的分离效率和可重复性。分离效率可以用某些蛋白质的理论板数来评价。可重复性可以通过蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差来评价。
CZE MS/MS 平台可用于在各种复杂蛋白质组中大规模表征蛋白体，在一次运行中以高置信度识别出 500 多个蛋白质和 190 种蛋白质。在这里，电图的放大视图可用于评估系统的分离窗口。极低的E值和光谱FDR表明蛋白质组符号ID的高置信度。 大量匹配的片段离子进一步表明ID的高置信度。
稳定的同位素标记或无标签方法可以纳入CZE MS程序，以确定细胞在各种条件下的蛋白质形式丰度如何变化。该技术开发后，为自上而下的蛋白质组学领域的研究人员探索蛋白质组在调节细胞中各种生物过程方面的作用铺平了道路。不要忘记，使用氢氟酸可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，如适当的个人防护设备和应急程序。
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概述
本文介绍了一种详细的协议，用于使用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱（CZE-ESI-MS/MS）分离和表征蛋白质形态。该方法提高了各种蛋白质样品中蛋白质同工型和翻译后修饰的分辨率和识别。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 质谱分析
- 生化分析
背景
- 毛细管区带电泳质谱提供了高效的蛋白质分离。
- 对完整蛋白质的高灵敏度检测是一个关键优势。
- 理解蛋白质形态对于研究蛋白质功能至关重要。
- 翻译后修饰显著影响蛋白质活性。
研究目的
- 开发一种用于高分辨率蛋白质形态表征的协议。
- 促进复杂样品中蛋白质形态的大规模识别。
- 改善对蛋白质同工型和修饰的理解。
所用方法
- 毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱（CZE-ESI-MS/MS）。
- 用氮气预处理毛细管。
- 使用3-丙基甲基丙烯酸酯进行毛细管填充。
- 在毛细管壁上涂覆线性聚丙烯酰胺。
主要结果
- 成功分离和识别了蛋白质形态。
- 在简单和复杂样品中实现了高分辨率表征。
- 证明了CZE-ESI-MS/MS方法的有效性。
- 该协议适用于各种蛋白质分析场景。
结论
- 开发的协议增强了蛋白质形态分析能力。
- 它提供了一种研究蛋白质修饰的稳健方法。
- 这种技术可以推动蛋白质组学和相关领域的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Large-scale top-down proteomics using CZE-ESI-MS/MS enables high-resolution characterization of proteoforms, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The platform improves predictive confidence by resolving protein isoforms and post-translational modifications in complex proteomes, informing go/no-go decisions. Its scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery biology and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution proteoform separation and identification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing protein isoforms and modifications with high confidence.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence for portfolio triage via sensitive detection of proteoform variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through reproducible proteoform profiling.
- Operational Value: Enables assay standardization with quantitative outputs from high-sensitivity detection of intact proteins.
- Strategic Value: Improves screening readiness and platform reuse via scalable separation of complex proteomes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical validation through disease-relevant proteoform characterization in complex samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity by enabling consistent proteoform analysis across model systems.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions via high-confidence identification of modification-driven proteoforms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic de-risking and predictive analytics prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution separation of proteoforms.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative proteoform detection in complex mixtures.
- Analytics: Provides high-mass-resolution and high-scan-speed MS/MS data for confident proteoform identification and quantification.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing proteoforms in disease-relevant systems like E.coli proteomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for large-scale proteoform characterization across multiple projects and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through high-resolution proteoform separation and sensitive detection.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via automated CZE-MS/MS workflow with 90-minute separation window.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in protein function and modification landscapes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by confident identification of over 500 proteoforms and 190 proteins per run.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry, and proteoform data analysis.
- Needs instrumentation including LPA-coated capillary, electrokinetically pumped sheath flow CE-MS interface, and ion trap mass spectrometer.
- Demands cross-team standardization for sample preparation, HF treatment safety, and data analysis using TopPIC.
- Involves adaptation considerations for varying sample loading volumes and complex proteome matrices.
- Includes practical limitations such as hazardous HF handling and requirement for high-purity reagents and solvents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Etching of the Capillary with Hydrofluoric Acid
2:04
Set-up of the CZE-MS/MS System and Analysis of the Samples
6:45
Database Search of the Collected Raw Files with the TopPIC Software
8:05
Results: Identification and Characterization of Proteoforms
9:14
Conclusion
