组织细胞外囊泡与肝脏分离

这种方法可以帮助我们解决有关细胞外囊泡在体内作用的关键问题，为我们提供了代表局部组织微环境的囊泡来源。研究组织内细胞外囊泡可以进一步理解细胞外囊泡的生理作用及其在体内病理生理过程的改变。入口静脉的视觉演示是有帮助的，因为静脉的体积小，很难转动操纵。

与高丽·石古罗医生一起演示这个程序的将是艾琳·严，一个来自我实验室的研究技术专家。在开始手术之前，固定麻醉小鼠的四肢，将带状血液采集的 23 量针连接到一块注射器泵管的自由端。用70%乙醇和酒精垫清洁小鼠的腹部皮肤，用剪刀将鼠标从胸部前部打开至骨盆骨，注意不要损坏任何内脏器官。

使用棉尖施用器轻轻地将肠子移动到腹腔的右侧，以暴露入口静脉和劣质静脉，并使用弯曲钳子在入口静脉下放置一根线。在缝合中松散地打结，准备在缝合后进行紧握，并在管缝中填充 40 摄氏度 HBSS，直到溶液到达管状针尖。将管插入连字下方 5 到 10 毫米的入口静脉中，用缝合固定管。

以每分钟一到两毫升的流速开始输液。如果管管正确放置，肝脏将开始发白。切下劣质的静脉卡瓦，让肝脏内过多的液体排出。

慢慢将流量提高至每分钟8毫升，直到在接下来的五分钟内，整个50毫升的HSSS通过肝脏被注入。就在HPSS用完之前，将新鲜准备好的40摄氏度胶原酶四溶液更换到香水烧杯上，并用钳子在五秒钟间隔内向劣质的维纳卡瓦应用瞬态压力，使肝脏肿胀，并帮助组织消化和分离。随着消化的进展，肝脏会膨胀并变白。

当用棉尖施用器轻轻探探后，当保持抑郁时，停止泵并取出管。从肝脏中去除胆囊，小心不要撕裂胆囊组织，并使用干净的剪刀和钳子将肝脏收获成PBS的无菌10厘米培养皿。轻轻洗涤后，将肝脏转移到含有新鲜胶原酶四溶液的10厘米培养皿中，并使用两个干净的钳子撕裂肝脏，同时轻轻摇动，将细胞从肝脏组织分离。

当整个器官被支离破碎时，使用三毫升注射器三分体化组织浆，直到未消化的肝脏被摇动。通过 70 微米尼龙网过滤器将产生的细胞溶液倒入 50 毫升锥形管中，用 HBSS 洗涤盘以收集任何剩余的细胞。用单细胞悬浮液进行洗涤，通过离心去除肝细胞。

然后将上一液转移到新的50毫升管中。要取出任何其他细胞，在将上流液转移到新的50毫升圆锥管中之前，将上流式前液离心。用另一个离心物去除死细胞，将上清液转移到一个圆形底部管中，以清除任何细胞碎片和聚集物。

现在，将上经剂转移到聚碳酸酯超离心管中，将颗粒重新放入约 20 毫升 PBS 中，进行第二次也是最后一次超离心。然后，如果不立即分析囊泡，将细胞外纳米囊颗粒重新在 PBS 的一毫升中，储存温度为零下 80 摄氏度。从单个小鼠肝脏，此方法产生组织细胞外囊泡浓度的范围为1.74至4倍10至第十二，均值为3.46倍10至第12毫升，由纳米粒子跟踪分析确定。

通过纳米粒子跟踪分析，分离的肝组织细胞外囊泡的均大小为157.7纳米，模式大小为144.5纳米，细胞外囊泡大小为100至600纳米。使用这种方法分离的细胞外囊泡适用于下游应用，进一步表征可能包括通过电显微镜或分析其表面标记或含量进行形态学评估。