可重复的 dsrna 微注射和蚊子和家蝇的奥维恩生物测定

该协议描述了一种微注射方法, 我们已经标准化并使用了几年, 直接向蚊子和家蝇的血淋巴输送特定数量的核酸。该协议可将注射死亡率降至最低, 并允许对繁殖力进行剂量相关测量。

这种方法可以帮助回答生物农药领域的关键问题，如双链RNA的影响基因表达，以及成年二头药的繁殖能力。该技术的主要优点是，可量化剂量的双链RNA被交付给蚊子或苍蝇，然后可以评估对多代杀伤力的影响。虽然这种方法适用于蚊子、伊蚊和家蝇，但也可以应用于其他种类的蚊子和苍蝇。

一般来说，对这种方法的新鲜人会很不自在，因为掌握注射程序本身就是一种时间投资。用最佳的针尖大小给每只昆虫注射针尖对于确保分娩，同时最大限度地减少伤害和死亡率至关重要。首先，使用钳子小心地将蚊子置于舞台，以便它们最终暴露在相距约半厘米的显微镜幻灯片上。

为了协助幻灯片处理，请将一个空间留到幻灯片的左端或右端的 1 个半厘米空间。然后把舞台昆虫的滑梯放在四摄氏度的高温下，放在一个大的培养皿里。在冷表上设置解剖显微镜和显微显微镜。

将玻璃毛细管拉到细尖后，将毛细管针放入微注射器中，用钳子打碎针尖。然后通过绘制和排出三次无核酶水冲洗针头。请注意，玻璃针开口大小因蚊子和家蝇而异。

接下来，为蚊子准备一个浓度适当的注射液。每毫升罗达明 B 添加三微克，以帮助可视化。使用移液器将三到四微升溶液转移到干净的表面，并将其拉入玻璃针中，而不会接触任何空气。

反复按下注射按钮，直到液体开始从针头中释放。使用超细点标记绘制大约一毫米的哈希标记，从液体半月板到针柄。将蚊子的滑梯设置在针头下，并确保视野足够宽，可以看到针头中的溶液半月板。

将针头与中间三分之一的中糖胸骨对齐。用放在蚊子对面的钳子将蚊子用钳子撑起针头，用针尖轻轻刺穿角质层。轻轻地将针头滑入蚊子中，直到尖端穿过中线。

按下注射按钮，直到注入所需量的液体。如果半月板不动，慢慢滑蚊子或飞离针头，同时观察半月板运动。如果注射溶液的一部分在取出针头后从角质层中移出，或者半月板不能移动，则丢弃昆虫，因为注射没有成功。

在房子的苍蝇上，将针头与中下层对齐。用放在苍蝇对面的钳子将苍蝇对头支撑在针上，用针尖轻轻刺穿角质层。转移注射的昆虫，以10至15组清除3.5盎司的杯子。

然后用网盖住杯子，让它们在室温下恢复。昆虫恢复后，将杯内倒置在浸在10%蔗糖溶液中的棉球上。首先，用新鲜血液填充12英寸的人造膜，并在热水浴中加热至60摄氏度。

用纸巾擦干膜，放在拿杯的网帽上。蚊子喂食后，更换棉球，让蚊子休息24小时。接下来，通过用大约30毫米的去离子水填充透明3.5盎司的生物醋酸盐杯来建造卵巢杯。

然后在杯子底部放置一块种子发芽纸。用网盖住杯子，在网盖上切一个小缝隙。喂食24小时后，在持杯盖上切开一个小缝隙，将成功喂入卵巢杯的女性转移到卵巢杯上。

然后用10%蔗糖饱和棉球密封在卵巢盖的小缝隙。监测蚊子，跟踪每日死亡率。在让蚊子在五到七天内被蚊子排卵后，在解剖显微镜下计算卵子。

演示该程序将是克里斯托弗·盖登博士，美国农业部 ARS 研究昆虫学家。注射三天后，用二氧化碳麻醉苍蝇。然后将苍蝇转移到一个干净的笼子里，并准备苍蝇饮食。

记录死亡率数据，并每天清除死苍蝇。接下来，混合75%小麦麸与25%颗粒活股票饲料的重量，以准备幼虫饲养介质。将水加入混合物中，直到达到 62% 的水分。

将湿润的麦麸活料饲料混合物加入黑布的正方形中，然后卷成一个球。使用橡皮筋将布固定到位，然后轻轻挤压，直到液体介质通过。将球放在60毫升的杯子里，放在飞笼里5个小时。

在此之后，将鸡蛋从球上冲洗掉，确保从布的褶皱下取出鸡蛋。摇动鸡蛋以破坏任何聚类，并将它们转移到一个分级的20毫升离心管。让鸡蛋沉淀，并注意管中沉淀的鸡蛋的体积。

然后加入足够的水，使体积达到已结算鸡蛋体积的20倍。接下来，使用磁搅拌棒混合水和鸡蛋悬浮液。最后，使用经过修改的移液器尖端将 0.5 毫升的悬浮液分配到一系列线条中预湿润的黑布上。

在该协议中，雌性蚊子被微注射以评估基因表达。用双股RNA注射女性，在多个卵巢周期中相对表达显著减少。dsRPS6 和 dsRPL26 治疗组在第一个营养循环中蚊子的平均离合器尺寸显著降低。

在雌性蚊子注射dsRPS6时，离合器尺寸有明显的剂量效应。家蝇还注射了五微克的双链RNA结构。与蚊子观察类似，注意到特定成绩单表达和离合器尺寸都显著减少。

在尝试此过程时，重要的是要记住丢弃未成功注射的昆虫。使用这个程序，任何双链RNA结构或其他生物配给可以交付给蚊子或苍蝇。不要忘记，使用玻璃针可能很危险，并且应始终在适当的锐化废物容器中处理。