肿瘤靶向免疫调节副病毒的设计与评价

该协议描述了一个详细的工作流程, 用于产生和体外表征的结肠病毒的免疫调节剂的表达, 使用麻疹病毒编码双特异性 t 细胞引擎为例。应用和适应其他载体平台和转基因将加速新的免疫病毒疗法的发展, 用于临床翻译。

这种方法有助于解决癌症免疫治疗领域的主要挑战，促进靶向免疫调节的肿瘤载体的发展。应用反向遗传系统的主要优点是它的多功能性;因此，载体可以适应各种研究问题和目标肿瘤与不同的免疫特征。病毒传播步骤，特别是确定收获病毒的最佳时间点很难从文本协议中学习，因为同步形成必须随着时间的推移进行视觉评估。

开始设计和克隆重组免疫调节载体，如手稿中所述。该协议描述了开发一种心胶状麻疹疫苗载体的具体步骤，编码为双特异性T细胞接合器。为了从cDNA中抢救麻疹病毒，24小时前转染板麻疹病毒产生细胞均匀地在6壁板上。

种子20万细胞在2毫升DMEM包含10%FBS每井，以达到65%至75%的汇合时转染。混合5微克的重组DNA编码麻疹病毒抗原组，将用于转染细胞。适当的质粒和荧光记者在总体积200微升DMEM。

将18.6微升脂质转染试剂加入混合物中，并立即轻拂管子进行混合。在室温下孵育这种转染混合物25分钟。为了转染MV生产细胞，从生长到65%至75%的汇合的6井板中去除介质，并添加1.8毫升DMEM，每井有2%的FBS和50微克。

然后将转染混合物滴到每个井中，并小心地旋转。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞过夜。第二天，用2毫升的新鲜DMEM代替介质，每毫升卡纳霉素为2%FBS和50微克，当介质变成黄色识别的酸性时，重复。

使用显微镜每天观察细胞，以进行记者基因表达和同步形成。当由20个或更多细胞组成的大同步体可见或当细胞变得过于密集收获病毒。在预期收获前24小时，在12毫升DMEM中，约150万个MV产生细胞，在10厘米的盘上，FBS为10%，在病毒接种时达到65%至75%的汇合率。

为了收集病毒，使用细胞刮刀小心地用转染细胞从6壁板中刮取附着的产生细胞。将含有刮过的电池的介质转移到离心管中。离心至少2500倍G和4摄氏度5分钟，以清除细胞碎片。

离心后将无细胞上经剂与无血清介质混合，最终体积为4毫升，以准备进一时。用MV培养细胞从10厘米培养皿中去除培养基，并将中分细胞添加到细胞中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育至少2小时。

孵育后加入6毫升DMEM，其中10%为FBS，并孵育细胞过夜。然后用12毫升的新鲜DMEM代替10%的FBS，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育，直到收获。每天至少观察两次细胞。

在同步爆发之前， 当膜中断变得可见收获病毒。要收获第一通道，请从盘子中去除上一道，并加入600微升的血清自由介质。然后使用细胞提升器刮取细胞并转移到干净的管子上。

紧接着将病毒冷冻在液氮中，并在80摄氏度下储存至少24小时，以确保彻底冷冻。使用 96 个墙板，确定每等物中病毒库存的滴度。首先将生产细胞从T75细胞培养瓶中拉入50毫升锥形管中。

计算细胞数，并在DMEM中用10%的FBS将细胞悬浮液调整为每毫升15万个细胞。加入 90 微升 DMEM，每 96 壁板的 FBS 为 10%。然后从病毒库存的一个等分中加入 10 微升到板的第一列的所有 8 个孔中。

通过上下移液至少10次彻底混合。使用多通道移液器将每井的 10 微升从第一柱转移到第二柱，然后通过上下移液进行彻底混合。对每列重复此步骤，使用每个稀释步骤的新鲜移液器提示获取病毒的连续十倍稀释。

从最后一列的每个井中丢弃 10 微升。在每毫升井中加入100个微升细胞悬浮液，每毫升有15万个细胞，确保没有细胞团块。在37摄氏度下孵育，48小时二氧化碳含量为5%。

使用光学显微镜检查同步。在列的每个井中计数同步，其最高稀释因子包含可见的同步。对于编码荧光记者的病毒，可以使用荧光显微镜计算同步。

用于分析麻疹病毒复制动力学在感染前一天种子10万维罗细胞在1毫升DMEM与10%FBS每孔12壁板与至少2孔每个时间点的兴趣点。感染细胞用含有相应量的病毒的300微升无血清介质取代该介质。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育至少2小时。

去除 inoculum，并添加 1 毫升 DMEM 与 10% FBS 并继续孵育。在相关时间点感染后收获病毒亲血性直接刮入介质。将每个井内的物品转移到单个管中。

在液氮中捕捉冻结，储存在80摄氏度，直到滴定，然后按照手稿中所述进行。为了开始通过LDH释放对BTE诱导细胞诱发细胞毒性进行评估，首先分离病毒感染目标细胞表达的分泌转基因产品，并分离出手稿中描述的免疫效应细胞。然后在 U 底部 96 壁板中播种目标细胞，并包括手稿中描述的样本。

以所需浓度将以前分离的免疫调节剂添加到相应的样品中。以所需比例添加免疫缺陷细胞，并添加介质，每井总体积为 100 微升。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育先前确定的时间框架。

样品采集前45分钟，将10微升10X Lysis溶液加入含有T max样品和相应介质控制并持续孵育的井中。将细胞在250倍G下离心4分钟。将 50 微升清水从每口井转移到平底 96 壁板的井中，确保不转移细胞。

根据制造商准备基板溶液后，每井加入50微升。在黑暗中室温下孵育30分钟，或直到T最大样品变成深红色。孵育后，每井增加50微升止损溶液。

在 4000 倍 G 下离心 1 分钟，然后使用空心针去除气泡。测量 490 纳米的光学吸收度，并按手稿中所述进行计算。接种后，未经过修改和BTE编码的病毒病毒生长曲线的对量在维罗细胞上出现类似的情况。

mc38 murine结直肠癌细胞的细胞活性曲线稳定地表达人类癌细胞抗原和接种后MV受体CD46，表明转基因编码病毒的解合活性在小鼠肿瘤细胞系中落后。在五种不同的稀释下，用BTE孵育的目标抗原表达细胞的流动细胞学显示，BTE以浓度依赖的方式由细胞结合。在BTE相关细胞磁拉下后免疫blot显示，当使用非靶向BTE时，没有可检测的细胞量;而当靶向BTE样本使用时，结合细胞存在于洗脱分数中。

BTE中培养靶抗原特异性和浓度依赖性，用代表性的LDH释放测定表示，在目前例中，与参考细胞相比，在相对较高的BTE浓度为每毫升1微克时，实现了15%特异性细胞杀杀。在尝试此程序时，重要的是要记住定期监测细胞，以检查感染的进展。不要忘记，重组麻疹疫苗菌株虽然衰减可能是危险的，特别是对免疫抑制的个人。

遵循适当的生物安全程序，避免接触。处理病毒的个人应在执行这些方法之前接种疫苗。按照这个程序，可以实现病毒表达的进一步转基因，以分析病毒宿主的相互作用和治疗效果。

这些技术的发展为生物治疗领域的研究人员探索许多肿瘤实体中局部表达免疫调节剂的作用铺平了道路;在体外、体内和临床试验中。