Name: 肿瘤靶向免疫调节副病毒的设计与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习利用逆转录遗传系统构建表达双特异性T细胞衔接器的溶瘤麻疹病毒载体，用于肿瘤靶向免疫调节。该方法通过可视化合胞体形成优化病毒收获时机，为癌症免疫治疗提供可适应多种肿瘤免疫特征的多功能平台。

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这些方法由教授博士领导的病毒治疗研究组建立&#160;博士 感谢海德堡国家肿瘤疾病中心的Guy Ungerechts。我们向他以及实验室团队的所有成员致以诚挚谢意，特别是Tobias Speck博士、Rūta Veinalde博士、Judith Förster、Birgit Hoyler和Jessica Albert。本研究由Else Kröner-Fresenius基金会（资助号：2015_A78，授予C.E. Engeland）和德国国家科学基金会（DFG，资助号：EN 1119/2-1，授予C.E. Engeland）提供支持。J.P.W. Heidbuechel获得海德堡国际癌症研究研究生院的奖学金资助。

C.E. Engeland 被列为海德堡大学拥有的关于用于癌症免疫病毒治疗的RNA病毒的一项专利的共同发明人。J.P.W. Heidbuechel 无任何利益冲突需要披露。

溶瘤免疫疗法（即., 联合免疫调节的溶瘤病毒治疗（OVT）在癌症治疗中具有广阔前景，亟需进一步开发和优化编码免疫调节蛋白的溶瘤病毒。本方案描述了构建和验证此类载体的方法，以用于后续相关临床前模型中的测试，并为未来转化为新型抗癌治疗手段奠定基础。
多种具有不同优势的溶瘤病毒平台可供选择63除了肿瘤特异性、载体安全性、生产要求、裂解肿瘤细胞的效力以及诱导免疫应答的能力外，克隆容量也是利用特定溶瘤病毒实现免疫调节剂有效递送的关键因素。目前尚缺乏对不同溶瘤病毒的直接比较，而开展此类比较有助于为个体患者确定最佳治疗方案。通过推动新型携带转基因载体的合理设计与测试，可促进这一目标的实现，麻疹病毒-BTE（MV-BTE）即为本文示例。鉴于麻疹病毒（MV）所具备的有利特性（即, 肿瘤趋向性、安全性、融合性、免疫原性、基因修饰的可行性）本方案聚焦于该溶瘤病毒载体，但可推广至其他溶瘤病毒（OV），尤其是副黏病毒科病毒。
为了合理选择潜在相关的免疫调节剂作为候选转基...

溶瘤病毒（OVs）正在被开发为一种抗癌治疗药物，能够特异性地在肿瘤细胞内复制并将其杀死，同时保持正常组织完整。目前普遍认为，溶瘤病毒治疗（OVT）在大多数情况下并不完全依赖病毒高效复制和扩散所导致的彻底肿瘤溶解来实现疗效，而是需要其他作用机制共同参与才能取得治疗成功，包括对血管和基质的靶向作用，尤其是对免疫系统的激活1,2,3,4。尽管许多早期的OV研究使用的是&#160;未经修饰的病毒，当前的研究已受益于对病毒生物学更深入的理解、可能含有新型溶瘤病毒的病毒资源库，以及基因工程技术所提供的可能性，从而构建出更先进的溶瘤病毒平台5,6,7。
鉴于免疫疗法的近期成功，免疫调节性转基因在溶瘤病毒的基因工程中备受关注. 通过溶瘤病毒（OV）感染的肿瘤细胞靶向表达此类基因产物，相较于全身给药可降低毒性。靶向性可通过使用具有内在肿瘤选择性的病毒，或通过改造病毒的嗜性来实现。8局部免疫调节可增强溶瘤病毒治疗（OVT）的多层面抗肿瘤机制。此外，该策略有助于深入探究病毒、肿瘤细胞与宿主免疫系统之间的相互作用。为此，本实验方案提供了一套可行且可调整的工作流程，用于设计、克隆、拯救、扩增及验证携带特定外源基因的溶瘤副黏病毒（特别是麻疹病毒）载体。
通过多种转基因产物可实现对免疫反应的调控，这些产物靶向癌症-免疫循环9的不同环节，包括增强肿瘤抗原识别［例如肿瘤相关抗原（TAAs）或主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的诱导剂］，促进树突状细胞成熟以实现有效的抗原呈递（细胞因子）；募集并激活特定免疫细胞，如细胞毒性T细胞和辅助性T细胞［趋化因子、双特异性T细胞衔接分子（BTEs）］；靶向抑制性细胞，如调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞（抗体、BTEs、细胞因子）；以及防止效应细胞的抑制和耗竭（检查点抑制剂）。因此，已有大量生物制剂可供选择。为提升&#160;癌症治疗效果，有必要评估此类病毒编码的免疫调节剂的治疗功效及潜在协同作用，并深入理解其相应的作用机制。
副黏病毒科（Paramyxoviridae）的负链单股RNA病毒具有多个有利于其作为溶瘤载体使用的特征，包括天然的嗜瘤性、可容纳较大外源基因的基因组容量（超过5 kb）10,11、高效的扩散能力（包括合胞体形成）以及强免疫原性12。因此，已开发出基于犬瘟热病毒13、腮腺炎病毒14、新城疫病毒15、仙台病毒16,17、猴病毒5型18和树鼩副黏病毒19的溶瘤病毒（OV）平台。其中，减毒活麻疹病毒疫苗株（MV）在临床前和临床研究中进展最为显著20,21。这些病毒株已被用于常规免疫接种数十年，具有极佳的安全记录22。此外，由于副黏病毒在细胞质中严格复制，不存在插入突变的风险。目前已建立基于反向基因组cDNA的多功能反向遗传学系统，可将外源基因插入额外的转录单元（ATUs）11,23,24。编码钠碘同向转运体（MV-NIS）用于成像和放射治疗，或编码可溶性癌胚抗原（MV-CEA）作为病毒基因表达替代标志物的MV载体，目前正在多项临床试验中进行评估（NCT02962167、NCT02068794、NCT02192775、NCT01846091、NCT02364713、NCT00450814、NCT02700230、NCT03456908、NCT00408590 和 NCT00408590）。既往研究已证实其安全性，并报道了抗肿瘤疗效的案例25,26,27,28,29,30（由Msaouel等综述31），为更多新型溶瘤麻疹病毒的临床前研发与测试奠定了基础。编码靶向癌症-免疫循环不同环节免疫调节分子的MV在小鼠模型中显示出延缓肿瘤生长和/或延长生存期的效果，并在同源小鼠模型中证实其疗效依赖于免疫机制，且可诱导长期保护性免疫记忆。载体编码的外源基因包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）32,33、H. pylori中性粒细胞活化蛋白34、免疫检查点抑制剂35、白细胞介素-12（IL-12）36、肿瘤相关抗原（TAAs）37以及双特异性T细胞衔接分子（BTEs）38，后者可将肿瘤表面抗原与CD3交联，从而不依赖T细胞受体特异性和共刺激信号，激活多克隆T细胞产生抗肿瘤效应（图1）。这些构建体所获得的令人鼓舞的临床前结果，亟需进一步的转化研究推进。
Talimogene laherparepvec（T-VEC）是一种编码GM-CSF的I型单纯疱疹病毒，是目前唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的溶瘤治疗药物。2015年底获批所依据的III期研究不仅证明了其在肿瘤内注射部位的疗效，而且还&#160;晚期黑色素瘤中的远隔效应（即未注射部位病灶的缓解）39。T-VEC 随后进入了针对其他肿瘤类型的更多临床试验（例如, 非黑色素瘤皮肤癌，NCT03458117；胰腺癌，NCT03086642）以及联合疗法的评估，尤其是与免疫检查点抑制剂联用（NCT02978625、NCT03256344、NCT02509507、NCT02263508、NCT02965716、NCT02626000、NCT03069378、NCT01740297，以及Ribas e等。40).
这不仅展示了溶瘤免疫治疗的潜力，也凸显了进一步研究以确定溶瘤病毒治疗（OVT）与免疫调节更优组合的必要性。合理设计新型病毒载体并推动其进入临床前测试，是实现这一目标的关键。这还将加深对潜在作用机制的理解，并对推进个体化癌症治疗具有重要意义。为此，本文介绍了副黏病毒的改造与开发方法，用于靶向性癌症免疫治疗，特别是编码T细胞结合抗体的溶瘤麻疹病毒的构建方法（图2）。

<table><tbody><tr><td>快速DNA去磷酸化 &amp;连接试剂盒</td><td>罗氏生命科学，德国曼海姆</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR 克隆试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技，圣莱昂-罗特</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN，德国希尔登</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta 感受态细胞 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>德国美因河畔法兰克福新英格兰生物实验室（New England Biolabs, NEB）</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Lennox改良的LB培养基</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 质粒小提试剂盒</td><td>QIAGEN，德国希尔登</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 HindIII-HF</td><td>德国美因河畔法兰克福新英格兰生物实验室（New England Biolabs, NEB）</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen，德国达姆施塔特</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>法国博桑生物塞尔公司</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega，曼海姆，德国</td><td>E2311</td><td>可替换为任意选择的转染试剂</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46 / B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel，海德堡德国癌症研究中心</td><td></td><td>可根据要求提供</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>德国不伦瑞克，德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM（无血清培养基）</td><td>Gibco Life Technologies，德国达姆施塔特</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>比色法细胞活力检测试剂盒 III（XTT）</td><td>PromoKine，德国海德堡</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>包含 XTT 试剂</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco Life Technologies，德国达姆施塔特</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Ni-NTA 离心柱</td><td>QIAGEN，德国希尔登</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10&amp;nbsp;kDa</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>默克密理博</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>人血清中的IgG</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>抗HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-092-257</td><td>RRID: AB_871939</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1，κ 同种型对照，藻红蛋白偶联，克隆 MOPC-21 抗体</td><td>BD 生物科学公司，德国海德堡</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>抗HA-生物素抗体，克隆3F10</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>12158167001</td><td>RRID: AB_390915</td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS色谱柱</td><td>Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>RIPA缓冲液</td><td>Rockland Immunochemicals，吉尔伯茨维尔，宾夕法尼亚州，美国</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒</td><td>Promega，曼海姆，德国</td><td>G1780</td><td>包含10倍裂解液、底物溶液（底物混合液和检测缓冲液）以及终止液</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>康宁，雷诺萨，墨西哥</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>美国纽约州奥嫩塔康宁公司</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Greiner Bio-One，德国弗里克豪森</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，U型底</td><td>TPP，瑞士特拉辛根</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，平底</td><td>Neolab，德国海德堡</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Neolab，德国海德堡</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Neolab，德国海德堡</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>nerbe plus，德国吕内堡</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>T175 细胞培养瓶</td><td>赛默飞世尔科技，圣莱昂-罗特</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

成功的癌症免疫治疗有望实现对肿瘤的长期控制。尽管近期在临床上取得了一些成功，但仍迫切需要针对个体肿瘤免疫特征而定制的安全且有效的治疗方法。溶瘤病毒能够诱导抗肿瘤免疫反应，并实现肿瘤特异性基因表达。本实验方案描述了免疫调节型溶瘤病毒载体的构建及其体外分析方法。以编码双特异性T细胞衔接分子的麻疹疫苗病毒为例，该通用技术流程可适用于其他病毒种类及外源基因。所介绍的工作流程包括重组病毒的设计、克隆、拯救和扩增。同时包含用于分析载体复制动力学、裂解活性以及分离出的免疫调节分子在体外功能性的检测方法，从而有助于新型治疗剂的开发，并推动其在临床前模型中的进一步研究及最终的临床转化。

图1 展示了编码双特异性T细胞衔接分子的溶瘤麻疹病毒的作用机制。本实验方案的工作流程图见图2。 图3 显示了一个修饰后的溶瘤麻疹病毒基因组示例，直观呈现了对麻疹病毒反向基因组所做的特定修改以及插入的转基因的特定特征。图4 展示了典型的麻疹病毒诱导的合胞体。请注意，在收获病毒拯救物的时间点具有较高的细胞密度（A，B），表明在重复实验时可适当减少细胞数量。可在Vero细胞传代过程中优化孵育温度和时间（C，D），以促进合胞体在培养板上的扩散。图5 显示了一次典型的滴定实验结果。图6 展示了接种未修饰麻疹病毒（MV）和编码BTE的溶瘤麻疹病毒（MV-H-mCD3xhCD20）后的单步生长曲线（...

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。

成功的癌症免疫治疗有望实现对肿瘤的长期控制。尽管近期在临床上取得了一定成功，但仍迫切需要……

该方法可通过促进溶瘤病毒载体的开发以实现靶向免疫调节，从而有助于解决癌症免疫治疗领域中的关键挑战。所采用的反向遗传系统的主要优势在于其多功能性，因此可对载体进行改造，以应对不同的研究问题，并靶向具有不同免疫特征的肿瘤。病毒扩增步骤，特别是确定收获病毒的最佳时间点，仅通过文字方案难以掌握，因为合胞体的形成需要随时间进行视觉评估。首先，按照文中所述设计并克隆重组免疫调节载体。本方案详细描述了编码双特异性T细胞衔接分子的溶瘤性麻疹疫苗载体的构建步骤。为从cDNA中拯救麻疹病毒，转染前24小时将麻疹病毒生产细胞均匀接种于6孔板中。将200,000个细胞接种于2毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，每孔接种量为200,000个细胞，以确保转染时细胞融合度达到65%至75%。将5微克编码麻疹病毒抗原组的重组DNA与适当的质粒及荧光报告基因混合，总体积为200微升DMEM培养基。向混合物中加入 18.6 µL 脂质体转染试剂，并立即轻轻弹动离心管以混匀。将该转染混合物在室温下孵育 25 分钟。转染 MV 生产细胞时，从生长至 65% 至 75% 汇合度的 6 孔板中移除培养基，每孔加入 1.8 mL 含 2% FBS 和 50 µg/mL 卡那霉素的 DMEM 培养基。然后将转染混合物逐滴加入每孔中，并轻轻摇晃混匀。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，用2毫升含2%胎牛血清和50微克/毫升卡那霉素的新鲜DMEM培养基替换原培养基，当培养基因变酸而呈现黄色时，重复更换一次。每天使用显微镜观察细胞的报告基因表达及合胞体形成情况。当出现由20个或更多细胞组成的大型合胞体，或细胞密度过高时，收获病毒。预计收获前24小时，在10厘米培养皿中，将约150万个MV生产细胞接种于12毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，使病毒接种时细胞融合度达到65%至75%。为收集病毒子代，使用细胞刮刀小心地将转染细胞的6孔板中的贴壁生产细胞刮下。将含有刮下细胞的培养基转移至离心管中。在4摄氏度条件下，以至少2500 ×g离心5分钟，以去除细胞碎片。离心后，将无细胞上清液与无血清培养基混合，终体积为4毫升，以制备接种物。吸去10厘米培养皿中MV生产细胞的培养基，加入接种物。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少2小时。孵育后，加入6毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，细胞继续孵育过夜。随后更换为12毫升新鲜的含10% FBS的DMEM培养基，在37°C和5%二氧化碳条件下继续孵育直至收获。每天至少观察细胞两次。在合胞体破裂且膜损伤变得可见之前收获病毒。收获第一代病毒时，先移除培养板中的上清液，然后加入600 µL无血清培养基。接着使用细胞刮刀刮取细胞，并转移至洁净离心管中。随后立即用液氮速冻病毒悬液，并在零下80摄氏度保存至少24小时，以确保完全冻结。使用96孔板，每份样品设八个复孔，测定病毒储备液的滴度。首先将来自T75细胞培养瓶的生产细胞收集至50毫升锥形管中。计数细胞，并用含10%胎牛血清的DMEM将细胞悬液调整至每毫升150,000个细胞。在96孔板的每个孔中加入90微升含10%胎牛血清的DMEM。然后从病毒原液的一个等分试样中取10微升，加入到该板第一列的全部8个孔中。通过上下吹吸至少10次充分混匀。使用多通道移液器将每孔10微升从第一列转移至第二列，并通过上下吹吸充分混匀。对每一列重复此操作，每次稀释步骤均使用新的移液器吸头，以获得病毒的连续10倍稀释液。弃去最后一列每孔中的10微升液体。向每孔中加入100微升细胞悬液（每毫升含150,000个细胞），确保无细胞团块。于37°C、5%二氧化碳条件下培养48小时。使用光学显微镜检查合胞体。对含有可见合胞体的最高稀释倍数列的每孔中的合胞体进行计数。对于编码荧光报告蛋白的病毒，可使用荧光显微镜对合胞体进行计数。为分析麻疹病毒复制动力学，在感染前一天，将100,000个Vero细胞以每孔1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基接种于12孔板中，每个感兴趣的时间点至少设置2个孔。为感染细胞，将培养基更换为含有相应剂量病毒的300微升无血清培养基。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育至少2小时。去除接种物，加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，继续培养。在感染后的相应时间点，通过直接将细胞刮入培养基中收集病毒子代。将每个孔中的内容物转移至单独的离心管中。在液氮中快速冷冻，并在负80摄氏度下保存，直至进行滴定，随后按照文稿中所述步骤进行。为开始评估BTE诱导的由LDH释放所介导的细胞毒性，首先按照文稿中所述方法分离病毒感染靶细胞所表达的分泌型转基因产物，并分离免疫效应细胞。然后将靶细胞接种于U型底96孔板中，并按照文稿中所述加入样品。将先前分离的免疫调节剂以所需浓度加入相应的样品中。以所需比例加入免疫效应细胞，并加入培养基至每孔总体积为100微升。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，按照先前确定的所需时间孵育。在样品采集前45分钟，向含有T-max样品的孔以及相应的培养基对照孔中加入10微升10X裂解液，并继续孵育。以250 × g离心4分钟。将每孔上清液50微升转移至平底96孔板的孔中，注意勿转移细胞。按照生产商说明配制底物溶液后，向每孔加入50 µL。室温避光孵育30分钟，或直至T-max样品变为深红色。孵育结束后，向每孔加入50 µL终止液。在4000 × g下离心1分钟，然后使用中空针头去除气泡。在490纳米处测量光吸收度，并按照文稿中所述进行计算。用未修饰的和编码BTE的溶瘤性麻疹病毒接种后，比较的载体在Vero细胞上的生长曲线相似。在接种后，稳定表达人源癌胚抗原及MV受体CD46的MC38小鼠结肠直肠癌细胞的细胞活力曲线显示，该转基因编码病毒在小鼠肿瘤细胞系中的裂解活性滞后。将表达靶抗原的细胞与BTE孵育，在五种不同稀释度下通过流式细胞术检测，结果显示细胞对BTE的结合呈浓度依赖性。在磁珠拉下实验后进行免疫印迹分析，结果显示：当使用非靶向BTE时，未检测到细胞；而使用靶向BTE样本时，洗脱组分中存在结合的细胞。通过代表性的LDH释放实验表明，BTE介导的小鼠T细胞对靶抗原具有特异性和浓度依赖性的细胞毒性，在本示例中，与对照细胞相比，在相对较高的BTE浓度（1微克/毫升）下实现了15%的特异性细胞杀伤。在进行该实验操作时，重要的是需定期监测细胞，以检查感染进展情况。请注意，尽管重组麻疹疫苗株是减毒的，但仍可能对免疫抑制个体构成危害。通过遵循适当的生物安全操作规程来避免暴露。操作病毒的人员应在进行这些方法前完成疫苗接种。通过遵循本方案，可实现病毒对其他转基因的表达，从而分析病毒与宿主的相互作用及治疗效果。这些技术的发展为生物治疗领域的研究人员探索局部表达的免疫调节剂在多种肿瘤实体中的作用铺平了道路，无论是在体外、体内，还是在临床试验中。

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