Name: 人骨髓间充质干细胞细胞外微 rna 的分离、测序和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习从人骨髓间充质干细胞培养基中纯化细胞外微RNA并进行小RNA文库构建与测序的完整实验流程。该方法包含关键质量控制步骤，适用于低起始量样本处理。

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我们感谢 iNANO 的 Claus Bus 先生和 Rita Rosendahl 女士提供的技术协助。特别感谢 Daniel Otzen 博士允许我们频繁使用他的超速离心机。本研究由丹麦创新基金（MUSTER 项目）资助。

注意：间充质干细胞生长培养基（MSC 培养基）需按照材料表中的说明预先配制。
1. 细胞培养
注意：人源间充质干细胞可从骨髓、脂肪组织或其他来源获得11。此外，也可通过供应商购买人源间充质干细胞。本实验方案中使用的骨髓间充质干细胞来源于患者骨髓，由公司提供。
<ol>
	<li>解冻 1 x 106 将BMSCs接种至含有20 mL MSC培养基的T175培养瓶中。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。2 每2-3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。</li>
	<li>用 5 mL 1×PBS 洗涤细胞，弃去 PBS。</li>
	<li>加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以消化细胞。轻拍培养瓶侧面以促进细胞脱落。</li>
	<li>加入15 mL MSC培养基以灭活胰蛋白酶，使细胞从培养表面脱落，并通过上下吹打获得单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞收集至50 mL离心管中，在300 x g条件下离心5分钟 g 离心收集细胞。</li>
	<li>用1 mL MSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：T175 培养瓶中人原代骨髓间充质干细胞在 80% 汇合度时数量约为 2 × 10⁶6 细胞</li>
	<li>以2,000个细胞/cm²的密度接种hMSCs2 在5个T175培养瓶中加入新鲜的MSC培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 每2-3天更换一次培养基，直至获得5个达到90%汇合度的T175培养瓶。</li>
</ol>
2. 外泌体及RNA相关生物分子的收集
注意：EV 收集培养基需预先配制（含 10% 胎牛血清 [FBS] 和 1% 青霉素/链霉素 [P/S] 的杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM]）。EV 收集培养基即为常规的 MSC 培养基，但需使用商品化的 EV 去除型 FBS 配制（材料表）。目的是避免来自 FBS 的牛源外泌体 RNA（exRNA）污染，因为普通 FBS 通常含有与 EVs、核糖核蛋白复合物及脂蛋白相关的 exRNA。进行小 RNA 文库构建时，需收集 5 个汇合度达到 100% 的 MSC 培养瓶所分泌的 exRNA，方可进行文库制备。
<ol>
	<li>每瓶 T175 培养瓶用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 3 次。每瓶汇合度达到 100% 的 MSCs T175 培养瓶中加入 20 mL 外泌体收集培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。</li>
	<li>收集培养基，于 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>收集上清液，于 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>收集上清液，于 4 °C 条件下以 15,500 × g 离心 30 分钟，然后收集上清液。</li>
	<li>将上清液转移至超速离心管中，于 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 90 分钟以沉淀外泌体 RNA（exRNA）。此处使用固定角转子，沉淀将附着于管壁一侧。标记管盖的一侧，并在管壁上画圆圈标示预期沉淀位置。</li>
	<li>弃去上清液，将离心管倒置在吸水纸上干燥内壁，并用小片吸水纸小心吸除管内残留液体，避免接触管底。加入 200 μL PBS，通过涡旋振荡 30 秒并上下吹打 20 次重悬沉淀。</li>
	<li>使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对外泌体（EVs）和生物分子进行表征（图 2）。 
	注意：外泌体和生物分子可通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）或透射电子显微镜（TEM）进行检测12。</li>
	<li>将外泌体和生物分子储存于 -80 °C，直至后续实验使用。 
	注意：若外泌体将用于功能研究，需添加 20% 甘油以防止其破裂。如有需要，可按照标准操作流程收集细胞。</li>
</ol>
3. 分化细胞的细胞外囊泡及RNA相关生物分子的收集
注意：在细胞进行分化的过程中，也可以从细胞培养基中收集细胞外囊泡（EVs）及与RNA相关的生物分子。本方案中描述的示例为成骨细胞分化，以及在分化第0天和第7天收集外泌体RNA（exRNA）。如果无需进行分化，则跳过第3节，直接进入第4节。
<ol>
	<li>每次均需新鲜配制成骨分化培养基（含10% FBS、1% P/S、10 mM β-甘油磷酸钠、10 nM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸-2-磷酸盐和10 mM 1.25-维生素-D3的DMEM培养基）。</li>
	<li>当MSCs达到80%融合度时，将MSC培养基更换为成骨分化培养基。</li>
	<li>每2–3天更换一次成骨分化培养基。</li>
	<li>在分化第5天，弃去培养基，并用每瓶T175培养瓶20 mL PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>向每瓶融合的MSCs T175培养瓶中加入20 mL含有10 mM β-甘油磷酸钠、10 nM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸-2-磷酸盐和10 mM 1.25-维生素-D3的EV收集培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时，以在收集EVs和生物分子的同时维持分化过程。</li>
	<li>在第7天收集培养基，并按照步骤2.2–2.6所述方法分离EVs和生物分子。</li>
	<li>为进行质量控制，将细胞接种于96孔板或6孔板中，分别通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测或定量聚合酶链式反应（qPCR）评估分化情况。 
	注意：图3为细胞成骨分化的示例。</li>
</ol>
4. RNA 提取与质量控制
<ol>
	<li>将步骤 2.8 的样品在冰上解冻。使用 RNA 提取试剂盒（材料表）提取 RNA。</li>
	<li>用 RNA 提取试剂盒（材料表）提供的离心柱，以 100 μL 无 RNase 水洗脱 RNA。</li>
	<li>通过乙醇沉淀浓缩 RNA：向 100 μL 纯化的 RNA 中加入 1 μL 糖原、10 μL 2 M pH 5.5 醋酸钠和 250 μL 预冷的 99% 乙醇。</li>
	<li>将样品在 -20 °C 下孵育过夜以沉淀 RNA。在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 20 分钟，收集 RNA 沉淀。 
	注意：由于与糖原共沉淀，沉淀呈白色。</li>
	<li>吸除上清液，并用 1 mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。再次在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟，收集 RNA 沉淀。</li>
	<li>去除乙醇，打开 RNA 管盖，室温放置 5–10 分钟，使 RNA 沉淀空气干燥。将 RNA 沉淀重悬于 7 μL 无 RNase 水中。</li>
	<li>在建库前，使用基于芯片的毛细管电泳仪，按照制造商的说明检测 RNA 的质量和浓度。 
	注意：RNA 的代表性片段分布见图 4。</li>
	<li>如有需要，使用商业化的纯化试剂盒提取细胞 RNA（材料表）。</li>
</ol>
5. 文库构建与质量控制
注意：由于RNA投入量较低，小RNA文库使用商用试剂盒（材料表）进行构建，并进行了相应调整。文库构建过程在预冷的冰块上进行。
<ol>
	<li>将用于0.2 mL PCR管的加热块置于冰上预冷，然后用移液器将步骤4.6中的5 μL RNA加入放置在预冷金属块上的无RNase的0.2 mL PCR管中。</li>
	<li>在0.2 mL无RNase的PCR管中，用无RNase水将3’接头稀释10倍。加入0.5 μL稀释后的接头，通过上下吹打8次与5 μL RNA混合，并短暂离心，使所有液体聚集于管底。</li>
	<li>将RNA与3’接头混合物置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟，随后将样品放回预冷金属块上。</li>
	<li>向RNA与3’接头的混合物中加入1 μL连接缓冲液、0.5 μL RNase抑制剂和0.5 μL T4 RNA连接酶（缺失突变体）。通过上下吹打8次混匀，并短暂离心。</li>
	<li>将PCR管置于预热的PCR仪中，在28 °C孵育1小时。</li>
	<li>保持PCR管仍在PCR仪中，向样品管中加入0.5 μL终止液，通过上下吹打8次混匀，继续在28 °C孵育15分钟。</li>
	<li>在0.2 mL无RNase的PCR管中，用无RNase水将5’接头稀释10倍。取0.5 μL 5’接头加入另一支无RNase的0.2 mL PCR管中，将5’接头在预热的PCR仪中70 °C加热2分钟，随后将样品置于预冷金属块上。</li>
	<li>向5’接头管中加入0.5 μL 10 nM ATP和0.5 μL T4 RNA连接酶，通过上下吹打8次混匀，并短暂离心，使所有液体沉至管底。 
	注意：应尽可能将5’接头保持在预冷金属块上。</li>
	<li>向步骤5.6所得样品中加入1.5 μL 5’接头混合物，缓慢上下吹打8次以轻柔混匀。将样品在预热的PCR仪中28 °C孵育1小时。</li>
	<li>在无RNase的0.2 mL PCR管中，用无RNase水将逆转录（RT）引物稀释10倍。向步骤5.9所得样品中加入0.5 μL稀释后的RT引物，缓慢上下吹打8次以轻柔混匀，并短暂离心。</li>
	<li>将样品置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟，随后将样品放回预冷金属块上。</li>
	<li>向样品中加入1 μL 5×第一链缓冲液、0.5 μL 12.5 mM dNTP混合物、0.5 μL 100 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.5 μL RNase抑制剂和0.5 μL逆转录酶。缓慢上下吹打8次以轻柔混匀，并短暂离心。</li>
	<li>将样品置于预热的PCR仪中，在50 °C孵育1小时，以获得cDNA。</li>
	<li>向cDNA中加入4.25 μL超纯水、12.5 μL PCR混合液、1 μL index引物和1 μL通用引物。通过上下吹打8次混匀，并短暂离心。</li>
	<li>将样品放入PCR仪，并设置程序如下：98 °C预变性30秒；进行15个循环（98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸15秒）；最后72 °C延伸10分钟。 
	注意：构建好的文库可在-20 °C保存一周。</li>
	<li>通过DNA凝胶电泳分离文库，在140 bp至160 bp区间切胶（胶回收），并按照文库构建试剂盒提供的方案从凝胶中洗脱文库。 
	注意：本研究中，将步骤5.15所得文库加载至商用凝胶（材料表），并根据制造商说明书，使用自动化DNA片段分选仪（材料表）纯化140 bp至160 bp范围内的文库。</li>
	<li>使用基于离心柱的PCR纯化试剂盒（材料表）对步骤5.16所得文库进行浓缩和洗涤，最终用10 μL无RNase水洗脱文库。</li>
	<li>取1 μL纯化后的文库上样至DNA芯片（材料表），按照制造商说明书检测文库大小。</li>
	<li>将1 μL纯化文库用含0.05%吐温20的10 mM pH 8.0 Tris-HCl缓冲液稀释1000倍，使用商用文库定量试剂盒通过qPCR定量文库浓度，并以试剂盒中的DNA标准品进行校准。</li>
	<li>根据测序仪的要求，等量混合各文库，并在高通量测序系统上进行测序。 
	注意：细胞RNA文库的构建可使用相同试剂盒，按照试剂盒的标准操作流程完成。</li>
</ol>
6. 生物信息学分析流程
注意：这是一个内部流程，此处使用的程序列在材料表中。
<ol>
	<li>去除原始序列中的低质量读段，并移除接头序列。</li>
	<li>将清洁后的读段比对至不同类型的 RNA。
	<ol>
		<li>通过允许两个错配来注释 tRNA，因为高度修饰的 tRNA 序列会导致逆转录酶频繁发生碱基错掺。</li>
		<li>通过将序列比对至 miRBase v21 中的人类 miRNA 并允许零个错配来注释 miRNA。由于 miRNA 可能发生非模板指导的 3'端 A 和 U 添加，对于未能比对上的序列，将其 3'端最多截去三个 A 或 T 核苷酸后，再次比对至 miRBase v21 中的人类及其他物种 miRNA，允许零个错配。</li>
		<li>通过允许一个错配，将序列注释至其他相关的小 RNA（snRNA、snoRNA、piRNA 和 Y RNA）。</li>
		<li>将剩余未比对上的读段比对至长 RNA 数据集（rRNA、Rfam 中的其他 RNA 以及 mRNA），以评估降解情况。</li>
		<li>将序列注释至人类基因组。</li>
		<li>将序列注释至细菌基因组。</li>
		<li>使用以下公式对 miRNA 表达量进行标准化：(miRNA 计数 / 所有比对到 miRNA 的总读段数) × 106。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于外泌体RNA（exRNA）下一代测序的实验方案，可实现对低起始量样本进行差异表达分析。遵循特定的细胞外囊泡（EV）和exRNA分离流程至关重要，因为即使微小的改动（例如超速离心步骤或转子类型的改变）也可能影响转录组和miRNA的水平13,14。因此，无论采用何种方法分离exRNA，在同一项实验中，所有样本均应采用相同的实验操作和生物信息学分析流程，以确保结果具有可比性。
RNA 完整性通常通过生物分析仪进行评估。然而，由于细胞外RNA（exRNA）不含全长的rRNA，其RIN值通常很低，但这并不一定反映RNA样本的质量低下。此外，exRNA的RNA浓度差异较大，且常常不准确。因此，无需通过生物分析仪评估RNA质量或进行RNA定量，而应在每次实验中使用相同体积的培养基进行后续处理。同时，将提取的RNA重悬于相同体积的重悬缓冲液中，并在建库时使用相同体积的RNA溶液。
通过将接头用量减少至标准方案...

细胞外和循环RNA（exRNA）存在于多种体液中，并对RNase具有抗性1,2。由于其丰度高、稳定性好且易于获取，exRNA在临床评估中作为诊断和预后标志物具有重要价值3。exRNA的运输方式包括通过细胞外囊泡（EVs）、与脂蛋白（如高密度脂蛋白；HDL）结合以及与核糖核蛋白复合物（如Argonaute2复合物）结合4。
一部分外泌RNA（exRNA）为微小RNA（miRNA），这类小分子非编码RNA长约22个核苷酸，可调控转录后基因表达。外泌miRNA（ex-miRNA）已被证实参与细胞间的通讯以及细胞稳态的调控5。例如，高密度脂蛋白（HDL）可将外泌miR-223递送至内皮细胞，从而抑制细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达及炎症反应6。有趣的是，miR-223也可通过细胞外囊泡从白细胞转运至肺癌细胞，促使后者获得更强的侵袭性表型7。因此，对来自各种体液及细胞培养基中外泌miRNA转录组的研究将极大促进我们对外泌miRNA信号传导机制的理解。
小RNA测序（small RNA seq）是一种强大的工具，可用于研究小RNA的转录组学。该技术不仅可用于比较不同样本中已知RNA的差异表达，还可用于检测和表征新发现的小RNA。因此，它也是一种在不同条件下鉴定差异表达miRNA的可靠方法。然而，小RNA测序面临的一个难题是从外泌RNA输入量较低的体液（如脑脊液、唾液、尿液、乳汁、血清和培养基）中构建小RNA测序文库。Illumina公司的TruSeq Small RNA Library Prep方案要求约1 µg高质量的总RNA，而New England Biolabs公司的NEBNext Small RNA Library Prep Set方案则需要100 ng至1 µg的RNA8,9。通常情况下，这些样本中的总RNA含量低于常规紫外-可见光分光光度计的检测限。
来自体液的外泌体miRNA（ex-miRNA）可能是良好的预后和诊断标志物。然而，为了研究其功能作用或确定特定ex-miRNA的来源，通常会使用细胞培养系统。间充质干细胞（MSCs）已被广泛研究，因为其细胞外囊泡（EVs）已被证实可缓解多种疾病，包括心肌梗死、阿尔茨海默病和移植物抗宿主病10。本文中，我们展示了从骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）中纯化ex-miRNA的方法，以及优化小RNA文库构建、测序和数据分析的具体步骤（图1）。

<table><tbody><tr><td>骨髓来源的间充质干细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-012</td><td>本方案中使用的细胞购自 ATCC</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>称为间充质干细胞生长培养基（MSC培养基）</td></tr><tr><td>无外泌体胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>exRNA收集培养基：MSCGM，但将其中的FBS替换为无外泌体FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>833,912</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带盖组件的聚碳酸酯瓶</td><td>贝克曼库尔特</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td><td></td><td></td><td>此处使用的转子</td></tr><tr><td>NucleoCounter</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Calbiochem</td><td>35675</td><td>成骨分化培养基的组分</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td>成骨分化培养基的组分</td></tr><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸&amp;nbsp;三钠盐酸</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>成骨分化培养基的组分</td></tr><tr><td>1&amp;alpha;,25-二羟基维生素&amp;nbsp;D3</td><td>Sigma</td><td>D1530-1MG</td><td>成骨分化培养基的组分</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>用于步骤 4.8 的 miRNA 和总 RNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-1514</td><td>基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片</td></tr><tr><td>安捷伦 2100 生物分析仪</td><td>安捷伦科技</td><td>G2939BA</td><td>基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片</td></tr><tr><td>安捷伦高灵敏度DNA试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-4626</td><td>基于芯片的毛细管电泳仪及用于RNA和DNA分析的芯片</td></tr><tr><td>KAPA文库定量试剂盒</td><td>罗氏</td><td>KK4824</td><td>此处使用的文库定量试剂盒</td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA 文库制备试剂盒 - A组（24次反应）（A组：index 1-12）</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td>本方案中使用的小RNA文库制备试剂盒——用于步骤5</td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td>本方案中使用的自动DNA凝胶提取仪；也可进行手动提取</td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>步骤5.17中的PCR纯化</td></tr><tr><td>FASTX_Toolkit</td><td>冷泉港实验室</td><td></td><td>第6步中修剪低质量读段</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td></td><td></td><td>第6步中的接头去除</td></tr><tr><td>Bowtie</td><td></td><td></td><td>步骤6中干净读段的比对</td></tr><tr><td>Samtools</td><td></td><td></td><td>在第6步中构建表达谱</td></tr><tr><td>Bedtools</td><td></td><td></td><td>在第6步中建立表达谱</td></tr></tbody></table>

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小rna

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

细胞外和循环RNA（exRNA）由机体多种细胞类型产生，存在于唾液、血浆、血清、乳汁和尿液等多种体液中。其中一类RNA是转录后调控因子——微小RNA（miRNA）。为了明确特定细胞类型所产生的miRNA，可利用体外培养系统来收集并分析来源于特定细胞亚群的exRNA。间充质干细胞分泌的因子被认为在缓解多种疾病中发挥重要作用，因此本文将其作为体外模型系统。本文描述了从培养基中收集样本、小RNA纯化及文库构建以测序分析细胞外miRNA的完整流程。由于培养基中的exRNA属于RNA起始量较低的样本，因此需要优化实验步骤。本方案提供了从培养基中进行小exRNA测序的全面操作指南，并在exRNA纯化与测序的每一步骤中设置了质量控制检查点。

本方案中所述方法经过优化，用于从间充质干细胞（MSC）培养物中收集细胞外RNA（exRNA），以进行下一代测序。工作流程的整体示意图见左侧的图1，相应的质量控制检查点显示在右侧。
未分化（图3A）和分化后（图3B）细胞在收集当天的细胞形态如图所示。此外，还展示了诱导7天后细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的代表性归一化水平（图3C）。此处，ALP活性约为未诱导细胞的2.5倍。
三个T175培养瓶的汇合度为100%的MSC可获得2-5 × 10⁶个外泌体10 颗粒/mL（<stron...

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

细胞外和循环RNA（exRNA）由机体多种细胞类型产生，存在于唾液、血浆、血清等多种体液中，...

这是首篇针对从细胞外囊泡来源的小RNA测序技术问题的研究论文。NGS样本需要严格的制备和质量控制。由于EVs的特性，EV样本的质量控制流程与常规方法有所不同。本方案的优势在于为初次使用者设置了质量控制步骤。示范该操作的是我实验室的研究助理 Junyi Su。首先，在五个 T175 培养瓶中，用新鲜的 MSC 培养基以每平方厘米 2,000 个细胞的密度接种人源间充质干细胞。然后在37摄氏度、5%二氧化碳环境中培养细胞，每两到三天更换一次培养基，直至获得五个达到90%汇合度的细胞培养瓶。接着，每瓶用20毫升PBS洗涤细胞三次。每瓶中加入20毫升细胞外囊泡收集培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育48小时。收集培养基，于300 ×g、4摄氏度条件下离心10分钟。然后收集上清液，并将培养基于2,000 ×g、4摄氏度条件下离心20分钟。再次收集上清液，并将培养基在4°C条件下以15,500 ×g离心30分钟。最后一次收集上清液。接着，将培养基转移至超速离心管中。此处使用 60Ti 固定角转子，沉淀物将附着在离心管的侧壁。在瓶盖上标记沉淀物预期所在的一侧，并在离心管侧壁画一个圆圈标示沉淀物预期位置。在 100,000 g 和 4 °C 条件下离心 90 分钟，使外泌体 RNA 沉淀。最后一次离心后，弃去上清液。用小块吸水纸吸干管内壁，注意不要触碰到管底。然后将离心管倒置于吸水纸上。为重悬沉淀，向每根离心管中加入 200 µL PBS，涡旋振荡 30 秒。上下吹打 20 次。随后采用纳米颗粒追踪分析法检测细胞外囊泡及其他生物分子。将沉淀物保存在零下80摄氏度，直至进行后续实验。样品解冻后，使用RNA提取试剂盒，按照生产商的说明书提取RNA。用100微升无RNA酶的水从RNA提取试剂盒提供的柱子中洗脱RNA。为了通过乙醇沉淀浓缩RNA，向100微升纯化的RNA中加入1微升糖原、10微升2摩尔pH 5.5的醋酸钠以及250微升预冷的99%乙醇。然后将样品在-20摄氏度孵育过夜，以沉淀RNA。为收集RNA沉淀，于4摄氏度下以16,000 g离心20分钟。接下来，去除上清液，并用一毫升75%乙醇洗涤RNA沉淀。在16,000 g及4°C条件下再次离心五分钟，以沉淀RNA。去除乙醇后，将RNA管的管盖打开，静置五至十分钟，使RNA沉淀自然风干。将RNA沉淀重悬于7 µL无RNA酶的水中，并使用基于芯片的毛细管电泳仪检测RNA的质量和浓度。开始文库构建时，用移液器将5 µL RNA加入预冷的0.2 mL PCR管中。接着，用无RNA酶的水按1:10的体积比稀释3'接头。向RNA管中加入0.5 µL稀释后的接头，并用移液器轻轻吹打混合8次。短暂离心，使管壁所有液体聚集于管底。将RNA与接头的混合物置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟。然后将样品放回预冷的金属块上。接着，向RNA接头混合物中加入1微升连接缓冲液、0.5微升RNase抑制剂和0.5微升T4 RNA连接酶。轻轻吹打混匀8次，短暂离心。然后将离心管置于预热的PCR仪中，在28摄氏度下孵育1小时。接着，向样本管中加入0.5微升终止液，期间保持离心管位于PCR仪内。上下吹打8次，并继续在28摄氏度下孵育15分钟。将5'接头以1:10的体积比溶于无RNA酶的水中。取0.5微升稀释后的接头加入单独的0.2毫升PCR管中。将5'接头在70摄氏度加热2分钟。然后将样品置于预冷的金属块上。向5'接头管中加入0.5 µL的10 nmol ATP和0.5 µL的T4 RNA连接酶。用移液器轻轻吹打混匀8次。短暂离心以使所有液体聚集于管底。随后，向RNA样品中加入1.5 µL的5'接头混合物。轻轻吹打8次，于28 °C孵育1小时。为了获得 cDNA，将反转录引物用无 RNA 酶的水按 1:10 的体积比稀释。取 0.5 微升稀释后的引物加入 RNA 样品中，轻轻吹打混匀 8 次，短暂离心。然后将 RNA 与引物混合物置于预热的 PCR 仪中，在 70 摄氏度孵育 2 分钟。然后将样品置于预冷的冰块上。接着，向样品管中加入1微升5X第一链缓冲液、0.5微升12.5毫摩尔/升的dNTP混合物、0.5微升100毫摩尔/升的DTT、0.5微升RNA酶抑制剂以及0.5微升逆转录酶。轻轻吹打混匀8次。短暂离心。将样品置于预热的PCR仪中，在50摄氏度孵育1小时。随后，向cDNA样品中加入4.25 µL超纯水、12.5 µL PCR混合液、1 µL索引引物和1 µL通用引物。上下吹打8次，短暂离心。最后将样品放入PCR仪中，根据文稿设置PCR仪程序。为纯化RNA文库，使用自动化DNA片段分选仪回收140至160个碱基对之间的条带。使用基于层析柱的PCR纯化试剂盒对提取的文库进行纯化，并用10微升无RNA酶的水洗脱文库。为检测文库片段大小，取1微升纯化后的文库上样至DNA芯片，并按照制造商的操作说明进行检测。为定量文库浓度，首先将1微升纯化文库以1:1,000的体积比稀释于含0.05%吐温20的10毫摩尔、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。然后使用商用文库定量试剂盒中的DNA标准品进行qPCR。最后，根据测序仪的要求等量混合文库，并在高通量测序系统上进行测序。细胞外RNA的电泳图谱包含多种大小的RNA。相比之下，细胞RNA显示出非常明显的峰，对应于5S tRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。两个文库的最终质量均较高且具有可比性。两个文库的长度分布均在22个核苷酸处呈现单一峰，与microRNA相对应。相比之下，细胞外RNA的文库更具异质性，包含两个额外的峰，分别对应于tRNA、tRNA的半分子和片段，或piRNA。细胞RNA中65%的读段比对到人类microRNA，而其他各类小RNA仅占比对读段的一小部分。相反，仅有8%的细胞外RNA与人类microRNA匹配。测序读段比对到的最丰富的sRNA是tRNA，而未匹配上的读段后续比对到了细菌序列。与牛基因组的比对结果表明，FBS并非污染来源。因此，细胞外RNA表现出与正常细胞内RNA不同的异常谱型。文库构建是本实验方案的关键步骤。混合操作必须非常轻柔，以避免产生气泡。该方法也可用于研究其他类型细胞中外泌RNA（exRNA）的谱型，有助于探索外泌RNA的功能。

isolating-sequencing-analyzing-extracellular-micrornas-from-human

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

人骨髓间充质干细胞细胞外微 rna 的分离、测序和分析

外泌体中稳定存在的微小RNA（miRNA）引起了广泛关注，因其在细胞间通讯中具有重要作用，并在作为生物标志物及治疗干预途径方面展现出巨大潜力。本文展示了从血液和培养基中纯化外泌体，随后通过定量PCR检测其所携带的miRNA。...

血液及培养基来源外泌体的纯化与microRNA谱分析

当受到可溶性因子或特定生物材料刺激时，间充质干细胞（MSCs）具有向成骨细胞系分化的潜能。本研究提出了一种新型的人羊膜来源间充质干细胞（AM-hMSCs）递送方案，该方案采用牛骨基质Nukbone（NKB）作为支架材料。...

从多孔骨基质中分离人类间充质干细胞及其培养

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

胆汁是细胞外囊泡/外泌体的宝贵来源，其中可能含有重要的生物标志物。本方案提供了一种可靠的方法，用于从人胆汁中分离外泌体，以便进行后续分析，包括miRNA谱型分析。...

从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。...

人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

本文介绍了一种分步策略，用于分离小RNA、富集microRNA，并为高通量测序制备样品。随后，我们描述了如何使用开源工具对测序读长进行处理，并将其比对至microRNA序列。...

一种用于分离、测序微小RNA并利用开源工具进行分析的完整流程

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。...

骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

学习从人骨髓间充质干细胞培养基中纯化细胞外微RNA并进行小RNA文库构建与测序的完整实验流程。该方法包含关键质量控制步骤，适用于低起始量样本处理。

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

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