Name: 如何稳定蛋白质: 病毒 x 项目中热移检测和纳米差动扫描荧光测量的稳定性筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学习使用热移检测和纳米差动扫描荧光测量技术快速评估蛋白质热稳定性，筛选最佳缓冲体系与添加剂条件。该方法适用于药物发现中的蛋白质稳定性研究，可高效优化蛋白质结晶与结构生物学实验条件。

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本项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（资助协议编号 n° 685778）。本研究得到了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，资助编号 BB/M011186/1、BB/J014516/1）的支持。DB感谢BBSRC博士生培训合作项目（Newcastle-Liverpool-Durham）提供的奖学金，以及杜伦大学生物科学系对本研究经费的部分支持。我们感谢Ian Edwards提供的帮助，以及杜伦大学化学系质谱部门对蛋白质X的仪器分析支持。我们感谢Arnthor Ævarsson在Virus-X项目中的工作，同时感谢Claire Hatty和NanoTemper GmbH为本项目出借并协助使用Prometheus NT.48系统。最后，感谢Frances Gawthrop和Tozer Seeds作为BBSRC iCASE奖项合作方所提供的支持。

1. 蛋白质样品的制备
<ol>
	<li>将稳定性筛选体系配制成每份500 µL，分装至96孔深孔板中，并密封保存。使用多通道移液器将每个稳定性筛选条件的10 µL转移至96孔板中对应的孔内，以节省时间（图4A）。</li>
	<li>在适当的缓冲体系中配制约1 mg mL-1的蛋白质溶液1 mL。尽管合适缓冲液的组成因蛋白质样品而异，但可优先尝试使用10 mM磷酸钠缓冲液（含100 mM NaCl，pH 7.2）作为初始缓冲液。 
	注意：可接受的蛋白质浓度因具体情况而异，但通常浓度范围在0.5 - 5 mg mL-1时可获得可用于分析的曲线。建议使用稀释后的缓冲液进行稳定性筛选，以避免掩盖各条件的影响。典型的缓冲液组成为约10 mM缓冲液加约100 mM NaCl。</li>
	<li>若进行TSA实验，向蛋白质样品中加入SYPRO Orange染料，使其终浓度为20倍稀释。通过倒置混匀或短暂涡旋混合。</li>
	<li>将10 µL蛋白质溶液转移至第1.1步中准备好的96孔板的每一孔中（图4B）。</li>
	<li>密封96孔板并在600 × g条件下离心2分钟，以确保蛋白质样品与筛选组分充分混合（图4C）。</li>
	<li>重新密封稳定性筛选深孔板，并将筛选板在4 °C下保存，最长可保存4个月。盐类筛选板应避光保存，因为某些组分对光敏感。</li>
	<li>若进行nanoDSF实验，请继续进行第2步；若进行TSA实验，则跳至第4步。</li>
</ol>
2. 准备纳米差示扫描荧光实验
<ol>
	<li>确保设备清洁，特别注意样品架附近的灰尘。如果系统配有背向散射镜，请使用乙醇和无绒纸巾进行清洁。</li>
	<li>按下按钮打开样品抽屉 打开抽屉 按钮。 (图5A).</li>
	<li>用毛细管从96孔板的每个孔中吸取约10 µL溶液，通过将毛细管一端接触溶液完成加样，然后将其放入样品架中对应的毛细管支架内图5B）。注意不要用指纹污染毛细管的中部， 等等，因为这可能会干扰整个实验过程中的荧光读数。</li>
	<li>用磁性密封条固定毛细管（图5C).</li>
</ol>
3. 编程设置 nanoDSF 实验
<ol>
	<li>在Discovery Scan选项卡中，点击Start Discovery Scan按钮，启动初步扫描，以检测每根毛细管的位置和强度。从初始功率10%开始，逐步增加或减少入射激发光强度，直至每根毛细管扫描峰强度处于4,000–12,000单位之间（图5D）。</li>
	<li>为确保样品正确折叠且浓度足够，建议先进行一次具有陡峭温度梯度的初始熔解扫描。在Melting Scan选项卡中，将Temperature Slope设置为7.0 °C min-1，Start Temperature设置为25 °C，End Temperature设置为95 °C，以编程熔解扫描，然后点击Start Melting按钮启动nanoDSF实验。如果所得熔解曲线未显示可检测的拐点，则应考虑进一步浓缩样品，或检查蛋白质是否正确折叠。</li>
	<li>重复步骤2.1–2.4，以制备完整实验所需的样品。</li>
	<li>在Melting Scan选项卡中，将Temperature Slope设置为1.0 °C min-1，Start Temperature设置为25 °C，End Temperature设置为95 °C，以编程熔解扫描，然后点击Start Melting按钮启动nanoDSF实验。</li>
</ol>
4. 进行 TSA 实验
<ol>
	<li>通过用力按压抽屉右侧的凹槽打开样品抽屉。将96孔板放入RT-PCR系统中，确保A1孔位于后左方（图4D）。</li>
	<li>点击 新建实验 按钮以开始设置TSA实验。</li>
	<li>在 实验属性 选项卡中，当系统询问 您要设置何种类型的实验？ 时，选择 熔解曲线 选项；当系统询问 您要使用哪种试剂来检测目标序列？ 时，选择 其他 选项。</li>
	<li>在 板设置/定义目标与样本 选项卡中，输入目标名称，然后将 报告荧光基团 设置为 ROX，将 淬灭基团 设置为 无。</li>
	<li>在 板设置/分配目标与样本 选项卡中，将96孔板的每个孔均分配为上一步输入的目标名称。在同一选项卡中，将 选择用作被动参比的染料 设置为 无。</li>
	<li>在 运行方法 选项卡中，删除步骤直至仅剩三个。将第一步设置为25.0 °C，升降温速率为100%，时间为00:05；第二步设置为95.0 °C，升降温速率为1%，时间为01:00；第三步设置为95.0 °C，升降温速率为100%，时间为00:05。通过 采集数据 下拉菜单或点击 数据采集 图标（图6）来选择采集数据。</li>
	<li>将 每孔反应体积 设置为20 µL。</li>
	<li>按下 开始运行 按钮以启动TSA实验。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>选择一个波长以绘制熔解曲线。对于纳米尺度差示扫描荧光法（nanoDSF）实验，可使用330 nm与350 nm处荧光强度的比值（分别对应非极性与极性环境中色氨酸的荧光信号）13 常被使用。对于大多数TSAs，染料的发射波长最大值适用于熔解曲线的绘制（SYPRO Orange的发射波长最大值为569 nm）12.</li>
	<li>计算 Tm 通过确定每条熔解曲线的拐点来计算各条件下的数值。大多数nanoDSF系统会自动计算Tm 通过数据采集后对熔解曲线进行数值微分来计算值。如果所用软件未自动计算 Tm 数值，免费，替代的图形用户界面驱动软件，例如 NAMI11 可以自动进行数据分析和下游处理，提供生成热图以总结T的选项m 整个96孔实验的数值（随附的参考文献提供了使用NAMI进行数据处理的指导和资源）。</li>
	<li>比较 Tm 所有检测条件下的数值。每个稳定性筛选实验包含两个仅含有水的孔（A1 和 A2）。以纯水孔的数值作为基准，可计算出 ΔTm 值，有助于解决系统误差，并便于比较稳定效应。较高的 Tm 数值表明推荐用于后续应用的热稳定条件。有前景的条件通常在稳定作用上表现出浓度依赖性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤包括离心操作以及在TSA实验中正确密封96孔板（步骤1.5）。离心可确保蛋白质样品与筛选条件充分接触并混合。此外，若在TSA实验中使用未密封的孔板，溶剂在实验过程中可能发生显著蒸发，导致样品浓度升高，并增加蛋白质提前聚集的风险。
TSAs 和纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）适用于多种蛋白质样品；绝大多数样品均可通过基于疏水性的报告染料或无染料的 nanoDSF 获得可解读的熔解曲线。如果标准荧光光源不适用于您的蛋白质，可尝试的最简单实验方案修改是更换荧光探针。已有多种替代性染料可用于 TSA 实验。例如 N-[4-(7-二乙氨基-4-甲基-3-香豆素基)苯基]马来酰亚胺（CPM），该化合物在与巯基反应后产生荧光27；以及 4-(二氰基乙烯基)茉莉酮（DCVJ），该化合物的荧光强度随其所处环境刚性的变化而改变，在蛋白质样品解折叠时荧光增强28,29（后者染料通常需要较高浓度的样品）。
如果仪器软件未自动计算 Tm，可采用其他熔解曲线分析方法。若数据均一，且熔解曲线中仅显示一个变性阶段，则可将截断的数据集拟合为如下方程所示的Boltzmann S形曲线：
<img alt="折叠转变方程，蛋白质稳定性分析，热力学公式，研究示意图。" src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">
其中，F 是温度 T 下的荧光强度，Fmin 和 Fmax 分别为变性转变前后的荧光强度，Tm 为变性转变的中点温度，C 为 Tm 处的斜率。该方法适用于简单的两步变性过程，但对于具有多个转变阶段的复杂熔解曲线则不适用。
TSA 的主要优势之一是其易用性：只要 RT-PCR 系统配备了适用于所用荧光染料的合适波长滤光片，即可开展 TSA 实验。加之其耗材成本低、操作简便以及所需蛋白量相对较少，TSA 已成为工业界和学术界多种规模研究项目中一种极具价值的技术。
除了指示有利的缓冲条件外，筛选板中还包含一些孔，可能提示样品蛋白中存在结构金属离子。在盐筛选中，特别值得关注的是 G6 和 G7 孔，它们分别含有 5 mM EDTA 和 5 mM EGTA。若在这两个孔中观察到显著的热不稳定性，可能表明蛋白中存在被螯合剂捕获的关键金属离子。渗透压保护剂筛选中的化合物也可能为蛋白功能提供线索。筛选中的许多化合物属于常见的酶底物分子类别。例如，溶菌酶在含有糖类（存在于 A11–B10 孔）的条件下表现出的普遍稳定性增强，可能归因于这些糖类与该酶已知底物 N-乙酰葡萄糖胺寡聚物在结构上的相似性30。
上述TSA和nanoDSF方案也可用于研究蛋白质-配体相互作用。能够特异性结合蛋白质的配体可通过在复合物内引入新的相互作用来提高蛋白质的热稳定性。蛋白质Tm值出现剂量依赖性的正向偏移，是成功发生蛋白质-配体相互作用的有力证据。由于TSA在化合物库筛选中具有速度快、通量高和成本低的优势，已成为早期药物发现中非常流行的方法。
优化靶蛋白及其配体复合物的缓冲条件对项目的成功至关重要，许多文献实例已对此加以证实31,32,33,34。结合稳定性筛选的热 shift 测定（TSAs）和纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）通常在包括准备时间在内的 2 小时内即可完成一次典型检测，是一种快速且经济的缓冲条件优化技术。

许多具有生物技术应用价值的酶来源于病毒，例如烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus, TEV）蛋白酶1和人鼻病毒3C型（human rhinovirus type 3C, HRV 3C）蛋白酶2。Horizon2020 Virus-X 项目（图1）3的目标是：（a）拓展已知酶家族的功能特性范围；（b）表征功能尚未明确的新型酶（酶X，Enzyme X）。晶体学结构解析在靶标蛋白的表征中起着关键作用，尤其适用于蛋白序列进化程度过高而难以识别同源性的案例4。蛋白稳定性是结晶过程中的关键因素；样品必须在一段时间内保持构象均一且结构完整，才能形成高质量、可衍射的晶体。此外，在活性检测中，蛋白必须处于其有活性的构象状态，而有利的分子环境有助于维持这种状态。
尽管晶体学家可用的技术不断发展，蛋白质结晶仍然是一个耗时且劳动密集的经验性过程5。在溶液中进行初步的生物物理实验以提高蛋白质的稳定性，通常能为蛋白质结晶提供更理想的起始条件，且一般仅需消耗相对少量的蛋白质样品6,7,8,9。本项目中需要研究的靶标蛋白质数量众多，因此也必须采用可扩展的高通量稳定性检测方法。目前最常用的蛋白质结晶前生物物理表征方法之一是热迁移实验（thermal shift assay，也称为TSA或差示扫描荧光法，DSF）10,11。
热稳定性分析（TSAs）利用对环境敏感的荧光染料来追踪蛋白质样品的热变性过程。许多常用的染料其荧光活性会因其所处环境的极性不同而发生变化，通常在疏水环境中表现出较强的荧光信号，而在极性环境中则迅速发生荧光淬灭12。当蛋白质在变性过程中疏水核心暴露时，通常会引起染料荧光信号显著增强；但当温度升至很高时，随着蛋白质开始聚集，染料的荧光信号反而会下降（图2）。
虽然疏水性敏感染料通常是通用型TSA染料的良好选择，但对于具有大而暴露于溶剂的疏水区域的蛋白质而言，这类染料往往会产生不利的高背景荧光，因而不适用。已有具有其他作用机制的荧光染料（见讨论部分），但也可选择通过nanoDSF检测蛋白质的内在荧光来追踪变性过程。
埋藏在蛋白质非极性区域中的色氨酸残基会发出最大发射波长为330 nm的荧光。当蛋白质样品发生去折叠，这些残基暴露于极性溶剂中时，其最大发射波长会发生红移，达到350 nm13。nanoDSF利用这一最大发射波长的移动来检测蛋白质样品的去折叠过程，而无需使用外源性荧光探针14。
显示单一变性步骤的熔解曲线可通过拟合Boltzmann S型模型进行分析。 unfolding转变拐点处的温度（Tm）被用作蛋白质热稳定性的定量指标，并作为比较不同条件下稳定性的基准。
同一蛋白质在不同条件下的熔解曲线有时会表现出一定程度的异质性，使得 Boltzmann S 形拟合难以实现。为了从偏离经典曲线拓扑结构的数据中识别 Tm 值，可以采用数值分析方法，例如开源 TSA 数据分析程序 NAMI 所使用的方法11。此外，也可采用其他热力学模型来分析具有多个变性步骤的更复杂曲线，例如 ProteoPlex 方法15。
稳定性筛选试剂盒专为TSA和nanoDSF实验设计，可快速确定目标蛋白的有利条件（图3，试剂盒组成详见补充信息）。利用该筛选获得的信息可用于晶体学研究流程的多个阶段，包括：样品保存；蛋白纯化，通过防止纯化过程中蛋白去折叠而减少产率损失；实验设计，采用具有热稳定性的缓冲液增强活性检测中蛋白的功能性；以及最终的结晶步骤，指导合理设计的结晶试验。
为蛋白质样品选择合适的缓冲体系基础至关重要；不相容的pH值可能导致蛋白质失活或变性。然而，在大量X射线晶体结构中解析出的共结晶缓冲分子的存在（表1）也可能表明缓冲分子具有稳定作用，这种作用并非仅仅源于pH调节，而是来自缓冲分子自身的化学特性。
该pH筛选体系结合使用了多种Good's缓冲液17,18,19以及其他常见的生物相容性缓冲系统，旨在将缓冲分子对蛋白质稳定性产生的化学效应与溶液实际pH值的影响区分开来。通过为每种缓冲系统提供三个不同的pH值，并在不同缓冲系统之间设置pH值的重复，该pH筛选体系能够同时确定目标蛋白质的最适pH值和最适缓冲系统。
盐类筛选试剂盒包含常见的实验室用盐以及变性剂、螯合剂、重金属和还原剂。该筛选可大致反映蛋白质样品在高离子强度环境中的稳定性，但其中每类化合物还可提供有关蛋白质潜在结构的信息。例如，若某种螯合剂显著降低了蛋白质的稳定性，可能提示样品中存在对结构起关键作用的金属离子。如果该样品在筛选中同时被某种金属阳离子显著稳定，则可为后续的结构研究提供一个有前景的切入点。
渗透剂是可溶性化合物，能够影响其所在环境的渗透特性。在自然界中，它们可作为&#34;化学伴侣分子&#34;，促进无序蛋白质的正确折叠并增强其稳定性，尤其是在应激条件下20,21,22。这些特性使渗透剂成为蛋白质晶体学中具有吸引力的添加剂，可在晶体收获、上样和储存过程中用作冷冻保护剂23。渗透剂的应用潜力还延伸至蛋白质纯化领域。在大肠杆菌（E. coli）中表达的大量重组蛋白可能不溶，难以通过常规纯化方法以天然状态回收。渗透剂可用于稳定不溶性组分中的蛋白质并将其有效回收，从而提高纯化产率24。
渗透剂筛选体系的设计参考了蛋白质数据库（Protein Data Bank）条目中已知的化合物25以及渗透保护相关通路龙探索数据库（Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated Pathways, DEOP）26，并利用标准蛋白质进行了迭代优化。该筛选体系围绕八类渗透剂亚类构建：甘油、糖类与多元醇、非离子型磺基甜菜碱（NDSBs）、甜菜碱及其类似物、有机磷酸盐、二肽、氨基酸及其衍生物，以及最后一类杂项化合物。每种渗透剂根据其溶解度和有效浓度范围设置多个浓度梯度，以便进行比较。

<table><tbody><tr><td>溶菌酶</td><td>Melford Laboratories</td><td>L38100</td><td>结晶并冻干的鸡蛋清溶菌酶。</td></tr><tr><td>Durham pH 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-101</td><td>96孔蛋白稳定性筛选试剂盒。内容物详见上文。</td></tr><tr><td>Durham 盐类筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-102</td><td>96孔蛋白稳定性筛选试剂盒。内容物详见上文。</td></tr><tr><td>Durham 渗透剂筛选试剂盒</td><td>Various</td><td>#N/A</td><td>96孔蛋白稳定性筛选试剂盒，在发表时未商业化供应。内容物详见上文。</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S6651</td><td>广泛用于凝胶电泳和差示扫描荧光法（DSF）中蛋白质染色的荧光染料。</td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>Starlab</td><td>1403-7700</td><td>半裙边透明塑料板，适用于AB 7500 Fast RT-PCR系统。</td></tr><tr><td>7500 Fast 实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>96孔板格式的RT-PCR系统。可使用其他替代系统。数据分析采用免费开放获取软件NAMI进行。AB公司提供专用于7500 Fast系统的DSF实验分析软件，需额外付费。</td></tr><tr><td>Prometheus NT.48</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>#N/A</td><td>无标记DSF系统，最多可处理48个样品。可通过内置软件计算解折叠温度（T&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt; 和 T&lt;sub&gt;onset&lt;/sub&gt;）、变性剂临界浓度（C&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt;）、自由折叠能（&amp;Delta;G 和 &amp;Delta;&amp;Delta;G）以及聚集结果（T&lt;sub&gt;agg&lt;/sub&gt;）。</td></tr><tr><td>Prometheus NT.48系列nanoDSF级标准毛细管</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>PR-C002</td><td>Prometheus NT.48系列nanoDSF级标准毛细管。&quot;高灵敏度&quot;型号可用于低浓度样品（&amp;lt;200 &amp;micro;g ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;），价格较高。</td></tr></tbody></table>

如何稳定蛋白质：病毒-x 项目中用于热迁移实验和纳米差示扫描荧光法的稳定性筛选

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

“地平线2020”病毒-X（Virus-X）项目于2015年启动，旨在探索选定极端生物群落中的病毒圈并发现新型病毒蛋白。为了评估这些蛋白潜在的生物技术价值，对蛋白结构与功能的分析成为该项目的核心挑战。蛋白样品的稳定性对于获得有意义的检测结果并提高目标蛋白的结晶能力至关重要。热迁移检测（TSA）是一种基于荧光的技术，已被确立为高通量条件下优化蛋白稳定性条件的常用方法。在TSA中，所用的荧光染料为外源性、环境敏感型染料。另一种类似的技术是纳米差示扫描荧光法（nanoDSF），该方法依赖于蛋白自身的固有荧光。本文介绍了一种新型渗透保护剂筛选方法——一种包含96种条件的有机添加剂筛选体系，旨在通过初步的TSA实验指导结晶试验。结合先前开发的pH值和盐类筛选体系，这三种筛选方法共同构成了在多种缓冲体系和添加剂条件下对蛋白稳定性进行全面分析的工具。这些筛选方法的有效性已在溶菌酶和病毒-X项目的靶标蛋白X的TSA与nanoDSF分析中得到验证。

溶菌酶通过稳定性筛选实验进行检测，Virus-X 项目中的靶标蛋白 Protein X 则通过渗透调节剂筛选实验进行检测。两种蛋白质在TSA和nanoDSF实验中通常均产生具有明确变性转变的熔解曲线（代表性曲线见附图）。少数样品未产生可解析的、具有明确变性转变的曲线，被视为已变性，未纳入Tm值的比较分析。
图7 展示了盐筛选实验的示例结果，说明了氯化铵对溶菌酶具有热稳定作用。上述所示的浓度依赖性通常提示有前景的实验条件，但将不同盐类在离子浓度递增条件下的结果进行比较，有助于判断热稳定性提升是普遍源于缓冲液离子强度的增加，还是特定离子的存在提供了额外的稳定性。
溶菌酶在不同pH条件下的Tm值比较（图8）揭示了两条信息。首先，随着pH值降低，蛋白质稳定性总体呈上升趋势。其次，在相同pH值下使用不同缓冲体系所获得的Tm值范围可能差异显著。
图8 中的数据表明，在本实验中，TSA 与 nanoDSF 的结果总体上具有良好的一致性，但 nanoDSF 倾向于检测出略高的 Tm 值以及略大的 Tm 位移。然而，某些 pH 值高于 8.5 的孔位中，TSA 与 nanoDSF 所得 Tm 值之间存在较大差异。这些差异可能源于蛋白质在不同 pH 条件下的变性机制差异；例如，若蛋白质的疏水区域暴露于溶剂的速度显著快于色氨酸残基周围极性环境的变化，那么对疏水性敏感的染料可能会给出相对较低的 Tm 读数。
图9展示了使用渗透保护剂筛选法测得的溶菌酶Tm值的热图。与对照孔（A1和A2孔，含去离子水）相比，Tm升高最显著的条件以深蓝色标示。在图9中识别出的特别具有稳定作用的条件包括甘油、1 M D-山梨醇、100 mM 亚牛磺酸和10 mM Ala-Gly（分别为A4-A6、A9、E7和F8孔）。
图10 显示了使用蛋白质X获得的Tm值的热图。通过渗透保护剂筛选进行的TSA和nanoDSF实验表明，大多数测试的渗透保护剂对蛋白质X的稳定性仅产生轻微的Tm升高（在1 °C以内），或具有不利影响。特别是，10 mM浓度的吡啶二羧酸（D1孔）似乎在室温下导致样品变性。TSA和nanoDSF结果迅速识别出吡啶二羧酸是与蛋白质X不相容的添加剂，在操作该蛋白质时应避免使用。然而，高浓度的D-山梨醇和阿拉伯糖（分别为A9和B9孔，均为1 M）以及甘油和TMAO（分别为A4-A6孔和E1孔）被鉴定为具有热稳定作用。
对于溶菌酶，测试了各稳定性筛选中产生最高Tm值的条件组合，以探究其是否存在协同增强效应。图11显示，随着缓冲体系中各组分（pH、盐和渗透保护剂）的逐步添加，Tm值总体呈上升趋势。以MES、硫酸铵和D-山梨醇为例，当所有组分共同存在时，Tm值相较于仅含MES的条件可提高多达10 °C。图11表明，当缓冲体系的各个组分经过优化并结合稳定性筛选时，可能产生显著的协同效应。
总体而言，图11 还展示了在TSA和nanoDSF实验中可观察到的ΔTm值的大小。可实现的ΔTm值大小因蛋白质体系而异，但任何接近或超过5 °C的ΔTm值通常表明具有有益的稳定效应。
<img alt="地热区野外考察；研究人员分析地热活动，可见蒸汽喷口。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：生物勘探。 Virus-X 项目中从极端环境中采集样本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质稳定性示意图；荧光强度与温度关系；变性与聚集阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：TSA 示意图。 TSA 实验中典型的熔解曲线示例及其标注。该曲线具有经典的“两态”蛋白质解折叠特征，即样品群体从折叠状态转变为变性状态，过程中未检测到部分折叠的中间态。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="优化缓冲液示意图：pH、盐、渗透保护剂作为稳定添加剂及离子强度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：稳定性筛选实验流程。 使用稳定性筛选试剂盒进行缓冲液优化的标准流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用多通道移液器和微孔板读板仪进行96孔板ELISA实验流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：标准TSA实验结合稳定性筛选的工作流程。 从左至右：（A）将稳定性筛选试剂分装至96孔板中。（B）将含荧光染料的蛋白样品加入板孔中。（C）在离心前密封微孔板。（D）将微孔板放入RT-PCR仪中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="使用纳米差示扫描荧光仪进行热稳定性分析；蛋白质去折叠；科学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：标准纳米差示扫描荧光（nanoDSF）实验的工作流程。 （A）打开毛细管加样架盖。（B）将毛细管装入加样架中。（C）使用磁性密封条固定毛细管。（D）设定实验程序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="熔解曲线分析图、热稳定性实验、DNA变性阶段、实验设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：RT-PCR系统的用户界面。 已设置一个热稳定性实验（TSA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光与温度关系图；氯化铵效应，实验数据，柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：盐筛选实验样本数据。 （A）在无标记纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）实验中，溶菌酶在350 nm与330 nm处荧光强度的比值。样品对应于盐筛选板中的C7-C12孔（1.5 M - 0.2 M 氯化铵）。每种条件下的计算Tm值已叠加在图中。（B）根据图 7A所示数据计算得到的Tm值汇总。（C）使用疏水性敏感报告染料对溶菌酶进行热迁移实验（TSA）时，在590 nm处的荧光强度。与图 7A类似，样品对应于盐筛选板中的C7-C12孔。计算得到的Tm值已叠加在图中。（D）根据图 7C中数据计算得到的Tm值汇总。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="热稳定性曲线，ΔTm 与 pH 的关系，Thermofluor 和 nanoDSF 蛋白质分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8：pH 筛选实验样本数据。 溶菌酶在不同 pH 条件下测得的 Tm 变化汇总结果。每个数据点代表一个独立的实验条件；相同 pH 值下的点表示在该 pH 下使用了不同的缓冲体系。Tm 变化值是相对于对照实验中 TSA 的 Tm 控制值 68.0 °C 和 nanoDSF 实验的 71.9 °C 计算得出的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示科学分析中温度数据分布矩阵的热图示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9：渗透保护剂筛选实验样本数据（溶菌酶）。 通过无标记纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）实验获得的溶菌酶与渗透保护剂筛选板各孔对应的Tm值汇总。Tm值（单位：°C）以A1和A2孔为对照，其中A1和A2孔含有作为对照的水。热图基于ΔTm值生成（蓝色表示Tm升高，红色表示Tm降低）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="山梨醇和吡啶二羧酸对样品温度影响的热图及荧光比值图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 10"> 
图10：渗透保护剂筛选实验样本数据（蛋白X）。（A）基于蛋白X在渗透保护剂筛选条件下进行的无标记nanoDSF实验所获得的Tm值汇总。Tm值相对于含有水的对照孔A1和A2进行比较。热图根据ΔTm值生成（蓝色表示Tm升高，红色表示Tm降低）。（B）从孔A9（1 M D-山梨醇，稳定条件）和孔D1（10 mM 吡啶二羧酸，不稳定条件）获得的nanoDSF曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="柱状图比较含D-山梨醇和Li-氯化物等添加剂的pH缓冲液的热稳定性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：缓冲液优化对Tm的影响。结合各筛选条件下溶菌酶的TSA Tm值，这些条件可使Tm提升幅度最大。选择100 mM乙酸（pH 4.2）和100 mM MES（pH 5.6）作为缓冲体系，并以1.5 M硫酸铵作为盐。渗透保护剂的浓度与渗透保护剂筛选中的浓度一致：10 mM Ala-Gly、1 M D-sorbitol、50 mM L-lysine和100 mM hypotaurine。误差线表示六次重复实验的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>分子</td>
			<td>PDB 编码</td>
			<td>共结晶频率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸根</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙酸根</td>
			<td>ACT</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)</td>
			<td>MES</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三(羟甲基)氨基甲烷 (tris)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲酸根</td>
			<td>FMT</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：蛋白质数据库（PDB）条目中缓冲液分子共结晶频率的汇总。 数据来源于PDBsum16，共包含144,868个条目（截至2018年5月12日）。
补充信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>。
补充表 1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>。
补充表 2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>。
补充表 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>.

本文介绍了一种通过热迁移实验和纳米差示扫描荧光法，在多种条件下快速检测蛋白质热稳定性的实验方案。将缓冲体系、盐类和添加剂组合成三种独特的稳定性筛选体系，与蛋白质共同进行检测，以鉴定适用于功能和结构研究的合适缓冲液。

如何稳定蛋白质：病毒-X 项目中用于热迁移实验和纳米差示扫描荧光法的稳定性筛选

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该方法可用于解答蛋白质化学和药物发现领域的问题，例如：哪些条件能够稳定蛋白质？哪些突变会影响酶的热稳定性？以及哪些配体能够结合特定的蛋白质靶标？该技术的主要优势在于其快速、可在标准实验室中轻松操作，并且非常适用于中高通量的应用。为准备蛋白样品，使用多通道移液器将稳定性筛选中每种条件下的10 µL样品转移至96孔板中对应的孔内，以节省时间。然后，在适当的缓冲体系中制备1 mL浓度约为1 mg/mL的蛋白溶液。若进行热迁移实验，向蛋白质样品中加入SYPRO orange染料，使其终浓度为20X。通过倒置或短暂涡旋混匀。然后将10微升蛋白质溶液转移至96孔板的每个孔中。密封96孔板并在600 × g条件下离心两分钟，以确保蛋白样品与筛选组分充分混合。重新密封稳定性筛选深孔板，并将筛选板在4°C条件下保存，最长可保存四个月。进行TSA实验时，通过用力按压抽屉右侧的凹槽打开样品抽屉。将96孔板放入RT-PCR系统中，使A1孔位于左后方。点击“新建实验”按钮以开始设置TSA实验。在“实验属性”选项卡中，当系统询问“要设置何种类型的实验？”时，选择“熔解曲线”选项。当被询问时，选择另一个选项：您希望使用哪种试剂来检测目标序列？在“板设置”的“定义目标与样本”选项卡中，输入目标名称，然后将报告基团设置为 ROX，淬灭基团设置为无。在“板设置、指定目标和样本”选项卡中，将用作被动参照的染料设置为“无”。在同一选项卡中，将96孔板的每个孔指定为上一步中输入的目标名称。在“运行方法”选项卡中，删除步骤，直至仅保留三个步骤。将第一步设置为25摄氏度，升降温速率为100%，时间为5秒。将第二步设置为95摄氏度，升降温速率为1%，时间为1分钟。最后，将第三步设置为95摄氏度，升降温速率为100%，时间为5秒。通过“收集数据”下拉菜单或单击数据采集图标选择收集数据。将每孔反应体积设置为 20 µL。单击“开始运行”按钮以启动 TSA 实验。纳米差示扫描荧光法（NanoDSF）可用于检测蛋白质的热稳定性，且无需使用外源性染料。样品可按照前述实验方案在96孔板中制备，但不添加任何SYPRO Orange染料。通过按下“打开抽屉”按钮来打开样品抽屉。确保设备清洁，特别注意样品架附近的灰尘。如果系统配有背向散射镜，请使用乙醇和无绒纸巾进行清洁。将毛细管的一端浸入溶液中，从96孔板的每个孔中各吸取约10微升样品，完成毛细管的加样。然后将毛细管放入样品架上对应的毛细管支架中。注意不要用手指触碰毛细管的中段，以免留下指纹而影响整个实验过程中的荧光读数。使用磁性密封条固定毛细管。在“发现扫描”选项卡中，点击“启动发现扫描”按钮，以检测每根毛细管的位置和强度。从初始功率10%开始，逐步增加或减少入射激发光强度，直至每根毛细管扫描曲线的峰值处于4,000至12,000单位之间。在“熔解扫描”选项卡中，将“温度斜率”选项设置为每分钟7.0度，以程序化设定一次熔解扫描。将起始温度设为 25 摄氏度，终止温度设为 95 摄氏度。然后点击“开始熔解”按钮，启动 nanoDSF 实验。重复这些步骤以制备完整实验所需的样品。设置完完整实验后，进入“熔解曲线扫描”选项卡，通过将温度斜率设为每分钟1.0摄氏度、起始温度设为25摄氏度，来程序化设定一次熔解扫描。并将终止温度设为95摄氏度。最后，按下“开始熔解”按钮以启动nanoDSF实验。Tm被用作衡量蛋白质热稳定性的定量指标，作为基准用于比较不同条件下蛋白质稳定性的优劣。此处展示的是盐筛选的示例结果，说明了氯化铵对溶菌酶的热稳定作用。将溶菌酶在pH筛选中的Tm值进行比较后发现，TSA与nanoDSF之间的结果总体符合良好，但nanoDSF倾向于检测出比TSA略高的Tm值，且在Tm偏移量上也略大。总体趋势显示，随着pH值降低，稳定性呈上升趋势。使用不同缓冲体系在相同pH值下获得的Tm值范围可能存在显著差异。针对溶菌酶，从每次稳定性筛选中选取产生最高TSA Tm值的条件组合，进一步测试以探究其是否存在协同增效作用。随着缓冲体系中组分的增加，Tm值总体呈现上升趋势。当缓冲液的各个组分经过优化并与稳定性筛选相结合时，可能会产生显著的协同效应。采用该技术后，还可结合其他方法（如结晶法）来确定蛋白质的三维结构，并揭示配体结合的分子基础。此外，作为 Virus-X 项目的一部分，该技术不仅有助于深入理解蛋白质稳定性，还可广泛应用于多种药物发现与开发体系。

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