Name: 两栖动物卵巢监测和控制的生殖技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学习可恢复性卵巢切除术技术，用于两栖动物卵巢监测与生殖健康研究，无需安乐死即可获取卵母细胞。该方法支持术后生殖能力恢复，适用于无尾目雌性动物的生殖生物学与病理管理研究。

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Natalie Calatayud 感谢 Barbara Durrant 博士在超声技术方面的培训与协助，并感谢 Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) 为我在 SDZG 的研究助理职位提供经济资助。感谢 Kylie Cane 博士对稿件提出的修改意见，以及各位匿名审稿专家（无论他们是谁）的宝贵建议。感谢 Jonathan Dain，2018 年夏季研究员，圣迭戈动物园保护研究所，提供了照片（图 1A、B）。Monica Stoops 对动物园与水族馆协会保护捐赠基金以及迪士尼全球保护基金表示感谢，这些基金为建立人工饲养的Necturus种群提供了资金支持。此外，两栖动物倡导者 Iris de la Motte 女士的私人捐赠也为本研究提供了资助。特此感谢 Christopher DeChant 先生和 Mark Campbell 博士为本研究作出的重要贡献。

蝾螈实验程序已获得辛辛那提动物园批准 &amp;#38; 中国科学院植物园（CZBG）机构动物护理与使用委员会（IACUC）方案 11-106、13-110、14-133 和 15-138。所有蛙类和蟾蜍操作程序均经圣地亚哥动物园全球组织（SDZG）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，方案编号为：15-001、16-005 和 18-003。
动物的护理和治疗已获得国家自然历史博物馆（巴黎）（法国国家自然历史博物馆-植物园动物园（MNHN））伦理委员会批准，符合机构和国家指南（基因工程委员会、地方兽医服务局、欧盟指令2010/63/EU），并依据用于实验和其他科学目的的脊椎动物欧洲公约第C75-05-01-2号许可决定。本研究中使用的所有方案均在参考编号68-037下获得批准。
1. 非侵入性卵巢监测技术
<ol>
	<li>目视检查与触诊
	<ol>
		<li>以下列三种方式之一固定雌性无尾目动物。
		<ol>
			<li>用无名指和小指固定蛙或蟾蜍的四肢，用食指和中指支撑蛙体背部（腹部），拇指支撑腹面（图1A）。</li>
			<li>用惯用手握住蛙或蟾蜍，拇指置于其腹部，其余手指固定动物背部。用非惯用手触诊动物腹部，检查是否存在皮下凹凸不平（图1B）。</li>
			<li>将蛙或蟾蜍的腹部置于手掌上，前肢搭在食指上，拇指置于其上背部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>由于有尾目动物在自然状态下完全水生，可通过以下两种方法之一进行目视检查。
		<ol>
			<li>将动物转移至一个单独的4 L容器中，容器内装有养殖水。手持容器（盖子固定），用手电筒照射其底部，以观察是否存在卵。</li>
			<li>使用MS222（0.5 g/L；三卡因甲磺酸盐，用0.5 M NaHCO3缓冲）进行麻醉。诱导完成后，将动物翻转至仰卧位并检查腹部。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>形态测量评估
	<ol>
		<li>无尾目
		 
		注：无需麻醉。
		<ol>
			<li>使用卡尺测量动物从口尖沿身体中线至尾尖的距离，以获得SUL和SVL（图2A、B）。</li>
			<li>将塑料容器在电子精密天平上去皮归零。将动物放入已去皮的容器中称重（图2C）。</li>
			<li>对于较大的动物（如牛蛙）或野外称重时，使用悬挂式秤（图2D）。</li>
			<li>与许多无尾目物种类似，可通过体型较大以及手部无婚垫（拇指垫）来区分R. muscosa成年雌性与雄性（图3）。</li>
			<li>通过以下公式计算体况指数，作为整体健康状况的基本评估： 
			弗尔顿指数：K = 质量 ÷ 长度3 
			注：弗尔顿指数使用与质量和长度相关的体积维度平衡，其中3为等距关联质量和长度的缩放指数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>有尾目
		<ol>
			<li>在将未麻醉动物放入袋中前，先用空袋在秤上归零。注意避免引入过多水分（图2D），并迅速操作，因为动物在被束缚时会因应激而分泌黏液。</li>
			<li>将个体固定于可密封塑料袋底部或另一个可容纳展开卡尺的塑料容器中，保持直线姿势，以获取成年个体的测量数据。</li>
			<li>使用卡尺测量体长（图2E）。</li>
			<li>测量有尾目动物从吻尖至尾尖（SVL）的长度，以监测生长情况。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>行为观察
	<ol>
		<li>实时直接观察动物，或使用摄像机记录其行为。</li>
		<li>记录动物的观察结果，对行为进行分类并构建行为谱（图4）。</li>
		<li>分类繁殖行为 
		注：图4展示了一种在无尾目动物中观察到的繁殖行为类型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声检查 
	注：本实验推荐使用的超声探头为7.5 mHz线性探头或多功能（10-6 mHz）微凸探头，适用于Necturus；对于R. muscosa，建议使用10 MHz探头及水溶性无盐凝胶。对蝾螈进行超声检查可能需要麻醉（参见第1.5节操作说明）。
	<ol>
		<li>无尾目
		<ol>
			<li>由两人协作对R. muscosa进行超声检查（图5A）。</li>
			<li>第一人：用惯用手固定动物，并在其腹部涂抹水溶性无盐凝胶。</li>
			<li>第二人（超声操作员）：用惯用手持10 MHz探头，将其接触腹部，确保探头与凝胶之间充分接触。</li>
			<li>从腋下稍下方开始向动物腹部中线中心滑动，以完整观察整个卵巢。</li>
			<li>超声操作员：用非惯用手冻结画面并捕获所需图像。</li>
			<li>根据该属已建立的分级系统对卵巢周期阶段进行分类4（表2，图5B-F）。</li>
			<li>操作结束后，用清水彻底冲洗动物体表残留的凝胶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>有尾目
		<ol>
			<li>将未麻醉的Necturus转移至装有2 L养殖水的4 L矩形容器中。</li>
			<li>通过关闭室内灯光和/或用手遮盖动物头部，以减少动物活动。</li>
			<li>将探头置于距体壁1-2 cm处。</li>
			<li>在前肢水平的腹侧中线定位心脏，然后将探头向远端移动，检查卵巢组织7。</li>
			<li>根据该属已建立的分级系统对雌性个体进行分类4（图6A、B、C）。</li>
			<li>在动物身体与探头呈一定角度（即非直线，而是轻微弧形；图6B）时捕获图像，以准确测量中晚期 gravid 阶段的卵。否则，滤泡重叠将难以区分单个卵的大小。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉诱导与恢复
	<ol>
		<li>无尾目
		<ol>
			<li>如前所述，使用MS222（0.5 g/L；三卡因甲磺酸盐，用0.5 M NaHCO3缓冲）进行麻醉。</li>
			<li>以翻正反射作为判断动物麻醉程度的主要指标。翻正反射完全消失表明动物已进入深度麻醉状态。</li>
			<li>一旦翻正反射消失，立即将动物从基于水浴的麻醉剂（MS-222）中取出。</li>
			<li>将动物放置于湿润（使用不含麻醉剂的去氯水）的毛巾上。</li>
			<li>确保在整个手术过程中保持动物体表湿润。</li>
			<li>对小型两栖动物使用红色橡胶导管、无套囊管或传统带套囊气管插管（不充气套囊）进行插管。</li>
			<li>提供低流量氧气（0.5-0.75 L/min），并加入0.5-1%异氟烷。</li>
			<li>操作结束后停止异氟烷，但继续供氧1分钟。</li>
			<li>拔管后，用不含麻醉剂的去氯水彻底冲洗动物2分钟。</li>
			<li>将动物置于少量去氯水中或湿润的毛巾上。</li>
			<li>通过轻拉后肢使其伸展来评估动物恢复情况。任何肢体的收缩反应均提示存在屈肌反射。</li>
			<li>监测其他恢复指标，如喉部呼吸（喉部运动）和翻正反射。</li>
			<li>当所有反射均已恢复，且心率和呼吸频率恢复至麻醉前水平时，认为两栖动物已完全恢复。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>有尾目
		<ol>
			<li>在4 L矩形水箱中，使用MS222（0.5 g/L三卡因甲磺酸盐，用0.5 M NaHCO3缓冲）对Necturus和Ambystoma进行麻醉（MS222）。</li>
			<li>将一个气石（1英寸）和气泵放入水箱，并开启至恒定气流，以提供充足氧气。</li>
			<li>当肢体功能和翻正反射消失后，将动物从基于水浴的麻醉剂（MS-222）中取出，并置于湿润（使用不含麻醉剂的去氯水）的毛巾上。</li>
			<li>使用装有养殖水的挤压瓶保持皮肤和鳃的湿润。</li>
			<li>恢复时，小心地将动物腹侧朝下放入装有2 L养殖水并配有气石的4 L塑料容器中。 
			注：恢复过程始于鳃闪动，随后是尾部运动并向前推进，最终恢复四肢的功能性运动。</li>
			<li>将动物放回原始饲养水箱，并在接下来的24小时内密切监测。 
			注：其他两栖动物麻醉方法也存在，详见Wright和Whitaker8。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵巢侵入性监测与控制技术
注意：本方案改编自 Forzán 等人10。
<ol>
	<li>用惯用手握住青蛙，并用无菌擦拭巾或纱布将青蛙面部采血侧蘸干。</li>
	<li>将面部擦干，以避免血液在皮肤上过度扩散。</li>
	<li>将针头（26 G 1/2&#34; 和 27 G 1/2&#34;）斜面向上插入皮肤，进针位置为眼周隆起皮肤与上颌脊交汇处所形成的三角形顶点（黄色轮廓）（图7A），以接近vena facialis，靠近vena orbitalis后方。</li>
	<li>在右眼下方、上颌脊上方穿刺面部静脉，进针点始于眼正中线后方1-2 mm处（图7A）。 
	注意：对于体型较小的青蛙（体重低于20 g），应将进针点移至更靠近眼正中线下方的位置。</li>
	<li>将微毛细管向下倾斜，利用重力促使血液流入管中。穿刺后血液应立即流出（图7B，C）。</li>
	<li>一旦出现血液流出，立即将微毛细管尖端置于穿刺部位，采集1-2整管血液，并将毛细管放入合适的收集容器中（图7B，C）。</li>
	<li>如果血液流出不畅或血量极少，可轻微调整针头位置，或将针头插入面部另一侧。</li>
	<li>用纱布紧压穿刺部位至少20秒，以止血。</li>
	<li>将青蛙离开水环境放置10分钟，确认穿刺部位未重新开放。</li>
	<li>每只青蛙采样时均应使用新的针头和新的微毛细管。</li>
</ol>
3. 激素诱导
<ol>
	<li>激素制备
	<ol>
		<li>在使用前立即准备激素注射液，以确保最大效果。</li>
		<li>从表1列出的选项中选择一种激素。</li>
		<li>根据体重以 µL 或 mL/g 为单位确定待注射激素的浓度16。</li>
		<li>将激素溶于以下任一溶剂中：水、磷酸盐缓冲液（PBS）、两栖类林格氏液（SARS）或生理盐水。</li>
		<li>对于体重为30–70 g的蛙，注射体积不得超过200 µL；对于体重为80–110 g的蛙，注射体积不得超过300 µL（个人观察）16。</li>
		<li>在对体重为10–100 g的动物进行激素给药时，为正确固定动物，请采用1.1节中描述的任一合适的固定方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无尾类
	<ol>
		<li>根据个体体重（g/体重）计算所需浓度。</li>
		<li>在给药前，用所选的无菌稀释液重新配制。</li>
		<li>注射前确保注射器内无气泡残留。</li>
		<li>用非惯用手牢固固定动物，用惯用手进行注射。</li>
		<li>根据激素的具体要求进行注射。无尾类中最常见的注射方式为皮下、腹腔或肌肉注射（图8）。</li>
		<li>腹腔注射应位于腹部下部或靠近后肢的背部体侧下段（图9）。</li>
		<li>肌肉注射应优先选择后肢部位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有尾类（Necturus）
	<ol>
		<li>按照上述按体重克数计算的方法，将所选激素用无菌水重新配制。</li>
		<li>对于Necturus，使用1.7–2.3 µg GnRH/g体重的剂量。</li>
		<li>将Necturus从麻醉室中取出，置于覆盖手术巾的45°斜面上。</li>
		<li>使动物头部朝下放置。</li>
		<li>从腹部后象限（后肢后方）以15–20°角进针。注意避免将空气引入注射器中。</li>
		<li>使用胰岛素注射器和27–30 G针头进行腹腔注射（IP）。</li>
		<li>使用胰岛素注射器和27–30 G针头注射激素。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 手术
<ol>
	<li>常规外科准备与操作
	<ol>
		<li>为维持无菌操作，使用透明无菌塑料巾隔离手术区域。通过保持周围皮肤湿润以减少蒸发。</li>
		<li>将接触动物皮肤的任何材料用无菌水润湿。使用15号或11号手术刀片进行皮肤切口。 
		注：可结合使用冷刀、电外科或半导体激光。在轻度出血操作中，可通过电凝或半导体激光实现止血。</li>
		<li>使用带棉头的探针或涂抹器，对小血管施加局部压力，以便监测出血量。</li>
		<li>在处理狭小局限空间时，使用带棉头的探针或涂抹器替代标准纱布块。</li>
		<li>对体重小于1 kg的动物进行手术时，使用显微器械（如眼科器械），其尖端应细小精细。</li>
		<li>使用可自行固定的塑料拉钩（例如Lone Star拉钩），以适应不同大小的切口。</li>
		<li>使用眼睑拉钩牵开体腔切口。</li>
		<li>在对较小动物进行手术时，必要处应使用放大设备。 
		注：两栖动物接受任何外科手术均需给予镇痛。手术过程中未充分给予镇痛与正常功能恢复延迟相关。此外，镇痛可增强麻醉药物的效果（表3）34。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无尾目动物
	<ol>
		<li>按照步骤1.5.1所述方法麻醉X. laevis后，将动物置于仰卧位（图10A,C）。</li>
		<li>以无菌湿纱布蘸取稀释的聚维酮碘溶液（1/10），在手术区域擦拭10-15秒，或使用0.75%氯己定溶液处理手术部位至少10分钟，以完成手术区域的无菌准备35。</li>
		<li>在躯干中部（肩部与泄殖腔之间）做一3 mm长的旁正中皮肤切口，使用15号或11号手术刀一次果断切割，形成整齐切口。 
		注：也可使用半导体激光进行皮肤切口。</li>
		<li>提起腹膜，使用15号或11号手术刀小心切开并分离（图10B,D）。</li>
		<li>使用眼睑拉钩（或其他合适器械）牵开体腔切口。</li>
		<li>切除部分卵团，无需结扎任何血管。</li>
		<li>行完全卵巢切除术时，通过电凝或半导体激光烧灼周围血管（图11）。</li>
		<li>使用单股缝线，采用间断外翻缝合方式关闭腹腔切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有尾目动物
	<ol>
		<li>麻醉&#160;A. mexicanum后，将其置于右侧卧位，左后肢自然贴于尾基部。</li>
		<li>以无菌湿纱布蘸取稀释的聚维酮碘溶液（1:10），在手术区域擦拭10-15秒，完成手术区域的无菌准备。或使用浸有0.75%氯己定溶液的无菌纱布覆盖手术部位，术前至少保留10分钟（图12A）36, 37。</li>
		<li>在肩部与后肢之间画一条线，将身体分为三个相等部分（图12B）。</li>
		<li>在第二与第三部分之间确定切口位置。</li>
		<li>夹住下方肌肉并将其从体腔脏器上抬起。</li>
		<li>轻柔地将小型止血钳穿过体腔肌层进入体腔。</li>
		<li>使用眼睑拉钩（或其他合适材料）牵开体腔切口（图12C）。</li>
		<li>行完全卵巢切除术时，通过电凝或半导体激光烧灼周围血管（图12D）。</li>
		<li>使用单股缝线，采用间断外翻缝合方式关闭腹腔切口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

直接操作、视觉观察和形态测量提供了非侵入性技术，是判断雌性繁殖阶段的首要评估标准。然而，本研究表明，通过触诊并不总能可靠地识别怀卵卵巢。根据物种的不同，怀卵卵巢有时可通过动物腹侧半透明（图13A、B）或完全透明的皮肤在视觉上被观察到（图13C）。完成产卵的雌性个体在外观上可能表现出与怀卵雌性明显的差异（例如皮肤松弛，体重减少高达30%，图13D）。在繁殖期间，雄性和雌性会表现出某些行为，这些行为可提供有关排卵和产卵临近程度的信息。以R. muscosa为例，雌性接近产卵的征兆首先表现为雌性做出倒立动作。
将超声技术应用于&#160;无尾目和有尾目动物，可诊断其是否怀卵，以及产卵是否伴随成熟卵子的完全或部分释放。因此，该方法能够更全面、准确地评估繁殖状态，而不受限于依赖腹部皮肤透明度或不同两栖动物物种间表皮一致性的可视化技术来判断怀卵/非怀卵状态。超声检查操作相对简便，对动物造成的应激较小（图5 和 图13），可用于表征繁殖周期并确定&#160;繁殖状态4。熟悉目标物种的特征至关重要；然而，本研究表明，Necturus 和 R. muscosa 在其繁殖模式中具有共同的发育特征，因而可采用相似的繁殖阶段分类方法（图5）。通过该技术，目前已有证据表明，圈养条件下的 Necturus 和 R. muscosa 卵子发育水平较高，且这两个物种均呈现季节性繁殖模式。尽管这些现象的具体原因尚不明确，仍需进一步研究，但若未使用超声技术，诸如卵子滞留和部分产卵等卵巢功能异常情况将难以被发现。未来该技术的应用将用于判断雌性个体在特定年份是否适合作为繁殖对象，以及产卵是否完全。
一种有效的血液采集方案（例如在R. muscosa中所采用的方案），在尽量减少动物应激的同时，非常适合用于研究圈养及野外捕获的无尾目动物的激素谱型（Calatayud，未发表）。迄今为止，尚无关于圈养R. muscosa全年激素谱型的公开信息，因此也无法了解激素如何影响其健康与繁殖。此外，已有证据表明该物种的雌性个体可能并非每年繁殖，因此激素谱型分析将成为追踪卵巢周期的另一种手段。结合超声检查，激素分析或可更准确地预测哪些雌性个体即将进入产卵期。此外，在过去一年中，已在圈养的R. muscosa种群中记录到两例间性个体。同时，在部分年龄较大的建群雌性个体中观察到拇指垫的发育。目前正对此现象进行调查，初步结果提示其可能与睾酮水平的变化有关（Calatayud，未发表）。明确不同年龄雌性个体的激素周期将有助于我们理解为何部分雌性会发育出通常与雄性相关的第二性征，以及此类现象是否在老龄种群中具有可预期性。
外源性激素治疗已被用于克服圈养两栖动物中常见的生殖功能障碍。然而，在本研究中的R. muscosa和Necturus种群中，分别在2年和5年的时间内，均未检测到经激素处理的雌性与对照组雌性在产卵行为上存在显著差异。这可能表明所采用的激素给药方案、剂量、诱导程序及激素组合对该物种并不适宜。对个体雌性繁殖史的进一步分析表明，R. muscosa可能并非每年繁殖一次，这也可解释在处理雌性中未观察到激素效应的原因。由于每年均有相当比例的雌性持续跳过繁殖期，了解该物种的自然史有助于判断是否需要使用外源性激素以及何时使用最为有效。本文所述的操作程序可应用于多种物种（表1），适用于体重从5 g到150 g的无尾类动物；体型更大的动物可能需要不同规格的注射器和针头。注射部位因激素种类而异，有些激素需进行肌肉内、腹腔内、皮下或皮内注射（图7）。
以摘除卵巢为目的的外科手术是多种两栖动物中获取卵母细胞用于胚胎学研究的常用方法。在种群控制以及诸如卵滞留等医学问题的情况下，也可能需要进行卵巢切除术。对于出于研究目的而实施的部分卵巢切除术（即卵母细胞采集），手术必须确保动物仍保留生殖能力。研究表明，PGF2α 在解决雌性R. muscosa卵滞留问题方面具有一定潜力。在若干个体中，PGF2α 可诱导先前滞留的卵子完全排出，但在其他个体中仅实现部分排出，仍需通过人工挤压方式清除全部卵子。尽管PGF2α可能作为R. muscosa卵滞留的非手术替代方案，但其对其他两栖动物类似病理状况的疗效仍需针对不同物种进行验证。当无尾目或有尾目动物必须接受外科干预时，在实施切口前必须确保动物已达到充分的麻醉深度。需要具备敏锐的观察能力，以评估和监测本研究中所述各分类群正常的诱导麻醉及恢复反应。一旦熟悉特定解剖结构、合适的手术入路、止血方法、轻柔的组织操作以及充分的术后管理，生殖系统手术将不会构成难以克服的障碍。&#160;

两栖动物长期以来被众多研究领域公认为重要的生物学和医学模型。通过对特定物种（如Xenopus laevis和X. tropicalis&#160;、豹蛙（Lithobates（曾归类为Rana）pipiens）&#160;以及墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum））的研究所获得的数据，已被应用于包括人类在内的多种其他脊椎动物物种的研究中&#160;。从这些及其他两栖动物研究中发展出的兽医护理、饲养管理以及辅助生殖技术，为圈养条件下珍稀种群的有效照护、维持与可持续繁育提供了重要支持1,2,3,4。
人们对结合使用就地保护和迁地保护策略以扭转许多濒危两栖动物物种灭绝趋势的兴趣日益增加1,2本文提供了目前可用于监测和调控无尾目模式物种两栖动物卵巢功能的方法学。&#160;和尾状核. 此外，还介绍了针对卵滞留这一常见生殖系统病理的现有技术。
与许多分类群一样，两栖动物的卵巢调控涉及环境与生理之间一系列高度同步的相互作用。温度和光周期（称为近端信号）由眼睛和大脑解码，并迅速转化为基因、激素和昼夜节律过程（终极信号）3,4。本文所述用于监测和控制卵巢功能的方法包括侵入性和非侵入性技术。机构动物护理与使用委员会（IACUC）对研究和教学的要求将非侵入性技术定义为不会引起明显或任何身体疼痛或精神痛苦、且无需使用镇痛药物的技术5。此处，非侵入性技术包括视觉检查与触诊、行为观察、形态测量评估以及超声检查。相反，采血、激素给药以及手术（卵巢切除术和滞留卵子的取出）则被归类为侵入性技术，因为这些操作可能引起一定程度的疼痛或不适，并需要麻醉或术后药物治疗。
对于大多数圈养两栖动物而言，无创性卵巢监测技术可轻松融入日常护理程序中。根据物种不同，通过简单的目视检查即可判断卵巢怀卵情况（如玻璃蛙）。在其他情况下，触诊可能有助于判断雌性是否怀卵。目前已有多种体况指数（BCI），如体重、吻肛长（SUL）、吻肛长（SVL）和标准质量指数（SMI），可用于预测是否存在卵子4,6,7,8,9。然而，在结果解读时应谨慎，因为大多数指数未考虑年龄、体型或身体组成（例如滞留水分与卵巢质量或脂肪含量）6。通过超声检查可实现明确的生殖诊断，并更深入地了解卵子发育情况及卵巢周期的分期4,7。超声检查还可用于确认和监测生殖系统病理变化及相关生理状况4, 8。
除了提供健康状况信息外，采血还可用于测定生殖激素。如果激素谱分析是最终目标，则必须避免可能干扰系统性类固醇数据的应激相关影响。尽管这是一种潜在的强大监测工具，但目前尚无研究证明任何两栖动物物种对外源性激素给药存在内在的内分泌反应。血液可安全地从多个部位采集；在蛙类中，包括腹腹部静脉、舌下血管丛、股静脉和心脏9, 10。在有尾目动物中，血液则从尾腹静脉采集。在为两栖动物患者选择采血技术时，需考虑侵入程度、所需固定程度、是否需要麻醉、目标器官的脆弱性以及动物体型等因素。本文将介绍由 Forzan 等人最初描述的从蛙类面部上颌静脉或肌皮静脉采血的技术9。
卵巢调控具有物种特异性，因此激素处理方案应进行测试并优化。除季节性及其相关的循环激素环境外，卵巢调控还可能与年龄、圈养时间以及反复激素给药的暴露密切相关，但目前文献中关于这些因素的信息十分有限。11,12,13采用激素疗法诱导繁殖行为、配子生成、成熟及产卵已成为解决圈养条件下常见繁殖问题的常用方法4,8,14,15,16由于控制脊椎动物繁殖的机制高度保守，许多在其他分类群中治疗性使用的激素、神经肽以及市售药物也可在多种两栖动物物种中可靠地应用。表1促性腺激素释放激素（GnRH）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）（或其变体，即PMSG和eCG）17, 18，单独或联合使用，已广泛应用于两栖动物圈养繁殖项目中，包括：南落基山脉北方（Anaxyrus boreas boreas)4,19,20；蟾蜍，暗色地鼠蛙， Rana sevosa （Langhorne 等，未发表）7；墨西哥湾水狗， 泥螈属 beyeri20；怀俄明蟾蜍， Anaxyrus baxteri18；牛蛙， Rana catesbiana21；美洲蟾蜍， Anaxyrus americanus22；林蛙， Lymnodyaster tasmaniensis23；波多黎各呱呱蛙， Eleutherodactylus coqui24；非洲爪蟾， 非洲爪蟾25；贡氏小蟾蜍， Pseudophryne guentheri26；北方豹蛙， Lithobates pipiens；阿根廷角蛙， 华丽角蛙 克劳威尔角蛙， C. cranwelli； 美洲地蛙 Odontophrynus americanus27; 和火蝾螈（Salamandra)228类固醇激素（如孕酮，P4）在无尾目动物中的相关报道较少，但在某些物种中已显示出良好的促排卵和产卵效果。16,18,29前列腺素（尤其是前列腺素F₂α（PGF2α）与皮质类固醇共同参与排卵过程30,31,32,34 在排卵期达到高水平31.
在体外研究中，PGF2α 是诱导排卵的有效物质31，而在体内则可诱导Rana muscosa排出滞留的卵子4,30,32。垂体提取物同样能有效诱导排卵15,16,34；然而，由于存在生物安全方面的顾虑以及传播疾病的风险，这一方法在圈养繁殖种群中的应用常受到限制35。
本文最后一部分详细介绍了手术操作，并提供了扩展卵巢研究或辅助解决生殖系统病理问题的替代方法。在两栖动物中，卵巢切除术最常用于获取卵母细胞以进行胚胎学研究。然而，当其他方法失败时，该手术也可用于治疗滞留卵子的问题。尽管该手术具有侵入性，需要完全麻醉并进行切口以暴露卵块，但并不需要实施安乐死。此外，经过部分卵巢切除术后，动物可以完全康复，并在术后继续保持生殖活性8,36。
下述方案概述了无尾目和有尾目动物卵巢控制与监测的侵入性和非侵入性方法。用于展示无尾目技术的具体物种包括R. mucosa和X. laevis。Necturus maculosus、N. beyeri、N. alabamensis和A. mexicanum则是用于描述有尾目相关技术所涉及的物种。

<table><tbody><tr><td>GE logiq Book XP 和 8C-RS 探头 4e10 MHz GE Medical Systems</td><td>GE medical systems</td><td>GE logiq Book XP</td><td>超声</td></tr><tr><td>Aloka 500 7.5mHz 线性或 IBEX 多频（10-6mHz）微凸探头</td><td>GE medical systems</td><td>8C-RS (10 MHz)</td><td>超声探头</td></tr><tr><td>BD 一次性 U-100 胰岛素注射器（28-29 G 针头）</td><td>Mettler Electronics Corp CA</td><td>Sonigel</td><td>超声耦合剂（水溶性，无盐）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;激素&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>促性腺激素释放激素</td><td>BACHEM</td><td>4012028</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH 醋酸盐&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; GnRH</td></tr><tr><td>黄体生成素释放激素</td><td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td><td>4033013;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; L1898</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 醋酸盐；&lt;br/&gt; [D-Ala6}-LHRH 醋酸盐水合物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; LHRH</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>BACHEM, Sigma-Aldrich</td><td>4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 绒毛膜促性腺激素-&amp;beta; (109-145)(109-119)；Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; hCG</td></tr><tr><td>前列腺素 2&amp;alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P40424;</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; (5Z,9&amp;alpha;,11&amp;alpha;,13E,15S)-9,11,15-三羟基前列腺-5,13-二烯酸三盐，PGF2&amp;alpha;&amp;minus;Tris；&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; PGF2&amp;alpha;</td></tr><tr><td>卵泡刺激素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021, F8174</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 猪源、羊源&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; FSH</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46665;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; P7556</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; Vetranal；P4 水溶性&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; P4</td></tr><tr><td>垂体提取物</td><td>na</td><td></td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 查阅相关文献以确认两栖动物物种来源&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; PE</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素</td><td>Prospec;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich</td><td>HOR-272;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 493-10; 9002-70-4</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 孕马血清促性腺激素&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; PMSG</td></tr><tr><td>甲氧氯普胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0763</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 4-氨基-5-氯-N-[2-(二乙氨基)乙基]-2-甲氧基苯甲酰胺，甲氧氯普胺&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; MET</td></tr><tr><td>Lucrin</td><td>BACHEM; Sigma-Aldrich</td><td>4033014;&amp;nbsp;&amp;nbsp; L0399</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 醋酸亮丙瑞林&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; Lucrin</td></tr><tr><td>Lutalyse</td><td>Pfizer</td><td></td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; PGF2&amp;alpha; - 地诺前列酮三甲胺&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; Lut</td></tr><tr><td>匹莫齐特</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1793</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 1-[1-[4,4-双(4-氟苯基)丁基]-4-哌啶基]-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; PZ</td></tr><tr><td>Amphiplex</td><td>见上文</td><td></td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 促性腺激素释放激素 + 甲氧氯普胺&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; GnRH + MET</td></tr><tr><td>Ovopel</td><td>Ovopel</td><td>na</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; GnRHa + 多巴胺受体拮抗剂（每公斤给予 1 粒药丸）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; Ovo</td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Pentair aquatic eco-systems</td><td>Ova10</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 鲑鱼促性腺激素 + 多潘立酮&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; Ova</td></tr><tr><td>多潘立酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D122</td><td>&lt;strong&gt;同义词：&lt;/strong&gt; 4-(5-氯-2-氧代-1-苯并咪唑啉基)-1-[3-(2-氧代苯并咪唑啉基)丙基]哌啶&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;缩写：&lt;/strong&gt; DOM</td></tr></tbody></table>

两栖动物卵巢监测与控制的繁殖技术

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

两栖动物的卵巢调控与监测需要采用多方面的综合方法。目前已有多种应用技术可成功诱导繁殖行为，并获取用于生理学或分子生物学研究的配子和胚胎。两栖动物占脊椎动物研究总量的四分之一至三分之一，在此背景下尤其值得关注的是，它们为科学界理解生殖过程和胚胎发育提供了重要知识。然而，这些知识大多来源于少数物种。近年来，全球两栖动物种群数量急剧下降，促使保护工作者不得不加强干预措施。为应对灭绝风险而不断建立的圈养种群恢复计划和保育种群，使得现有的科研成果和临床应用对于人工饲养条件下两栖动物的生存与繁殖变得极为宝贵。任何圈养种群的成功都依赖于其健康状况、繁殖能力，以及产生具有最广泛遗传多样性的可存活后代的能力。因此，对研究人员和兽医而言，监测并控制卵巢发育与健康状况至关重要。本文重点介绍可用于监测两栖动物卵巢功能，并在适当或必要时对其进行调控的各种辅助生殖技术。理想情况下，应通过科学合理的圈养管理来减少繁殖与健康问题的发生，但与所有动物一样，健康问题和生殖系统病理状况仍不可避免。非侵入性技术包括行为评估、肉眼观察与触诊、形态测量学指标测定以计算体况指数，以及超声成像。侵入性技术则包括激素注射、采血和外科手术。根据具体应用需求和目标物种的不同，卵巢功能的控制可通过多种方式实现。

两栖动物生物学的研究为了解多个分类群生物的生殖、生理、胚胎学和发育过程提供了重要信息。本文全面介绍了可用于研究两栖动物卵巢调控与监测的各种方法学。

两栖动物的卵巢调控与监测需要采用多方面的综合方法。已有多种应用可成功诱导繁殖……

该卵巢切除技术采用可恢复的外科手术方法，用于获取两栖动物卵母细胞，以开展医学研究或用于治疗卵滞留等病理状况的其他应用。该方法无需通过安乐死来获取用于研究的两栖动物卵母细胞。事实上，在进行部分卵巢切除术后，两栖动物在恢复后仍可具备生殖活性。确认对后肢进行夹捏无反应后，将麻醉的雌性无尾目动物置于仰卧位，用无菌湿纱布蘸取聚维酮碘溶液擦拭手术区域，持续10至15秒。在手术区域覆盖透明无菌塑料手术巾，并通过保持周围皮肤湿润以减少蒸发。然后使用15号或11号手术刀片，在肩部与泄殖腔之间的体腔中线处做一长约3毫米的正中旁皮肤切口。根据需要，使用棉签对切口周围的小血管施加局部压力以止血，并提起腹膜，进行下一步的腹膜切口。使用眼睑拉钩牵开体腔切口，切除部分卵块，无需结扎任何血管。对于完整的卵巢切除术，需电凝周围血管，并使用单丝缝线以间断外翻缝合方式关闭体腔切口。不同种类的两栖动物（例如这里的钝口螈和玻璃蛙）表现出不同程度的皮肤透明性，这会影响经皮观察其生殖状态的能力。在某些物种中， gravid（怀卵）雌性与刚产卵后的雌性之间可观察到形态学差异。在此示例中，刚产卵的山区蛙（Rana muscosa）雌性可通过其皮肤松弛及体型较纤细的特征，与怀卵雌性相区分。山区蛙（Rana muscosa）产卵行为的各个阶段包括求偶，即雄性主动追逐雌性，以及抱对，即雄性爬上雌性背部并牢固地抱住雌性。抱对期间，雄性以轻柔泵压的方式挤压雌性。雌性卡纳尔河蛙（Rana muscosa）会四处移动并表现出间歇性的倒立行为，最终倚靠在可附着卵的物体表面，同时雄性剧烈地挤压其腹部。产卵后，雌性卵巢立即恢复至第一阶段。在此期间，进行超声检查时卵泡难以观察。第二阶段表现为卵巢内出现散在的回声点。第三阶段的特征是出现更大、更圆的回声点，且具有暗色中心，提示为含卵黄的成熟卵泡。在此次对圈养雌性泥螈（Necturus）为期四年的代表性评估中，卵子发育情况良好，但并未确保产卵成功。部分雌性个体出现卵滞留并伴随体腔积液，表现出明显的腹部膨大和肿胀，以及一些血管破裂的迹象，如图中受影响的蛙属（Rana）和泥螈（Necturus）所示。尽管手术方法可用于治疗卵巢病理状况，但该技术也可应用于配子及脐带相关研究。手术后，操作者可返回本文所述的第一个方案，以监测两栖动物受试者的持续整体健康状况。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

两栖动物卵巢监测和控制的生殖技术

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人类精子中Ca2+信号成像技术

学习可恢复性卵巢切除术技术，用于两栖动物卵巢监测与生殖健康研究，无需安乐死即可获取卵母细胞。该方法支持术后生殖能力恢复，适用于无尾目雌性动物的生殖生物学与病理管理研究。

两栖动物卵巢监测与控制的繁殖技术

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