通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8⁺ T细胞

该方法有助于解答T细胞免疫学及病毒载体疫苗开发领域中的关键问题。此方法的主要优势在于仅需少量血液，即可实现对同一只小鼠进行多次重复检测。此外，还可从同一样本中检测病毒特异性和转基因特异性的CTL。

演示该实验操作的人员为技术员 Jasmine Rinnofner 和研究生 Annika Rossler。样本的测量与分析由博士后 Zoltan Banki 负责。首先，根据文本方案安全地固定小鼠。

从大鼠尾静脉采集20微升血液至EDTA包被的试管中。处理脾细胞时，分离脾脏，并用注射器活塞将组织通过细胞筛滤器压碎。完成红细胞裂解后，计数细胞并调整样品浓度。

为每个样本准备并标记一个流式管，将100微升器官悬液或20微升血液转移至管中。处理脾细胞时，将器官悬液离心5分钟，弃去上清液，然后涡旋振荡管子以重悬细胞沉淀。

对于将要使用的每个通道，还需准备一个用于补偿样品的Facs管。另准备一份未染色对照样品。准备一管含有最佳稀释浓度四聚体的Facs缓冲液，并涡旋混匀。

接下来，向每个样本中加入 50 µL 四聚体稀释液，并涡旋混匀。向补偿对照和未染色样本中加入不含四聚体的流式缓冲液。随后，将样本在 37 °C 避光条件下孵育 20 分钟。

在样本孵育的同时，向离心管中加入流式缓冲液。然后，根据文本方案中表2指定的稀释比例，将抗体加入缓冲液中，并涡旋混匀溶液。根据具体科学问题的不同，除本文所述的标记物组合外，也可使用其他标记物组合。

务必在检测面板中始终包含针对 CD3 和 CD8 的抗体。每个通道准备一支含有 200 µL FACS 缓冲液的试管，并分别加入 1 µL 对应荧光标记的 CD8 抗体稀释液，涡旋混匀。然后，按照文本方案中所述条件保存抗体稀释液。

为了洗涤样品，向样品中加入一毫升 FACS 缓冲液并离心。然后弃去上清液，并用纸巾吸干残留液体。处理血液样本时，在去除残留液体时需格外小心。

在裂解红细胞之前，血液不会粘附在试管底部。或者，可吸去上清液。接着，向每个细胞沉淀中加入50 µL抗体溶液，并轻轻涡旋混匀。

向每种补偿混合物中加入50 µL对应的补偿对照，向未染色对照的细胞沉淀中加入50 µL Facs缓冲液，轻轻涡旋混匀。处理脾细胞时，抗体染色后直接用一到二毫升Facs缓冲液洗涤样本，并离心五分钟。然后弃去上清液，将残留液体在纸巾上吸干。

向每份血液样本中加入 500 微升 ACK 缓冲液，轻轻涡旋混匀。然后将样本在室温下避光孵育五分钟。向样本中加入一毫升 Facs 缓冲液，离心。

然后，弃去上清液，并用纸巾吸干残留液体。充分裂解红细胞是进行流式细胞术检测的关键步骤，因此，若沉淀较湿，需重复红细胞裂解步骤。随后，再次按照前述方法洗涤样本。

然后，弃去上清液，并将残留液体在纸巾上沥干。固定前，确保细胞充分重悬，以防止形成团块。向每管中加入 150 至 300 微升的流式固定缓冲液，并涡旋混匀。

然后，尽快进行流式细胞术检测。首先，检测补偿对照并校正任何光谱重叠。随后，设置连续的门控以筛选 CD3 阳性和 CD8 阳性细胞。

使用前向散射面积和侧向散射面积对淋巴细胞进行设门。然后，在淋巴细胞群体内，通过前向散射宽度与面积的关系对单个细胞进行设门。利用 CD3 和 CD8 通道绘制单细胞淋巴细胞图。

通过圈选CD3阳性与CD8阳性细胞来鉴定CD8阳性T细胞。确保在圈门时包含CD8低表达细胞。对CD3/CD8阳性细胞进行分析是本方案中的关键步骤。

由于细胞活化常导致 CD3 和/或 CD8 的表达下调，因此也应包含 CD3/CD8 低表达的细胞。随后，将 CD8 阳性细胞与四聚体阳性细胞进行点图分析，并圈定 CD8 阳性/四聚体阳性的细胞群。如有可能，应为每个样本在 CD3 阳性和 CD8 阳性门控中记录 20,000 个细胞。

最后，将测量结果保存为 FCS 文件。在本方案中，定量检测了血液和组织样本中的抗原特异性 CD8+ T 细胞。在圈选 CD3 阳性和 CD8 阳性细胞后，鉴定出四聚体阳性细胞。

将两种不同的四聚体混合在同一管中进行染色，可同时定量两种不同特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。采用该方案，仅需少量血液即可对同一小鼠的T细胞应答进行长期动态监测。此外，还可分析抗原特异性CTL的表型特征。

在进行该操作时，重要的是避免过长的孵育时间，因为这可能导致T细胞受体的内化。自从四聚体技术被发现以来，四聚体染色已成为T细胞分析的重要工具，并已拓展出广泛的应用，包括四聚体的不断积累。光明的四聚体拥有光明的未来。