一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统

大家好。BW报告系统可用于研究受体-配体相互作用。在特定受体的配体未知，或使用内源性配体进行实验存在技术困难的情况下，该系统尤为有用。该方法对单个受体具有高灵敏度和特异性，操作简便且可重复。

本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Shira Kahlon 演示。转染前一天，将 10 块培养板每孔接种 10 毫升含 100,000 个 BW5147 细胞的 RPMI 培养基。然后取 100 微克 pcDNA3 质粒放入离心管中。

向离心管中加入 pH 5.3 的乙酸钠。随后，向质粒混合物中加入 2.5 倍体积的 100% 乙醇。然后在 -20 摄氏度下孵育质粒混合物过夜。

接种BW细胞24小时后，将细胞收集至两个50毫升离心管中。在515 ×g下离心5分钟，弃去上清液。用不含添加物的RPMI重悬细胞沉淀，并重复离心步骤。

将所得沉淀重悬于1毫升无添加物的RPMI培养基中。将重悬后的沉淀转移至冰上放置的4厘米比色皿中。离心经乙醇沉淀的质粒。

然后用一毫升70%乙醇洗涤质粒，并再次离心20分钟。除去全部乙醇，让沉淀部分干燥。

然后将沉淀重悬于100 µL预热的RPMI培养基中（不添加任何成分）。随后，将重悬的质粒加入电转杯中的细胞内。将细胞置于冰上孵育5分钟。

接下来，对细胞进行电穿孔。然后将电穿孔后的细胞转移至一个50毫升离心管中。向管中加入50毫升完全培养基，并在515 ×g 条件下离心5分钟。

弃去上清液，将细胞重悬于50毫升完全培养基中。随后将细胞接种至24孔培养板中，于37℃孵育48小时。之后，向每孔加入1毫升完全培养基，其中添加G418至终浓度为10毫克/毫升。

48 小时后，弃去每孔上清液 1 毫升。然后向每孔中加入 1 毫升完全培养基，其中添加 G418 至终浓度为 5 毫克/毫升。将 50,000 个转染的 BW 细胞与其目标细胞共同培养，接种于 96 孔板的单个孔中。

将培养板孵育48小时，然后在-20摄氏度下冷冻。用抗小鼠IL-2抗体包被ELISA板。

每孔中加入50微升PBS溶液，内含0.5微克抗小鼠IL-2。将包被好的酶标板在4摄氏度下孵育过夜。使用37摄氏度的短暂孵育步骤，以解冻先前与靶细胞共孵育的冻存BW细胞。

然后离心该板，并将每孔中的100微升上清液转移至预先包被的ELISA板中。在37摄氏度孵育两小时。随后向ELISA板中加入生物素标记的抗小鼠IL-2。

孵育并洗涤后，向孔板中加入HRP标记的链霉亲和素。再次孵育并洗涤后，向ELISA板的每个孔中加入100 µL TMB底物溶液。最后在650 nm处读取ELISA板的吸光度。

在此示例中，CLL 细胞首先与不同的抗 CD20 抗体预孵育，然后与转染并表达 Fc 受体 CD16 的 BW 细胞共孵育，再通过 ELISA 进行分析。ELISA 分析后，对结果进行定量。

根据标准曲线，将光密度值转换为小鼠IL-2浓度。在另一项实验中，将不同剂量的抗CD20抗体与CLL细胞预先共孵育，然后与转染的BW细胞共同孵育。

该实验包含四个主要部分：克隆、BW细胞转染、激活和ELISA。每个部分都应独立进行验证。

采用此方法后，可对表达内源性受体的细胞进行其他实验，例如利用自然杀伤（NK）细胞杀伤酸性细胞，以研究其与NK细胞受体的相互作用。我们已利用该系统发现了NK细胞受体的新配体。例如，血凝素是NKp46的配体，而PVL是TG的配体。