Name: 一种研究受体配体相互作用的 bw 报告系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 了解BW报告系统在研究受体配体相互作用中的应用，该方法利用转染的BW5147细胞通过IL-2分泌检测受体激活水平。这一敏感且特异的系统适用于配体未知或实验困难的情况，为免疫学和细胞生物学研究提供可靠的定量分析工具。

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作者感谢 Esther Singer 提供的语言编辑服务。本研究由欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP/2007-2013）资助，项目编号为 320473-BacNK。额外支持来自规划与预算委员会和以色列科学基金会的 I-CORE 项目，以及染色质与RNA在基因调控中的 I-CORE 项目、GIF 基金会、Lewis 家族基金会、ICRF 教授职位资助、赫尔姆霍兹以色列资助和 Rosetrees 信托基金（以上各项资助均授予 O.M.）。本研究还获得了以色列科学基金会（资助号 502/15）、Kass 医学研究奖以及以色列血液学与输血医学学会研究基金（授予 S.E.）的支持。O.M. 是分子免疫学 Crown 教授。

1. 表达嵌合构建体的质粒的构建
注意：目的是构建一种质粒，使其表达目标受体的胞外域，并与小鼠 CD3ζ 链的跨膜区和胞内区相融合（图 2A）。
<ol>
	<li>获取目标受体胞外域的序列，包括信号肽。获得预期可表达该受体的DNA材料例如， cDNA 或质粒）</li>
	<li>获取表达小鼠 CD3ζ 链跨膜区和胞内区的 DNA 材料（例如cDNA 或质粒）</li>
	<li>根据所示的通用结构设计融合蛋白的序列 图2A确保整个序列处于同一密码子阅读框内。该序列用于设计合适的引物并验证最终产物。</li>
	<li>设计两对PCR反应，分别扩增融合蛋白的各个片段图2B, 2C)10. 
	注意：PCR 反应的具体条件（例如引物的性质（如延伸时间和退火温度）取决于为特定受体设计的引物序列。
	<ol>
		<li>扩增受体的胞外区段。
		<ol>
			<li>设计一个5'引物，其中包含受体信号肽的一部分、Kozak共有序列以及一个合适的限制性酶切位点（图2B).</li>
			<li>设计一个位于融合蛋白两部分外侧的3'引物（图2B例如，初始设计时，该3'引物可包含受体胞外段的最后20个碱基对以及CD3ζ片段的前9个碱基对。 
			注意：无需在3'引物中添加限制性酶切位点，因为该引物用于生成融合序列，不用于连接反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>扩增CD3ζ片段。
		<ol>
			<li>设计一个位于融合蛋白两部分外侧的5'端引物（图2C例如，在初始设计中，5'端引物可包含受体胞外段的最后9个碱基对以及CD3ζ段的前20个碱基对。 
			注意：无需在5'引物中添加限制性酶切位点，因为该引物将用于生成融合序列，不用于连接反应。</li>
			<li>设计一个3'引物，该引物应包含CD3ζ序列的末端以及一个合适的限制性酶切位点（图 2C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>修正这两个反应中的引物序列，使每对反应的退火温度相近（注意：该引物包含融合蛋白两部分的序列，在每个反应中仅与部分序列退火）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前两轮PCR产物的混合物作为DNA模板，以外部受体区段的5'引物（步骤1.4.1.1）和CD3ζ区段的3'引物（步骤1.4.2.2）进行一次额外的PCR反应图2D)10该反应应产生最终的融合序列。</li>
	<li>按照常规克隆步骤进行操作。
	<ol>
		<li>将最终的PCR产物连接至目标切割载体（目标载体通常为pcDNA3，可表达G418和氨苄青霉素抗性）。</li>
		<li>将连接后的载体转化至感受态细菌中11.
		<ol>
			<li>将50 µL感受态细菌置于冰上解冻。</li>
			<li>将连接后的载体加入细菌中，冰上孵育 20 分钟。</li>
			<li>在 42 °C 下孵育 45 秒。</li>
			<li>加入200 µL不含抗生素的LB培养基。</li>
			<li>37 °C下持续振荡孵育1小时。</li>
			<li>在含有适当抗生素的LB平板上接种例如，含终浓度为 0.1 mg/mL 的氨苄青霉素溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在15 mL离心管中，收集并培养数个细菌菌落在5 mL LB培养基中。</li>
		<li>第二天，使用质粒小提试剂盒提取质粒。</li>
		<li>使用限制性内切酶分析基因插入片段。</li>
		<li>对相关菌落进行测序，验证序列及读码框正确（如步骤1.3所述）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将验证后的质粒转化至感受态细菌中11.
	<ol>
		<li>将20 µL感受态细菌冰上解冻。</li>
		<li>将1 µL质粒加入细菌中，冰上孵育20分钟。</li>
		<li>42 °C 下孵育 45 秒。</li>
		<li>加入200 µL不含抗生素的LB培养基。</li>
		<li>37 °C下持续振荡孵育1小时。</li>
		<li>在含有适当抗生素的细菌生长平板上接种菌种例如，含终浓度为 0.1 mg/mL 的氨苄青霉素溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天，在含有0.1 mg/mL氨苄青霉素的大量LB培养基中培养细菌菌落（约250 mL）。</li>
	<li>第二天，根据试剂盒提供的具体说明进行大提粒。 
	注意：电穿孔实验需要大量质粒，具体要求如下。</li>
</ol>
2. 将表达嵌合蛋白的质粒转染至BW细胞
注意：也可采用其他方法进行转染（例如，通过慢病毒感染）。在电穿孔之前，按以下方法对DNA进行乙醇沉淀。后续步骤需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>前一天，准备 BW5147 细胞（&#34;BW细胞&#34;用于电穿孔。将10个10 cm培养皿中每个加入10 mL细胞悬液，细胞密度为100,000个BW5147细胞/mL（即， 共计 10 × 106 细胞）用添加了10%胎牛血清（FCS）、1%丙酮酸钠、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基悬浮&#34;完全培养基&#34;).</li>
	<li>将表达融合蛋白的 pcDNA3 质粒 100 µg 置于 1.5–2 mL 离心管中，加入 pH 5.3–5.5 的 3 M 醋酸钠溶液。醋酸钠溶液的体积应为 100 µg 质粒溶液体积的 0.1 倍（即 10%）；使用 pH 计，通过添加 NaOH 或 HCl 调节醋酸钠溶液的 pH 值。</li>
	<li>将2.5倍体积的100%乙醇加入质粒与乙酸钠的混合物中（总体积为质粒和乙酸钠体积之和的2.5倍），具体操作如步骤2.2所述。在-20 °C下孵育过夜，或在70 °C下孵育2小时。</li>
	<li>2.4. 在 BW 细胞接种后 24 小时，将所有 BW 细胞（约 100 mL）收集至 2 个 50 mL 离心管中。在 515 × g 条件下离心 5 分钟。 g 弃去上清液。</li>
	<li>将两个离心管中的沉淀物重悬于一个50 mL离心管中的25 mL RPMI-培养基中。例如，先用25 mL RPMI-培养基重悬其中一个管中的沉淀物，然后用该液体将另一个50 mL离心管中的沉淀物重悬，从而使来自BW细胞的全部沉淀物最终重悬于单个离心管中的25 mL培养基中。 
	注意：培养基中不应添加任何成分，因为血清可能干扰电穿孔。</li>
	<li>再次以 515 x g 离心细胞 5 分钟 g将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并将悬液转移至冰上的0.4 cm比色皿中。</li>
	<li>将经过乙醇沉淀的质粒（步骤 2.3）在 16,000 x g 条件下离心 30 分钟 g 和 4 °C。</li>
	<li>用1 mL 70%乙醇洗涤一次，再于16,000 x g离心20分钟 g 以及 4 °C（用于洗去盐分）。</li>
	<li>去除全部乙醇，让沉淀物略微干燥（即， 在组织培养罩内的开放管中，用100 µL预热至60 °C的RPMI重悬沉淀。</li>
	<li>将重悬的质粒（步骤 2.8）加入电转杯中的细胞，冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>在0.23 kV、250电容条件下对细胞进行电穿孔，持续时间约为4毫秒。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞转移至50 mL离心管中，加入50 mL完全培养基，于515 × g离心5分钟 g. </li>
	<li>弃去上清液，用50 mL完全培养基重悬细胞。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞接种于24孔培养板中（每孔1 mL，共约50孔），在37 °C、5% CO₂条件下培养。2 48 小时。</li>
	<li>使用抗生素筛选转染细胞。转染48 h后，向每孔加入1 mL含10 mg/mL G418的完全培养基（此时每孔终体积为2 mL，G418的终浓度为5 mg/mL）。 
	注意：如果质粒含有不同的抗生素抗性基因，在进行此步骤之前，需确定杀死未转染的BW细胞所需的抗生素浓度。</li>
	<li>每48小时，小心弃去每孔上层1 mL培养基，注意不要搅动孔内培养液（BW细胞倾向于沉在孔底）。向每孔中加入含5 mg/mL G418的完全培养基，使每孔终体积再次达到2 mL。</li>
	<li>定期检查培养板中所有孔的细胞生长情况。 
	注意：培养基颜色变为黄色可能有助于识别正在生长的细胞；然而，由于G418本身的作用，培养基在初期即呈黄色。需识别出阳性孔（即有细胞生长的孔），这些孔中的细胞具有G418抗性，因此预期可表达融合蛋白。该过程通常需要约3周时间。</li>
</ol>
3. 验证阳性孔中细胞转染受体的表达。
<ol>
	<li>使用针对转染受体的特异性抗体对转染的 BW 细胞进行染色。</li>
	<li>通过流式细胞术比较转染受体的表达水平与对照细胞（未转染的 BW 细胞）的表达水平。</li>
	<li>在验证一个或多个孔后，立即使用细胞进行实验，或继续培养，或冻存以备将来使用。</li>
	<li>在开展新的实验前，需验证转染受体的表达。经过数周培养后，对于已稳定表达受体的细胞，可从培养基中去除 G418。</li>
</ol>
4. 转染BW细胞与靶细胞的共孵育
注意：首次使用转染的 BW 细胞时，最好用表达目的受体已知配体的靶细胞，或用针对目的受体的特异性板结合抗体（交联实验；见下文第 4.2.1.3 节）对其进行测试。
<ol>
	<li>建议在实验前 24 小时传代 BW 细胞（例如，在新的 10 cm 培养皿中，向 2 mL 培养细胞中加入 10 mL 完全培养基）。</li>
	<li>将转染的 BW 细胞与其靶细胞共同孵育。同时对表达空载体（或亲本）的对照 BW 细胞进行实验。优先使用 96F 板（但也可使用 96U 板）。实验需设三个重复。所有细胞均悬浮于完全培养基中。
	<ol>
		<li>准备靶细胞。靶细胞的类型根据实验目的而定，可以是细胞、预先与抗体孵育的细胞，或单独的抗体。该系统也已用于以细菌作为靶标5。
		<ol>
			<li>若靶细胞为增殖性细胞（即细胞系），在检测前以 6,000 rad 剂量辐照。将 50,000 个靶细胞加入 96 孔板的单个孔中（体积为 100 µL）。</li>
			<li>对于使用抗体及表达人源 FcγR 的 BW 细胞的实验，将靶细胞与抗体在冰上于 96 孔板中孵育（例如，50 µL 靶细胞与 50 µL 抗体混合；可测试不同浓度的抗体）。</li>
			<li>若单独使用抗体作为靶标（交联实验），应使抗体包被于孔板表面。为此，首先将抗体溶于完全培养基中，在 96F 板中于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 1–2 小时（通常起始剂量为 50 µL 中含 0.5 μg 特异性抗体）。孵育后洗涤孔板以去除未结合的抗体。 
			注：在此情况下，96F 板可促进抗体与孔板的结合，随后加入转染的 BW 细胞后可激活转染的受体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入 BW 细胞（效应细胞）。将 50,000 个 BW 细胞加入 96 孔板的单个孔中（体积为 100 µL）。</li>
		<li>如有需要，将每孔总体积补至 200 µL。</li>
		<li>将板置于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 48 小时（此时间可根据需要调整）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育 48 小时后，将板置于 -20°C 冻存，ELISA 检测前解冻，或直接用于 ELISA（见下一步骤）。</li>
</ol>
5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
<ol>
	<li>用抗小鼠IL-2抗体（anti-mIL-2）包被ELISA板。每孔加入50 µL 1×PBS缓冲液，其中含0.05 µg anti-mIL-2。将包被好的ELISA板在4 °C孵育过夜，或在37 °C孵育2小时。 
	注意：若要在孵育步骤结束后直接进行ELISA，应在BW细胞孵育周期结束前24小时包被ELISA板。</li>
	<li>弃去ELISA板中的液体，每孔加入200 µL封闭液（由1x PBS和1%牛血清白蛋白（BSA）组成）。室温孵育ELISA板2小时。</li>
	<li>用 0.05% PBS Tween 溶液洗涤 ELISA 板三次（即， 1 升 1× PBS 中加入 0.5 mL Tween-20。</li>
	<li>取已与靶细胞共孵育的BW细胞96孔板（4.3）。若该板曾冷冻保存，需完全解冻（例如，通过在37°C短时间孵育）。将96孔板离心（5分钟，515 × g) 并小心地将每孔中的100 µL上清液转移至预先包被并封闭的ELISA板中。 
	注意：应从每个孔的侧边收集上清液，以避免吸出细胞。</li>
	<li>如有需要，可将已知浓度的重组mIL-2加入包被ELISA板的一个空行中，以生成mIL-2的标准曲线。例如，从2,500 pg/mL的mIL-2浓度开始，随后每孔浓度依次降低50%；最后一孔不添加mIL-2。</li>
	<li>将ELISA板在4 °C孵育过夜，或在37 °C孵育2 h。</li>
	<li>用 PBS Tween 洗涤 ELISA 板四次。</li>
	<li>向ELISA板中加入生物素标记的抗小鼠IL-2抗体。使用浓度为1 µg抗体溶于1 mL含1% BSA的1x PBS中，每孔加入100 µL。</li>
	<li>室温孵育1小时。</li>
	<li>用 PBS Tween 洗涤 ELISA 板六次。</li>
	<li>加入HRP标记的链霉亲和素。使用浓度为1 µL链霉亲和素溶于1 mL含1% BSA的PBSX1中，每孔加入100 µL。</li>
	<li>室温孵育30分钟。</li>
	<li>用 PBS Tween 洗涤 ELISA 板六次。</li>
	<li>每孔加入 100 µL TMB 底物溶液。此步骤需快速完成，以尽量减少因加入 TMB 时的时间延迟而导致的孔间差异。</li>
	<li>使用酶标仪在650 nm波长下读取ELISA板（若信号较弱，可重复读数）。</li>
</ol>

<ol><li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMandelboim%2C+O+%22Natural+Killer+Cell+Protocols%22">Natural Killer Cell Protocols</a>. , Second edn, Humana Press. 258-262 (2010).</li>
<li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li>
<li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li>
<li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性经济利益。

本文介绍了一种构建报告系统以研究受体-配体相互作用的实验方案（参见该方案的简略形式于1）。该方案包含三个主要部分：嵌合蛋白的克隆，该蛋白包含特定受体的胞外域与CD3ζ的胞内域融合；将表达该融合蛋白的质粒转染至BW细胞；例如，通过电穿孔法）以及通过ELISA定量检测小鼠IL-2。上述各步骤的最终产物均应独立验证：克隆过程应通过测序目标质粒中融合蛋白的完整序列进行验证，BW细胞的转染效果应通过检测BW细胞中目的受体的表达情况进行验证（例如，通过流式细胞术），并且ELISA过程应通过常规阳性对照进行验证（例如，重组mIL-2）以及转染的BW细胞的特异性对照； 即， 表达已知配体的靶点，该配体作用于目标受体（例如, 可使用表达 CD48 的细胞作为表达 NK 细胞受体 2B4 的 BW 细胞的阳性对照。例如，克隆过程可能成功，但 BW 细胞未表达融合蛋白，此时应重复电穿孔操作。或者，若 ELISA 板的信号未高于背景水平（尤其是阳性对照），则转染的 BW 细胞可能未能表达受体（或受体表达丢失），或 ELISA 操作过程中可能出现技术问题。
可在保留该实验基本原理的前提下，对该方案进行若干修改。这些修改包括用于表达融合蛋白的载体、将质粒转染至BW细胞的方法，以及与孵育和ELISA相关的具体参数，例如靶标类型例如， 细胞，抗体， 等等。），靶细胞数量或抗体浓度（相关时）（我们每孔使用 50,000 个细胞，抗体起始剂量为 0.5 µg/孔），孵育时间（我们采用 48 小时孵育），以及转移至 ELISA 板的上清液体积。
该方法具有高灵敏度、高特异性，且易于定量。它非常适合用于筛选特定受体的配体（尤其适用于配体本身尚未被识别的情况）。在制备表达特定受体的转染BW细胞后，可将这些细胞冻存，并在后续实验需要时取出使用。我们及其他研究者已在先前的研究中成功应用该系统探索受体-配体相互作用（例如2,3,5,12,13,14,15,16），并且该系统所得结果已被其他技术验证。该方法还可用于研究抗体对不同人源FcγR受体的激活作用，例如已用于血清中抗病毒抗体6,7,8或抗CD20单克隆抗体的研究9。
由于该报告系统仅表达受体的胞外段，因此本系统获得的结果应通过针对内源性受体的补充实验加以验证，例如利用自然杀伤（NK）细胞进行细胞毒性实验，以研究与NK细胞受体的相互作用。此外，某些配体/受体相互作用可能不会在该报告系统中引发mIL-2的分泌，因而可能被遗漏。同时，与任何实验体系一样，应按照上述方法对多种参数进行结果验证。当需要比较两种实验条件时，这一点尤为重要例如，不同抗体对同一Fc受体的激活）。此外，必须验证特定配体-受体相互作用的敏感性处于系统的线性范围内，否则可能导致信号饱和，从而无法在不同条件下进行有效比较。可通过使用mIL-2标准曲线以及对所测试的配体生成剂量-反应曲线来实现验证（若出现饱和值，应调整实验参数）； 例如，应使用较小体积的上清液进行ELISA分析）。该系统的另一个可能局限性在于所用靶细胞会内源性分泌mIL-2（例如，小鼠T细胞），这会掩盖BW细胞的IL-2分泌。为克服这些仅限于小鼠细胞的极不常见情况，可通过采用不同的报告系统来改进该检测系统（例如，GFP）在靶细胞中不表达。

BW 报告系统是一种用于研究受体-配体相互作用的技术1。当某一特定受体的配体未知，或使用内源性配体进行实验在技术上存在困难时，该系统尤其具有优势。该系统还可用于研究单克隆抗体与人 FcγR 的结合。该方法基于在小鼠 BW 细胞中表达一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白由目标受体的胞外域与小鼠 ζ 链的跨膜区和胞内区融合而成。当合适的受体配体结合后，会诱导小鼠 IL-2 的分泌，后者可通过 ELISA 方便地检测，如图1所示。该方法对特定受体具有高灵敏度和特异性，操作简便且高度可重复，因此可作为研究受体-配体相互作用的补充工具。例如，可用于筛选多种细胞系中是否存在某一特定受体的配体（即使该配体本身尚未被鉴定），或用于检测单克隆抗体或含有抗病毒抗体的人血清对人 FcγR 的激活作用。尽管原代免疫细胞表达内源性 FcγR，但通常难以操作，且通常同时表达多种 Fc 受体。
我们已在多项研究中成功应用该系统来表征受体-配体相互作用。这些研究包括鉴定血凝素（haemagglutinin）为自然杀伤细胞受体NKp46的配体2，鉴定PVR和nectin-2为人和小鼠TIGIT的配体3,4，以及证实具核梭杆菌（fusobacterium nucleatum）可结合并激活人TIGIT5。此外，表达Fc受体的BW细胞已被成功用于检测患者血清中的抗病毒抗体6,7,8。具体而言，我们近期建立了表达人Fcγ受体的BW细胞，用于检测治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）所用抗CD20抗体在Fc受体激活方面的差异9。重要的是，BW报告系统的结果已在互补实验中得到验证。

<table><tbody><tr><td>AccuPrep 质粒小量提取试剂盒</td><td>Bioneer</td><td>K-3030</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IL-2 抗体</td><td>BioLegend</td><td>503702</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 IL-2 抗体</td><td>BioLegend</td><td>503804</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 板</td><td>De-groot</td><td>60-655061</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ml</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Mercury</td><td>MBS3458105GM</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological industry</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Biological industry</td><td>01-340-1B</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biological industry</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记链霉亲和素</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-030-084</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 质粒滤膜型大提纯试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Biological industry</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Biological industry</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>SouthernBiotech</td><td>0410-01</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究受体-配体相互作用的bw报告系统

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

受体与配体之间的相互作用是一种基本的生物学过程。然而，直接使用表达天然受体和配体的细胞进行实验具有挑战性，因为特定受体的配体可能未知，且使用天然配体的实验操作在技术上可能较为复杂。为克服这些困难，我们描述了一种报告系统，用于检测特定受体与目标配体之间的结合及激活。在该报告系统中，特定受体的胞外域与小鼠 CD3ζ 融合，该嵌合蛋白随后在小鼠 BW 细胞中表达。这些转染的 BW 细胞可与不同靶标（例如，细胞或抗体）共孵育。转染受体的激活将导致小鼠白细胞介素-2（mIL-2）的分泌，可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。该报告系统具有高灵敏度和针对单一受体的特异性优势。此外，特定受体的激活水平可被轻松定量，即使在受体配体未知的情况下也可应用。该系统已在我们的多项研究中成功用于表征受体-配体相互作用。我们最近利用该系统研究了临床上使用的不同抗 CD20 单克隆抗体对人 Fcγ 受体（FcγRs）的激活作用。

图3展示了使用BW报告系统实验的结果。在本实验中，CLL细胞预先与不同的抗CD20抗体（利妥昔单抗和奥比妥珠单抗）孵育，随后与转染了表达CD16a-CD3ζ的BW细胞共孵育。类似实验已在我们的研究中开展9。图3A显示了一块原始ELISA板的图像，其中颜色强度对应于mIL-2的浓度。该实验设置三个重复。实验包含多个对照组：CLL细胞与未转染的亲本BW细胞孵育（最上一排），以及CLL细胞与表达CD16a-CD3ζ的BW细胞孵育但未加抗体或加入对照抗体（第二排左侧六个孔）。与对照孔中的mIL-2水平相比，经抗CD20抗体预孵育的CLL细胞与表达CD16的BW细胞共孵育后，显著诱导了mIL-2的分泌。重要的是，与利妥昔单抗相比，抗CD20抗体奥比妥珠单抗对CLL细胞的预孵育更强地激活了CD16，这一已知现象在本系统中得到了重现。最后一排显示了预先设定浓度梯度的重组mIL-2（未添加细胞）。最后一排最右侧孔不含mIL-2，代表背景读数，其信号水平与对照孔相似。图3B展示了对图3A中ELISA板结果的定量分析。根据重组mIL-2的标准曲线，将光密度（OD）值转换为mIL-2浓度。图3C展示了一项剂量反应实验，其中不同剂量的抗体预先与CLL细胞孵育，随后与表达CD16的BW细胞共孵育。
<img alt="靶细胞信号通路示意图，显示通过ELISA检测IL-2；配体-受体相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：BW报告系统示意图。 BW5147细胞被稳定转染，表达不同受体的胞外部分与小鼠CD3ζ链的跨膜区及胞内区融合的嵌合受体（chimeric receptor-CD3ζ）。特定受体-CD3ζ被配体激活后，可分泌mIL-2，该因子可通过ELISA检测。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="受体-CD3ζ 融合 DNA 示意图；信号肽、跨膜区、终止密码子的 PCR 步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：嵌合受体-CD3ζ 的结构及 PCR 引物的设计。 （A）细胞外受体与小鼠 CD3ζ 跨膜区及胞内区融合的通用结构。（B）使用一个在 3' 端同时包含 CD3ζ 核苷酸序列的引物扩增受体的胞外区。（C）使用一个在 5' 端同时包含受体核苷酸序列的引物扩增 CD3ζ 的胞内区和跨膜区。（D）在最终的 PCR 反应中，将上述两个具有重叠序列的片段作为 DNA 模板。在所有图示中，不同的蛋白结构域以不同颜色标注，并用蓝色矩形框（CD3ζ 序列）和红色矩形框（受体序列）标出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ELISA 检测结果；处理样本中 IL-2 的检测。包含吸光度数据及抗体剂量-反应曲线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：BW报告系统最终产物的示意图。 （A, B, C）CLL 细胞经两种抗 CD20 抗体（利妥昔单抗和奥滨尤妥珠单抗）或对照抗体预孵育或不预孵育。随后，将抗体结合的细胞与亲本 BW 细胞或表达 CD16a-CD3ζ 的 BW 细胞共同孵育。通过 ELISA 检测上清液中 mIL-2 的水平。（A）原始 ELISA 板图像。颜色深浅表示上清液中 mIL-2 的浓度。实验设三个重复。下排显示同一块板中分析的重组 mIL-2 递减浓度的 ELISA 读数。（B）图（A）中 ELISA 读数的定量结果。根据 mIL-2 的标准曲线计算 mIL-2 水平。（C）剂量反应实验，将不同剂量的抗体与 CLL 细胞预孵育后，再与表达 CD16a-CD3ζ 的 BW 细胞共同孵育。***，P < 0.001 &lt; 0.001；Student's t 检验（B）或含多重比较的方差分析（C）。在（C）中唯一无显著差异的比较是第一浓度下利妥昔单抗与对照抗体的结果0.01 µg/mL。误差线表示三次重复的实验数据的标准差。类似的实验已作为我们近期一项研究的一部分开展。9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了如何建立一种报告系统，可用于识别和定量受体-配体相互作用。

一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统

受体与配体之间的相互作用是基本的生物学过程。然而，针对表达天然受体的细胞进行直接实验却存在诸多挑战……

大家好。BW报告系统可用于研究受体-配体相互作用。在特定受体的配体未知，或使用内源性配体进行实验存在技术困难的情况下，该系统尤为有用。该方法对单个受体具有高灵敏度和特异性，操作简便且可重复。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Shira Kahlon 演示。转染前一天，将 10 块培养板每孔接种 10 毫升含 100,000 个 BW5147 细胞的 RPMI 培养基。然后取 100 微克 pcDNA3 质粒放入离心管中。向离心管中加入 pH 5.3 的乙酸钠。随后，向质粒混合物中加入 2.5 倍体积的 100% 乙醇。然后在 -20 摄氏度下孵育质粒混合物过夜。接种BW细胞24小时后，将细胞收集至两个50毫升离心管中。在515 ×g下离心5分钟，弃去上清液。用不含添加物的RPMI重悬细胞沉淀，并重复离心步骤。将所得沉淀重悬于1毫升无添加物的RPMI培养基中。将重悬后的沉淀转移至冰上放置的4厘米比色皿中。离心经乙醇沉淀的质粒。然后用一毫升70%乙醇洗涤质粒，并再次离心20分钟。除去全部乙醇，让沉淀部分干燥。然后将沉淀重悬于100 µL预热的RPMI培养基中（不添加任何成分）。随后，将重悬的质粒加入电转杯中的细胞内。将细胞置于冰上孵育5分钟。接下来，对细胞进行电穿孔。然后将电穿孔后的细胞转移至一个50毫升离心管中。向管中加入50毫升完全培养基，并在515 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于50毫升完全培养基中。随后将细胞接种至24孔培养板中，于37℃孵育48小时。之后，向每孔加入1毫升完全培养基，其中添加G418至终浓度为10毫克/毫升。48 小时后，弃去每孔上清液 1 毫升。然后向每孔中加入 1 毫升完全培养基，其中添加 G418 至终浓度为 5 毫克/毫升。将 50,000 个转染的 BW 细胞与其目标细胞共同培养，接种于 96 孔板的单个孔中。将培养板孵育48小时，然后在-20摄氏度下冷冻。用抗小鼠IL-2抗体包被ELISA板。每孔中加入50微升PBS溶液，内含0.5微克抗小鼠IL-2。将包被好的酶标板在4摄氏度下孵育过夜。使用37摄氏度的短暂孵育步骤，以解冻先前与靶细胞共孵育的冻存BW细胞。然后离心该板，并将每孔中的100微升上清液转移至预先包被的ELISA板中。在37摄氏度孵育两小时。随后向ELISA板中加入生物素标记的抗小鼠IL-2。孵育并洗涤后，向孔板中加入HRP标记的链霉亲和素。再次孵育并洗涤后，向ELISA板的每个孔中加入100 µL TMB底物溶液。最后在650 nm处读取ELISA板的吸光度。在此示例中，CLL 细胞首先与不同的抗 CD20 抗体预孵育，然后与转染并表达 Fc 受体 CD16 的 BW 细胞共孵育，再通过 ELISA 进行分析。ELISA 分析后，对结果进行定量。根据标准曲线，将光密度值转换为小鼠IL-2浓度。在另一项实验中，将不同剂量的抗CD20抗体与CLL细胞预先共孵育，然后与转染的BW细胞共同孵育。该实验包含四个主要部分：克隆、BW细胞转染、激活和ELISA。每个部分都应独立进行验证。采用此方法后，可对表达内源性受体的细胞进行其他实验，例如利用自然杀伤（NK）细胞杀伤酸性细胞，以研究其与NK细胞受体的相互作用。我们已利用该系统发现了NK细胞受体的新配体。例如，血凝素是NKp46的配体，而PVL是TG的配体。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种研究受体配体相互作用的 bw 报告系统

我们展示了共轭聚合物聚二乙炔（PDA）与连接在PDA脂质体表面的荧光团之间的荧光共振能量转移（FRET），用于生物分子的检测。PDA脂质体的表面还含有可作为探针的生物分子受体分子。配体-受体相互作用导致荧光团与PDA之间FRET效率的变化，这是该传感机制的基础。...

利用荧光共振能量转移实时监测配体-受体相互作用

本视频展示了基于报告基因检测的受体-配体相互作用分析方法。成功的受体-配体相互作用会激活下游信号通路，导致细胞产生并释放细胞因子作为溶液中的分泌型报告分子，随后通过ELISA进行检测确认。...

基于ELISA的报告基因检测法研究BW细胞中的受体-配体相互作用

在本视频中，使用生物膜力探针（BFPs）来测量受体与配体之间的相互作用力。该技术通过监测破坏探针微球上偶联的pMHC与靶细胞上的TCR之间结合所需的压强，从而检测分子间的相互作用。...

生物膜力探针定量受体-配体相互作用

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

表面等离子体共振（SPR）是一种无需标记、可实时检测生物分子相互作用的方法。本文描述了一项膜蛋白与受体相互作用实验的实验方案，并讨论了该技术的优缺点。...

利用表面等离子共振（SPR）实时测量膜蛋白与受体的相互作用

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

本文介绍了一种从包涵体中复性空肠弯曲菌（Campylobacter...

高效复性和纯化趋化受体配体结合域的方法

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。...

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

了解BW报告系统在研究受体配体相互作用中的应用，该方法利用转染的BW5147细胞通过IL-2分泌检测受体激活水平。这一敏感且特异的系统适用于配体未知或实验困难的情况，为免疫学和细胞生物学研究提供可靠的定量分析工具。

一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统

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