Name: 基于 rna 的人原代成纤维细胞重组成诱导多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 了解基于RNA的人原代成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的高效无饲养层方法。该技术通过优化转染缓冲液pH值，实现难重编程细胞来源的高质量iPSC生成，适用于疾病建模和再生医学研究。

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我们感谢美国国立卫生研究院（T32AR007411-33）和科罗拉多大学皮肤疾病研究核心中心（P30AR057212）提供的经费支持。同时，我们感谢大疱性表皮松解症（EB）研究合作组织、EB医学研究基金会、治愈EB慈善机构、营养不良性大疱性表皮松解症研究协会（DEBRA）国际组织、比利时博杜安国王基金会的Vlinderkindje基金以及盖茨前沿基金的支持。

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</ol>

I.K. 和 G.B. 是一项名为 &#34;细胞重编程的方法与组合物&#34;的专利申请的共同发明人，专利申请号为 PCT/US2016/063258。

本方案描述了一种具有临床相关性的、非整合的、基于RNA的方法，可用于将正常及疾病相关的人成纤维细胞系重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），且效率极高。迄今为止，我们尝试使用该方案进行重编程的每一个人成纤维细胞系均获得了足够数量的高质量iPSCs，可用于后续实验。所获得的iPSCs可立即转移至无饲养层的培养条件下进行扩增。
用于重编程的成纤维细胞质量：
重编程的成功率在很大程度上取决于起始成纤维细胞的质量。理想情况下，应使用代数最低的成纤维细胞以获得最高的重编程效率。第2至第4代的成纤维细胞重编程效率最佳。尽管效率降低，第5至第8代甚至衰老的成纤维细胞仍可进行重编程。有时低代数的成纤维细胞无法获得，或患者样本携带阻碍正常生长的基因突变。在此情况下，可能需要优化初始接种密度。功能受损的成纤维细胞系在RNA转染过程中通常伴随更高的细胞死亡率。因此，在重编程第10至14天时，重编程孔中的细胞会显得稀疏，并可见较大的无细胞区域。若出现此情况，则需以更高的初始成纤维细胞数量重新启动重编程流程。对于大多数成人成纤维细胞系，每孔接种3,000个细胞（6孔板规格）通常效果稳定。然而，如我们先前发表的研究8所述，将接种数量增加至5,000–10,000个（衰老细胞系可增至50,000个）可能有助于改善疾病相关样本的重编程效果。相反，若细胞过早达到汇合状态，也可能对重编程产生抵抗。若在重编程RNA转染过程中细胞增殖过快（如某些原代新生儿成纤维细胞的情况），则应以每孔500个成纤维细胞的密度启动重编程8。
转染缓冲液的处理：
转染缓冲液（用减血清培养基配制，并调节pH至8.2）的pH值对于实现本重编程方案所需的最优转染效率至关重要。因此，建议采取多项措施以正确处理转染缓冲液。我们发现，即使转染缓冲液短暂暴露于空气中，也会影响其pH值。因此，应将转染缓冲液分装至螺口容器中，并尽量减少容器内的空气空间（我们通常使用5 mL或15 mL的螺口锥形管）。为进一步减少空气暴露，建议每份转染缓冲液分装样品最多用于两次转染。最后，由于温度会影响pH值，在组装转染复合物前，必须将转染缓冲液平衡至室温（RT）。切勿将转染缓冲液加热至37 °C。
iPSC 的传代：
尽管许多先前发表的方案建议在重编程结束时挑取单个iPSC克隆，但当重编程效率非常高或克隆聚集在一起时（这在我们的方案中很常见），该操作可能难以实现。因此，如果iPSC克隆彼此靠近，我们建议首先传代细胞，以分散重编程后的iPSC，然后再手动挑取克隆。执行这一早期传代步骤具有多个优势。分散后的克隆拥有更充足的生长空间，从而形成比原始孔中更大、更适合挑取的克隆，显著提高从单个克隆建立iPSC细胞系的成功率。我们还发现，成纤维细胞在共培养中尽管已被稀释，但额外的培养时间似乎可提升挑取所得iPSC克隆的整体质量。未完全重编程的成纤维细胞可能提供支持性的旁分泌因子，有助于iPSC的进一步稳定，并促进其向无饲养层细胞培养条件的顺利过渡。此外，成纤维细胞在mTeSR1培养基中培养时，其增殖能力相比iPSC具有选择性劣势。因此，在3–4次传代后，污染的成纤维细胞群体将迅速被稀释至可忽略的水平。
ROCK 抑制剂（如 Y-27632）常用于人诱导多能干细胞（iPSC）的常规培养。我们发现，某些 iPSC 系长期或频繁使用 Y-27632 培养可能对细胞整体质量产生不利影响。当采用集落传代方法（如使用 EDTA）时，iPSC 分离后无需添加 Y-27632 即可维持其存活率。我们已在所有人 iPSC 的分离、扩增及常规培养过程中完全取消在培养基中添加 Y-27632。
方案的局限性：
该RNA介导重编程方法的一个局限性在于制备重编程试剂的初始成本较高且过程复杂。尽管制备mRNA试剂的各项前期操作均为常规实验步骤，且已有文献报道（如PCR、体外转录、DNase处理、加帽、去磷酸化、纯化），但综合来看，mRNA试剂的制备过程相对耗时，技术难度不容忽视。本方案的另一主要挑战是需要每48小时转染细胞一次，这增加了重编程操作的劳动强度。如果仅需对少量患者样本进行重编程，这些因素可能成为限制条件。然而，如果首要目标是获得具有临床相关性的诱导多能干细胞（iPSCs）或实现极高的重编程效率，则所述的RNA介导重编程方法是理想选择。
综上所述，上述基于RNA的高效重编程方法依赖于待重编程体细胞类型转染效率的优化，具体方法见我们之前发表的文章8。本研究中提供的RNA转染方案已针对人原代成纤维细胞进行了高度优化，但也可根据其他细胞类型进行调整，以提高多种体细胞的重编程效率。

将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）需要持续表达一组核心转录因子，这些因子在维持多能性中起重要作用1,2。在为临床应用制备iPSCs时，必须在处理过程中尽量减少起始细胞的突变负荷，同时在不同患者的样本中保持相对较高的iPSC生成效率。然而，大多数重编程方法（包括无整合的重编程方案）的重编程效率极低，限制了这些方法在临床上的应用价值3。较低的重编程效率还可能导致携带预先存在突变的细胞被选择性地重编程，从而增加所获得iPSCs中的突变负荷。此外，所有基于DNA的重编程方法（如基于慢病毒或附加体型质粒的方法）均存在安全性问题，即外源DNA可能随机整合到基因组中，导致有害的插入突变，并在后续分化的组织衍生物中引发多能性基因的非预期（潜在致癌性）表达4。
一种有望高效诱导体细胞重编程为多能性并降低所获诱导多能干细胞（iPSCs）突变负荷的策略，是使用含有修饰核碱基的合成加帽信使RNA（修饰mRNA）进行重编程5。通过添加胚胎干细胞（ESC）特异性的微小RNA（miRNA）-367/302家族3，可进一步提高基于修饰mRNA的重编程效率，已有研究证明这些miRNA能够更高效地重编程体细胞6,7。然而，即使加入miRNA-367/302家族，基于修饰mRNA的重编程方法在应用于新分离的患者细胞时仍常失败3。为解决该修饰mRNA重编程方法的不稳定性问题，我们近期报道了一种优化的、无整合的策略，可高效诱导人原代成纤维细胞重编程为多能状态，并同时使用编码重编程因子的修饰mRNA和成熟miRNA-367/302模拟物8。在本方法中，重编程用修饰mRNA混合物包含一种OCT4与MyoD转录激活结构域融合的修饰版本（称为M3O）9，以及另外五种重编程因子（SOX2、KLF4、cMYC、LIN28A和NANOG）。将编码多能性因子的修饰mRNA与miRNA模拟物联合使用，在该方案中表现出对重编程效率的协同增强作用。此外，还需对RNA转染程序、细胞接种密度及培养条件进行进一步优化，才能将该方法的重编程效率提升至极高水平8。
与其他许多方案不同，我们的重编程方法通常仅需数千个起始成纤维细胞。此外，许多常见的非整合策略（如使用附加体型质粒、仙台病毒或自复制RNA）需要经过多次传代，以稀释诱导生成的iPSC中的重编程载体。相比之下，修饰的mRNA和成熟miRNA模拟物半衰期较短，可被细胞迅速清除。综上所述，该方法从采集患者样本到获得可用iPSC所需的累积细胞培养时间最短，有效限制了最终iPSC中突变的积累，并提高了成本效益。
本文介绍了利用我们基于组合修饰的mRNA/miRNA方法将成人人类成纤维细胞高效重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的详细分步操作方案8。该基于RNA的重编程方案为科研及潜在的临床应用提供了一种简便、经济且稳健的方法，用于生成无整合的iPSCs。此外，该方法适用于多种成纤维细胞系的重编程，包括难以重编程的、与疾病相关的、衰老的以及衰老相关的成纤维细胞。人类成纤维细胞重编程方案的示意图见图1。本方案具体描述了在6孔板格式中对三孔人类成人原代成纤维细胞进行重编程的操作方法。通常两个孔即可获得足量的高质量iPSC克隆。在许多情况下，仅需一个孔即可完成实验，第三个孔可用于重编程效率的分析。如需要，可按比例扩大孔数。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PCR用质粒模板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_KLF4</td><td>Addgene</td><td>26815</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_SOX2</td><td>Addgene</td><td>26817</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_c-MYC</td><td>Addgene</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_LIN28A</td><td>Addgene</td><td>26819</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hM3O</td><td>Addgene</td><td>112638</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hNANOG</td><td>Addgene</td><td>112639</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_mWasabi</td><td>Addgene</td><td>112640</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;体外转录修饰mRNA及miRNA模拟物&lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正向引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTGGACCCTCGTACAGAAGC&lt;br/&gt; TAATACG</td><td></td></tr><tr><td>反向引物（订购为ultramer，4nmol规格）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&lt;br/&gt; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&lt;br/&gt; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&lt;br/&gt; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&lt;br/&gt; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&lt;br/&gt; CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA&lt;br/&gt; AAGACCA</td><td></td></tr><tr><td>(ARCA加帽) 3&amp;acute;-0-Me-m7G(5')ppp(5')G&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600850-51</td><td></td></tr><tr><td>5-甲基胞苷-5'-三磷酸</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>南极磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>假尿苷-5'-三磷酸</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>Riboguard RNase抑制剂</td><td>Lucigen</td><td>RG90910K</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator</td><td>ZymoResearch</td><td>R1019</td><td></td></tr><tr><td>Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA模拟物</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000684</td><td></td></tr><tr><td>Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA模拟物</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000715</td><td></td></tr><tr><td>Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA模拟物</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000717</td><td></td></tr><tr><td>Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA模拟物</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000718</td><td></td></tr><tr><td>Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA模拟物</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000719</td><td></td></tr><tr><td>水（无核酸酶，未经DEPC处理）</td><td>Fisher</td><td>AM9937</td><td>用于稀释修饰mRNA和miRNA模拟物</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成纤维细胞培养与重编程&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1%明胶溶于H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>StemCell technologies</td><td>#07903</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GV 无菌真空过滤系统</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td>用于无菌过滤转染缓冲液和DPBS中的0.5 mM EDTA</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>6孔板（组织培养处理）</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（FGF Basic）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>phg0263</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax补充剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>用于培养基配制的谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Gibco Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778500</td><td>本方案已针对Lipofectamine RNAiMAX转染试剂优化</td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>低血清培养基，用于调节pH至8.2配制转染缓冲液，500 mL</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>低血清培养基，用于调节pH至8.2配制转染缓冲液，100 mL</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>用无核酸酶水稀释配制1 M溶液，用于pH调节</td></tr><tr><td>水（无核酸酶，未经DEPC处理）</td><td>Fisher</td><td>AM9932&amp;nbsp;</td><td>用于稀释NaOH和清洗pH计</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/两性霉素B混合液（Pen/Strep/Fungizone）</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>人重组层粘连蛋白-521（rhLaminin-521）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>浓度为100 &amp;micro;g/mL，用作重编程过程的基质</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶-EDTA（含酚红）</td><td>Life Technologies</td><td>2520056</td><td></td></tr><tr><td>痘苗病毒B18R（CF）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34-8185-86</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;iPSC培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC认证基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>用于iPSC培养的细胞外基质（ECM）</td></tr><tr><td>EDTA，0.5 M储存液</td><td>K&amp;amp;D Medical&amp;nbsp;</td><td>RGF-3130</td><td>在DPBS中稀释至0.5 mM，过滤除菌，用于iPSC传代</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>多能干细胞（PSC）培养基，可使iPSC相对于成纤维细胞具有生长优势</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体与检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠（HRP偶联）</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-60（小鼠抗人）</td><td>Stemgent</td><td>09-0010</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（30%）</td><td>LabChem</td><td>LC154301</td><td>用PBS稀释至3%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.02</td><td>以10x形式提供，稀释至1x使用</td></tr><tr><td>VECTOR NovaRED 过氧化物酶底物试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;特殊设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;描述&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>常规加湿组织培养孵育箱</td><td></td><td></td><td>使用数字计、fyrite或等效设备校准CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;，平衡孵育箱至5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、37 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>三气加湿组织培养孵育箱</td><td></td><td></td><td>使用数字计、fyrite或等效设备校准CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;，平衡孵育箱至5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、37 &amp;deg;C。用于重编程过程。</td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td>分辨率必须达到小数点后两位。如可能，专用于RNA实验。</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td></td><td>配置为可观察EGFP以监测转染效率。</td></tr></tbody></table>

基于rna的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

诱导性多能干细胞（iPSCs）已被证明是研究人类发育和疾病的重要工具。要将iPSCs进一步推进为再生治疗手段，需要一种安全、高效且快速的重编程方案。本文介绍了一种具有临床相关性的分步操作流程，可利用非整合方法将人皮肤成纤维细胞高效重编程为iPSCs。该方案的核心是通过表达多能性因子（SOX2、KLF4、cMYC、LIN28A、NANOG、OCT4-MyoD融合蛋白）来实现 体外 转录的信使RNA（mRNA）通过修饰核苷酸合成（修饰mRNA）。将重编程修饰mRNA与成熟的胚胎干细胞特异性microRNA-367/302模拟物每48小时共同转染入原代成纤维细胞，持续两周。随后可分离获得的诱导多能干细胞（iPSC）克隆，并在无饲养层条件下直接扩增。为最大限度提高本重编程方案在不同成纤维细胞样本中的效率与一致性，我们优化了多个参数，包括RNA转染方案、转染时间点、培养条件和接种密度。重要的是，本方法可从大多数成纤维细胞来源高效生成高质量iPSC，包括难以重编程的疾病相关、衰老和/或衰老样样本。

从启动成纤维细胞重编程到首次冻存诱导多能干细胞（iPSC）的冻存管，通常需要约5–6周时间（图1）。重编程方案一般可分为两个阶段：第一阶段包括成纤维细胞培养及七次转染，每48小时使用一次重编程RNA混合物；第二阶段包括iPSC克隆的分离、扩增和鉴定。
在启动实验方案之前，应确保待重编程的成纤维细胞具有良好的质量。健康的成纤维细胞应呈纺锤形、双极性且具有折光性，倍增时间约为24小时。在第-2天接种于10 cm培养皿中的250,000个细胞，至第0天时应生长至40–60%融合度（图1，第0天），细胞数量约为6–10 × 105个。对于增殖较慢的细胞，可通过在第-2天和第0天以较高密度接种来弥补。
重编程接种至6孔板中的成纤维细胞应非常稀疏（图2，第1天）。首次转染后24小时，成纤维细胞将失去梭形形态，转变为更圆润的形状（图2，第2天），并在后续重编程过程中维持该形态。mWasabi mRNA的绿色荧光在第2天应仅微弱可见，并在第4天时亮度持续增强至清晰可见。mWasabi荧光的检测能力可能取决于显微镜的灵敏度和设置。在前三次转染期间（第1–6天），细胞密度将逐渐且持续增加，第7至第8天之间会出现明显的增殖高峰。到第10天时，细胞应基本达到汇合状态（图2，第10天）。诱导性多能干细胞（iPSC）克隆最早可在第11天出现（图2，第11天）；然而，部分情况下克隆可能直至第18天才可被观察到。通常在第15–18天，会出现大而明显的iPSC克隆，与周围未完全重编程的成纤维细胞有显著区别（图2，第15天和图3，第17天）。可通过多能性标志物TRA-1-60的免疫染色评估重编程效率（图3，第17天，TRA-1-60）。根据我们的经验，大多数成纤维细胞系每孔重编程后可产生数百个克隆（图3，插图B）。
接种密度不理想是本实验方案中重编程效率降低的最常见原因，通常与病变、衰老和/或高传代的成纤维细胞相关。如果接种密度过低，在重编程结束时会出现较大的无细胞空白区域（图4C），且iPSC克隆可能无法形成（图4D）。重编程细胞在第14天时应达到非常高的汇合度（比较图4A和4B与图2第14天）。同样，如果细胞接种过密或增殖过快，重编程效率也会显著降低。
为了保持患者来源的iPSCs的均一性，从单个克隆扩增细胞系至关重要。由于本方案中的重编程效率非常高，相邻的iPSC克隆可能彼此靠近形成并相互融合生长（图3，第15–17天）。这有时使得通过机械方法分离单个克隆以进行克隆扩增变得困难。我们发现，可先对重编程后的孔进行传代，并将其稀释接种至更大的培养区域。一个合适的传代比例是将一个重编程后的6孔板中的单孔细胞均匀分配至整个6孔板中。
稀释传代后，iPSCs 以克隆形式生长，并可轻易与成纤维细胞区分（图5，第18天）。最初，iPSC 克隆可能排列较为松散，单个细胞具有相对较大的细胞质区域。在随后的4–7天内，iPSCs 增殖并形成具有明确边界的典型紧密排列克隆。克隆内的单个细胞具有较大的核质比，并可见明显的核仁（图5，第22天）。每个孔中应形成大量克隆，仅具有典型 iPSC 形态的克隆应被挑选用于扩增。
<img alt="成纤维细胞重编程时间线；iPSC培养过程示意图；干细胞扩增阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：人成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。 本文展示了一种人成纤维细胞重编程的示意图方案。首先将成纤维细胞以低密度传代至6孔板中的一个孔内，随后每隔48小时进行一次转染，共进行七次。每次转染后16–20小时更换培养基。重编程获得的iPSCs通常在第18天左右首次传代，克隆样细胞集落在第26天左右进行挑取。一般而言，由成纤维细胞衍生的iPSC细胞系可在第38天左右冻存，用于长期保存。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养生长、时间线；形态变化；显微镜图像；每日进展、分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：重编程过程中每日的代表性图像。 在传代时，成纤维细胞的融合度应约为 40–60%，以启动重编程（第 0 天，细胞接种于 10 cm 培养皿中）。第一次转染（T1）发生在第 1 天，此时细胞应非常稀疏。次日（第 2 天），细胞形态将变得更加圆润。随着实验进程推进，细胞密度持续增加，诱导性多能干细胞（iPSC）集落最早可在第 11 天开始出现（以红色圆圈标出）。至第 15 天，iPSC 克隆将变得较大且边界清晰。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="第15-17天显微镜图像中的细胞分化过程；TRA-1-60染色结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：使用重编程修饰mRNA和miRNA模拟物转染后的集落形成。 在第15–17天拍摄了代表性重编程过程的低倍显微图像。在最后一次转染后，重编程的诱导多能干细胞（iPSCs）将形成边界清晰的集落，集落体积逐渐增大并变得更加致密，与未完全重编程的周围成纤维细胞明显区分。对多能性标志物TRA-1-60进行免疫染色可显示iPSCs的存在（插图A），并通过计数单个孔内所有集落来计算重编程效率（插图B，可计数的集落以绿色圆圈标出）。比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分化过程；显微图像，第14天和第17天分析，TRA-1-60染色结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：重编程过程中接种密度不足的代表性图像。（A, B）重编程第14天时成纤维细胞密度过低的示例（与图2第14天对比）。（C）重编程第17天的低倍镜图像，红色圆圈标示出大面积无细胞区域。（D）同一孔细胞经固定并进行TRA-1-60染色，以确认因细胞密度过低导致整体重编程效率较差。比例尺 = 200 µm（A, B），1 mm（C, D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长进程；显微镜图像第18-22天；研究细胞分化；包含比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：iPSCs初次传代后的代表性图像。 在完成重编程修饰mRNA和miRNA模拟物的转染后，重编程细胞在第17–20天进行传代。iPSCs在PSC培养基中具有生长优势，能够迅速取代任何未完全重编程的成纤维细胞。最初，iPSCs会形成集落，可能呈现松散状态且边界不清晰。数天内，细胞迅速增殖，并呈现出典型的形态特征：细胞紧密排列，核质比高，集落边界清晰。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）已被证明是研究人类发育和疾病的有力工具。进一步推动iPSCs在再生医学中的应用……

由于其高效率，该方法可进一步推动诱导性多能干细胞（IPSCs）作为研究人类疾病和开发新型干细胞疗法的工具。本方案的主要优势在于能够从原代人成纤维细胞中生成高质量的无整合IPSCs，包括难以重编程的、与疾病相关的、衰老的以及衰老相关的成纤维细胞。该方法的成功取决于成纤维细胞中RNA转染效率的最优化。调整转染缓冲液的pH值是实现这一目标的关键步骤。首先，使用500毫升和100毫升室温预热的新鲜低血清培养基来配制转染缓冲液。将pH计的玻璃电极插入500毫升瓶中的培养基，测量其基础pH值，并等待最多一分钟后再读取pH值。为调节 pH 值，向 500 毫升瓶中加入三到四毫升 1 摩尔氢氧化钠。盖紧瓶盖并充分混匀。等待五分钟后，打开瓶盖，将 pH 计的电极插入缓冲液中。等待 pH 计读数稳定。继续加入少量 1 摩尔氢氧化钠，直至 pH 达到 8.15 至 8.17，确保在此过程中多次校准 pH 计。使用 0.22 微米真空过滤系统对转染缓冲液进行过滤除菌。将灭菌缓冲液分装至5毫升离心管中，尽量减少管内气空间。确认待重编程的成纤维细胞融合度为40%至60%。将4毫升DPBS转移至15毫升锥形管中，并加入100微升重组人层粘连蛋白521。用移液器上下吹打充分混匀。将稀释后的重组人层粘连蛋白521每孔1毫升加入六孔板中的三个孔内。将包被好的培养板于37°C孵育2小时。在孵育期间，将6毫升成纤维细胞扩增培养基和4毫升铺板培养基预热至37摄氏度。向铺板培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为100纳克/毫升，并加入B18R，使其终浓度为200纳克/毫升。小心吸除处于40%至60%融合度的成纤维细胞的旧培养基。用五毫升 DPBS 清洗细胞。加入三毫升胰蛋白酶 EDTA，轻轻摇动培养板，使胰蛋白酶 EDTA 覆盖细胞。吸去多余液体，保留约 500 微升胰蛋白酶，将成纤维细胞在 37 摄氏度下孵育三分钟。从培养箱中取出培养板后，用力但小心地轻敲培养板侧面，使细胞脱落。在显微镜下观察细胞，检查其是否已脱离。向脱落的细胞中加入5 mL成纤维细胞扩增培养基，以中和胰蛋白酶EDTA。将细胞收集到一个15毫升的锥形管中，并充分混匀。使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后用移液器将12,000个细胞加入4毫升预先配制并预热的铺板培养基中。从培养箱中取出包被好的培养板后，吸去孔中的稀释层粘连蛋白521，注意确保孔的表面不干燥。轻轻重悬处于铺板培养基中的细胞，并将1 mL细胞悬液加入每个包被好的孔中。将接种好的细胞放入三气组织培养孵箱中，在低氧或5%氧气条件下培养。然后通过上下移动和左右移动交替的方式，轻柔而充分地分散细胞，重复此动作两次，注意不要旋转混匀培养板。将细胞过夜培养。同时，向一个15毫升的锥形管中加入4毫升重编程培养基，并将管盖稍拧松，放入低氧培养箱中过夜平衡。转染前至少一小时，从低氧培养箱中取出已平衡的重编程培养基。加入bFGF至终浓度为100纳克/毫升，以及B18R至终浓度为200纳克/毫升，充分混匀。每次操作一个孔，使用1 mL移液器吸出用过的培养基，并加入1 mL重编程培养基，其中添加bFGF和B18R。将含细胞的培养板放回低氧培养箱中。开始成纤维细胞转染时，首先将一份转染缓冲液在室温下平衡约一小时。从负80摄氏度取出一份33微升的修饰mRNA和一份14微升的MIRNA模拟物，置于室温下解冻约三至五分钟，直至完全融化。然后在微量离心机中短暂离心。将转染试剂置于室温下预热约三到五分钟。轻轻倒置管子两到三次以混匀试剂，并在微量离心机中短暂离心。取279 µL室温转染缓冲液加入无RNA酶的微量离心管中，再加入31 µL转染试剂。用移液器充分混匀，室温孵育1分钟。向33微升修饰后的mRNA等分试样中加入132微升室温转染缓冲液，轻轻移液混匀。向14微升miRNA模拟物等分试样中加入102.6微升室温转染缓冲液，轻轻移液混匀。配制修饰mRNA的转染混合液时，将310微升转染缓冲液-转染试剂混合液中的165微升加入到165微升转染缓冲液-修饰mRNA混合液中。用移液器吹打混匀。配制miRNA模拟物的转染混合液时，将310微升转染缓冲液-转染试剂混合液中的116.6微升加入到116.6微升转染缓冲液-miRNA模拟物混合液中。充分混匀后，在室温下孵育15分钟，使转染缓冲液与修饰的mRNA和miRNA模拟物形成复合物。从低氧培养箱中取出细胞培养板。将含有复合物的修饰mRNA转染混合液逐滴加入每孔，每孔100 µL。轻轻但彻底地上下移动，然后左右移动培养板，以充分分散转染复合物。将含有复合MIRNA模拟物的转染混合液逐滴加入每孔，每孔66.7微升。轻轻但彻底地上下移动，然后左右移动培养板，以充分分散转染复合物。将转染后的细胞培养板放入低氧三气培养箱中。通过轻柔但彻底地上下、再左右晃动培养板，使转染复合物均匀分散。将转染后的细胞在培养箱中孵育16至20小时，然后于次日更换培养基。向一个15毫升锥形管中加入4毫升重编程培养基，管盖松开后置于低氧培养箱中过夜平衡。次日早晨，将含有转染成分的培养基更换为新鲜的、预先平衡过的、添加了bFGF和B18R的培养基，并按照方案所述继续进行转染程序。成功接种至六孔板中的一孔进行重编程后，成纤维细胞呈现非常稀疏的状态。首次成功转染后24小时，成纤维细胞失去了梭形形态，转而呈现更圆润的形状。在前三次转染过程中，细胞密度逐渐且持续增加，并在第7至第8天之间出现明显的增殖高峰。到第10天时，细胞已基本达到汇合状态。最早的iPSC集落早在第11天即出现。至第15至17天，iPSC集落变得较大且明显，与周围未完全重编程的成纤维细胞清晰可辨。对多能性标志物TRA-1-60进行免疫染色，证实了较高的重编程效率。接种密度不理想是本实验方案中重编程效率降低的最常见原因。若接种密度过低，则会出现较大的无细胞空白区域，且无法形成诱导多能干细胞（iPSC）克隆。在对重编程细胞进行稀释传代后，iPSC以单个克隆的形式生长，并可轻松与成纤维细胞区分开来。它们呈松散排列，单个细胞具有相对较大的细胞质区域。在4至7天的过程中，诱导多能干细胞（iPSCs）增殖并形成具有明确边界的典型紧密排列克隆。克隆内的单个细胞显示出较大的核质比例，并具有明显的核仁。在对患者成纤维细胞进行重编程后，所获得的诱导多能干细胞（IPSCs）可分化为多种体细胞，以阐明致病机制或开发新型再生细胞治疗手段。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

基于 rna 的人原代成纤维细胞重组成诱导多能干细胞

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

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我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

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利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

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成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

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利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

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使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

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由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

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