Name: 补充蛋白C1q和透明质酸在促进细胞粘附中的相互作用评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解补体蛋白C1q与透明质酸相互作用促进细胞粘附的实验方法。本研究利用人源原代细胞评估C1q结合透明质酸后对细胞行为的影响，为研究细胞外基质中蛋白质功能提供简便快速的实验模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Ivan Donati提供透明质酸（HA），感谢Leonardo Amadio和Gabriella Zito（IRCCS妇产科） &#34;布尔洛·加罗福洛&#34;，意大利的里雅斯特）以及安德里亚·罗曼诺（Andrea Romano，意大利的里雅斯特卡廷纳拉医院临床解剖与病理组织学操作单位）在组织样本采集方面的协助。我们还感谢尼科洛·莫罗西尼（Nicolò Morosini）在视频制备过程中的帮助，以及亚历克斯·科波拉（Alex Coppola）担任配音。本研究工作得到了意大利母幼健康研究所（IRCCS）资助项目的资助 &#34;布尔洛·加罗福洛&#34;意大利的里雅斯特（RC20/16）以及里雅斯特储蓄银行基金会向 R. Bulla 提供的支持。

在获得意大利的里雅斯特大学医院机构审查委员会对伦理问题的批准并取得患者的知情同意后，收集了患者的组织样本。
1. 肿瘤细胞的分离与培养（第1天）
<ol>
	<li>从恶性胸膜间皮瘤（MPM）实体标本中分离人源间皮瘤细胞。使用刀具将组织精细切割成约 2–3 mm2 大小的碎片，加入 5 mL 消化液（由 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）添加 0.5 mM Ca2+/Mg2+、0.5% 胰蛋白酶和 50 µg/mL DNase I 组成），于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>肿瘤细胞分离与培养（第 2 天）
	<ol>
		<li>过夜孵育后，将消化后的组织置于 37 °C 培养箱中，轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>离心（250 × g）后弃去消化液，加入 5 mL 含 3 mg/mL I 型胶原酶的 Medium 199（以 HBSS 配制），继续在 37 °C 轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 10% 经热灭活的胎牛血清（FBS）以终止酶反应。用 5 mL 移液管极其轻柔地重悬细胞，确保大部分细胞从组织中释放。随后将细胞悬液通过 100 µm 孔径滤膜过滤。</li>
		<li>将细胞接种至 12.5 cm2 培养瓶中，在 37 °C 条件下使用人内皮细胞无血清培养基（HESF）进行培养，培养基中添加 10% FBS，并补充 EGF（10 ng/mL）、碱性 FGF（20 ng/mL）和 1% 青霉素-链霉素。 
		注意：每 2–3 天更换一次新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HA 涂层（第1天）
<ol>
	<li>将高分子量透明质酸（1.5 kDa）用双蒸水重悬，配制成浓度为 1 mg/mL 的溶液6。</li>
	<li>用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（0.1 M，pH 9.6）将透明质酸储备液轻轻吹打混匀，稀释至 50 µg/mL&#160;。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 稀释后的透明质酸储备液，于 4 °C 过夜包被 96 孔板。 
	注：透明质酸由意大利的里雅斯特大学生命科学系 Ivan Donati 教授惠赠7。</li>
</ol>
3. C1q 包被（第 2 天）
<ol>
	<li>经过过夜孵育后，用真空抽吸法吸除处理过的孔中的液体，并用每孔100 µL的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS）洗涤96孔板。</li>
	<li>将C1q（25 µg/mL或剂量反应实验中不同浓度）或BSA（作为阴性对照）与固定在塑料表面的HA结合：在含0.5% BSA和0.7 mM Ca2+/Mg2+的100 µL dPBS中，加入上述蛋白至终浓度为25 µg/mL，4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>用真空抽吸法吸除孔内液体，并用每孔100 µL的dPBS洗涤96孔板。</li>
</ol>
4. 使用 FAST DiI 进行细胞标记
<ol>
	<li>将 1 × 105 个肿瘤细胞重悬于 500 µL 含 10 µg/mL 荧光染料 FAST DiI 的 dPBS 中。在 37 °C、5% v/v CO2 培养箱中孵育 15 分钟进行标记，每隔 5 分钟手动混匀一次。
	<ol>
		<li>为去除过量的 FAST DiI，加入 10 mL dPBS，轻轻吹打混匀，然后在 250 × g 条件下离心 7 分钟。将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 0.1% BSA 的人内皮细胞无血清培养基中（HESF + 0.1% BSA）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞在HA/C1q基质上的黏附（第1天）
<ol>
	<li>用真空抽滤法抽去包被了不同基质的孔板中的液体（这些孔板在步骤3.2中完成包被）。</li>
	<li>将100 µL标记的细胞悬液加入包被的孔中，于37 °C、5% v/v CO₂条件下孵育35分钟2 培养箱</li>
	<li>吸除上清液以去除非贴壁细胞。用含0.5% BSA、0.7 mM Ca的dPBS洗涤一次。2+ 和 0.7 mM Mg2+.</li>
	<li>通过每孔加入 200 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）+ 0.1% v/v SDS 裂解贴壁细胞，并立即使用荧光读板仪（激发波长 544 nm，发射波长 590 nm）读取 96 孔板，定量依据为通过裂解不同数量标记细胞所绘制的标准曲线。</li>
</ol>

<ol><li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation%3A+Chemistry%2C+processing+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346(2016).</li>
<li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23(2015).</li>
<li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+solutions%3A+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li>
<li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+primary+structure%2C+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling%3A+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).</li>
<li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li>
<li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).</li>
<li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li>
<li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li>
<li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

我们描述&#160;一种简便的方法，用于研究补体成分C1q如何通过与透明质酸相互作用，调控从人类肿瘤组织中分离出的原代细胞的行为。透明质酸（HA）和C1q在生理和病理条件下均大量存在于组织微环境中，参与多种细胞生物学过程。例如，已有研究表明，C1q存在于胎盘微环境中，在胎盘形成过程中促进绒毛外滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭8。C1q也沉积于皮肤伤口愈合部位，促进组织再生和修复所必需的血管生成过程10。此外，C1q已在多种不同肿瘤组织中被发现4。高分子量透明质酸是血管生成和细胞增殖的天然屏障，而最近的研究证据表明，C1q除了在补体激活中的经典作用外，还能作为细胞外基质（ECM）分子发挥作用，促进细胞迁移。
本研究的新颖之处在于发现C1q与透明质酸（HA）的结合显著改变了肿瘤细胞与HA之间的相互作用。为建立该方法，我们设置了多个关键检测步骤。首先，我们使用生物素标记的HA确保了足量的HA已结合至培养板和ELISA板的塑料表面。Alcian蓝染色结果...

肿瘤微环境（TME）影响癌症的发生与发展，因其可为细胞存活、生长和侵袭提供有利的生态位。识别TME中的新关键因子可能有助于发现用于靶向治疗的新型分子工具。TME包含一个复杂且动态的非恶性细胞网络，例如内皮细胞、成纤维细胞以及免疫系统细胞，这些细胞嵌入在由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和透明质酸等组成的周围细胞外基质（ECM）中。肿瘤细胞和非肿瘤细胞均可合成并分泌ECM成分，同时释放细胞因子、趋化因子、生长因子以及炎症和基质重塑相关的酶类，共同改变TME的物理、化学及信号特性。在这些组分中，透明质酸（HA）已被证实对肿瘤生物学具有关键作用。尽管HA化学结构简单，但其与HA结合分子（hyaladherins）共同以分子大小和浓度依赖的方式调控血管生成、免疫系统应答以及ECM的重塑1。
补体（C）系统也是局部肿瘤微环境（TME）的一部分，近年来受到越来越多的关注。补体系统包含一组可溶性和膜结合蛋白，参与针对非自身细胞、有害宿主成分以及病原体的第一道防御反应。在功能上，补体系统连接了先天性和适应性免疫系统的两个效应分支，以促进直接杀伤靶细胞或引发炎症反应2。补体激活可通过破坏癌细胞或抑制其增殖来抑制肿瘤生长，但越来越多的研究表明，补体系统也可能具有促肿瘤活性，例如维持慢性炎症、促进免疫抑制性微环境的形成、诱导血管生成以及激活与癌症相关的信号通路3。在此背景下，补体系统经典激活途径的第一个识别分子C1q，已被发现可在不依赖补体激活的情况下，在肿瘤微环境中发挥重要功能4。研究表明，多种人类恶性肿瘤可在局部表达C1q，后者除了促进血管生成和转移外，还可促进癌细胞的黏附、迁移和增殖5。有趣的是，C1q可与细胞外基质（ECM）的主要成分之一透明质酸（HA）相互作用。
我们开发了一种从肿瘤组织中分离原代癌细胞的技术。此外，我们构建了一种能够模拟肿瘤微环境的基质，特别是C1q与高分子量透明质酸之间的相互作用。C1q与透明质酸结合后可诱导肿瘤细胞的黏附。

<table><tbody><tr><td>100&amp;thinsp;&amp;micro;微孔滤膜</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶液（fungizone）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>免疫学科学</td><td>GRF-15595</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>沃辛顿生化公司，商号</td><td>MX1D12644</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>免疫学科学</td><td>GRF-10544</td><td></td></tr><tr><td>FAST DiI</td><td>分子探针，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific</td><td>D7756</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco&amp;nbsp; 赛默飞世尔科技</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>罗氏</td><td>11051407001</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>430639</td><td>无菌，带通气孔</td></tr><tr><td>庆大霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;Hanks 平衡盐溶液 (HBBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H6648</td><td>添加EDTA、葡萄糖、青霉素-链霉素、庆大霉素和两性霉素B</td></tr><tr><td>高分子量透明质酸</td><td>Ivan Donati 教授惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人内皮细胞无血清培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp; 赛默飞世尔科技</td><td>11111-044</td><td>添加EGF（5&amp;thinsp;ng/mL），碱性成纤维细胞生长因子（10&amp;thinsp;ng/mL），以及&amp;nbsp; 1% 青霉素&amp;ndash;链霉素（Sigma-Aldrich）</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Carlo Erba</td><td>13446-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液的 199 培养基&amp;rsquo;盐</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>延时显微镜技术&amp;nbsp;</td><td>尼康&amp;nbsp;</td><td>BioStation IM-Q 成像系统</td><td></td></tr><tr><td>Titertek Multiskan ELISA 阅读仪</td><td>流式实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T4674</td><td></td></tr></tbody></table>

补体蛋白c1q与透明质酸在促进细胞黏附中相互作用的评估

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

越来越多的研究表明，肿瘤微环境在肿瘤生长和转移过程中发挥着主动作用。通过不同的信号通路，肿瘤细胞能够通过分泌刺激因子、趋化因子和细胞因子，有效招募基质细胞、免疫细胞和内皮细胞。反过来，这些细胞可通过释放促生长信号、代谢物以及细胞外基质成分，改变微环境的信号特性，从而维持肿瘤细胞的高增殖活性和转移能力。在此背景下，我们发现补体成分C1q在多种人类恶性肿瘤中局部高表达，当其与细胞外基质中的透明质酸（hyaluronic acid）相互作用时，显著影响从人类肿瘤标本中分离出的原代细胞的行为。本文描述&#160;了一种检测与透明质酸（HA）结合的C1q如何影响肿瘤细胞黏附的方法，揭示了细胞外基质关键组分（此处为HA）的生物学特性可被生物活性信号所调控，进而促进肿瘤进展。

透明质酸（HA）是一种带负电荷的高分子量多糖，由重复的（β,1-4）-D-葡萄糖醛酸-（β,1-3）-N-乙酰-D-葡萄糖胺二糖单元组成（图1B）7。为检测HA在96孔板上的结合情况及其固定效率，采用生物素标记的透明质酸（bio-HA）进行实验。将不同浓度的bio-HA（范围从10 µg/mL至1 mg/mL）重悬于100 mM、pH 9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中，于4 °C孵育过夜。
经过充分洗涤后，使用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素检测结合在96孔板上的生物素化透明质酸（bio-HA），并以pNPP（1 mg/mL）作为底物对链霉亲和素的信号进行定量。采用酶标仪在405 nm波长下读取吸光值。bio-HA能够以剂量依赖的方式结合至96孔板（数据未显示）；50 µg/mL浓度达到饱和平台期，因此在本研究的实验中采用该浓度。
<p cla...

补体成分C1q是一种在组织微环境中高表达的促炎分子，可与细胞外基质相互作用。本文介绍&#160;一种检测结合于透明质酸的C1q如何影响细胞黏附的方法。

补体蛋白C1q与透明质酸在促进细胞黏附中相互作用的评估

越来越多的研究表明，肿瘤微环境在肿瘤生长和转移过程中发挥着积极作用。通过不同的通路，……

一种全面的实验流程，用于评估补体蛋白C1q与透明质酸在促进细胞黏附中的相互作用。我们近期研究发现，先天免疫系统中的补体成分C1q在肿瘤和胎盘微环境中高表达，并能够与细胞外基质成分相互作用，此处即为透明质酸。我们提出了一种在生态微环境中研究蛋白质生物学功能的方法。为了探究这些分子调控细胞外基质因子细胞分裂特性的能力，我们建立了一种简便的方法：将来源于人体组织的二元细胞接种于结合了补体蛋白C1q的细胞外基质（本实验中为透明质酸）上，以研究细胞如何感知该相互作用。包被步骤的第一步是将高分子量透明质酸结合到96孔组织培养微孔板上。包被时，将透明质酸用0.1摩尔碳酸缓冲液（pH 9.6）稀释至浓度为15微克/毫升，并需轻柔移液以获得均一溶液。使用100微升溶液包被孔板。然后将板置于4°C过夜。次日用真空抽吸法吸去处理过的孔中的液体。用dPBS洗涤一次。在相应的孔中加入C1q或BSA。目前C1q可商业购买，浓度为1毫克/毫升，使用时稀释至25微克/毫升。加入含有0.5% BSA、0.7毫摩尔钙和镁以及二价阳离子的dPBS。使用无LPS的BSA，浓度为0.5%，并加入date PBF。然后将培养板在4摄氏度下过夜孵育。通过酶联免疫吸附试验测定C1q与固定化透明质酸的剂量依赖性相互作用。使用快速DiI对细胞进行标记。脂溶性示踪剂快速DiI用于标记目标细胞。将细胞重悬于dPBS中，使用浓度为每毫升一百万个细胞。将Fast DiI直接按1:100的比例稀释到细胞悬液中。手动混匀细胞悬液，并在37摄氏度下孵育15分钟。孵育5分钟后，混匀细胞悬液，重复此操作两次。为了去除过量的快绿DiI，加入10毫升的dPBS。轻轻上下颠倒混匀，并在250 g条件下离心7分钟。将细胞沉淀重悬于1毫升含0.1% BSA的人源内皮细胞无血清培养基中。细胞在透明质酸C1q基质上的黏附。用真空抽吸法除去包被孔中的dPBS。向包被孔中加入100微升标记的细胞悬液。取200微升标记的细胞，置于离心管中，用于标准曲线的制备。将培养板在37摄氏度下孵育35分钟。从孵箱中取出培养板。轻柔地吸去未贴壁的细胞。用含有0.5% BSA以及0.7毫摩尔钙和镁的dPBS洗涤一次。加入200微升裂解缓冲液，裂解贴壁细胞。同时，在裂解缓冲液中对标记的细胞进行一至两次连续稀释，制备标准曲线。使用Infinite F200 T-can仪器，以544纳米为激发波长、590纳米为发射波长，读取荧光信号。代表性结果。如代表性结果所示，细胞在透明质酸上黏附时，C1q 的结合显著增强，明显高于仅使用透明质酸（HA）或HA结合牛血清白蛋白（BSA）的情况。每种基质上的黏附细胞百分比是根据标准曲线计算得出的。结论：在本实验中，我们首先评估了补体成分C12利用一种砷酸金属结合细胞外基质（本例中为透明质酸）的能力。其次，我们分析了用荧光染料标记的人原代细胞趋化结合透明质酸的能力。本研究提出的模型是一种更简便、快速且经济的方法，可替代细胞外基质支架的三维模型，用于评估细胞对多种刺激因素联合作用的反应。

evaluation-interplay-between-complement-protein-c1q-hyaluronic-acid

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

补充蛋白C1q和透明质酸在促进细胞粘附中的相互作用评价

介绍了一种可实现癌细胞与外源性透明质酸（HA）相互作用高分辨率分析的新方法。通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，制备出图案化表面。...

用于研究透明质酸与癌细胞相互作用的微图案化表面

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。...

黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

静态黏附实验是一种强大的工具，可用于模拟T淋巴细胞与其他细胞类型之间的相互作用。该实验通过将标记的T细胞注入包被有黏附分子的孔板中以形成相互作用，随后使用酶标仪在多次洗涤后定量测定黏附细胞的数量。...

T淋巴细胞整合素活化研究的静态黏附实验

本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。...

用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验

该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。...

剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。...

支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

本文介绍了一种用于检测补体受体1（CR1）长度多态性的创新方法，该方法可应用于多个领域，特别是用于评估阿尔茨海默病（AD）等疾病的易感性。该方法有助于更深入地理解CR1异构体在AD发病机制中的作用。...

用于补体受体1长度多态性基因分型的高分辨率熔解PCR：阿尔茨海默病基因易感性评估的创新工具

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外...

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

本方案概述了一种 体外 适用于参与迁移实验的分子功能分析 体内...

体外 透明质酸富集的细胞外基质对神经嵴细胞迁移影响的研究

为了有效研究免疫细胞群体的功能，通常需要对其进行纯化。补体耗竭法是一种快速且经济的技术，可用于分离高纯度的免疫细胞群体。...

通过补体耗竭去除特定细胞群体

了解补体蛋白C1q与透明质酸相互作用促进细胞粘附的实验方法。本研究利用人源原代细胞评估C1q结合透明质酸后对细胞行为的影响，为研究细胞外基质中蛋白质功能提供简便快速的实验模型。

补体蛋白C1q与透明质酸在促进细胞黏附中相互作用的评估

探索更多视频