Name: 荧光标记小鼠神经元的单细胞 RNA 序列的人工分选和双体外转录与绝对计数测序 (天后-Seq) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习人工分选荧光标记小鼠神经元并进行体外转录扩增的方法，用于高深度单细胞RNA测序。该技术可从特定脑区分离目标神经元亚群，实现精准基因表达分析。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（Z.J.H. 获得 5R01MH094705-04 和 R01MH109665-01）、冷泉港实验室 Robertson 神经科学基金（Z.J.H. 获得）以及 NARSAD 博士后奖学金（A.P. 获得）的支持。

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

手动分选方案适用于对小鼠脑中稀疏标记的神经元群体或极为稀少的细胞群体进行有监督的RNA测序，这些细胞群体通常难以通过现有的高通量细胞分选和扩增方法进行研究。经流式细胞分选（FACS）的细胞通常会受到鞘液和样品管路压力的影响，压力范围约为9–14 psi，具体数值取决于喷嘴尺寸和期望的事件速率。此外，细胞在从喷嘴喷出后可能猛烈撞击收集管或涂有样品缓冲液的孔板表面，从而造成冲击应力。而在手动分选过程中，由于细胞通过毛细作用被吸入移液管，并通过轻柔吹出及简单折断玻璃移液管尖端的方式释放，因此不会受到上述高压影响。DIVA-Seq方案适用于细胞体积较小（&#60;8 µL）且起始材料量低的细胞进行RNA扩增，能够稳定地检测到大量基因（8–10 K），结合深度测序，可实现对细胞身份背后细胞功能分子图谱的精细重建8,13,14。由于该方法具有细胞收集纯度高、基因检测灵敏度高以及能够进行绝对分子计数等优势，因此在高深度和高精度研究细胞状态及疾病病理生理机制方面具有重...

单细胞RNA测序（RNA-seq）已彻底改变了转录组学研究。尽管可采用多种技术（如液滴法）进行大规模单细胞RNA测序1,2，微流控技术3，纳米网格4和微孔5，大多数方法无法分选表达遗传编码荧光蛋白的特定细胞类型。为了分离特定的细胞群体，通常采用荧光激活细胞分选（FACS）以单细胞模式对标记细胞进行分选。然而，FACS存在一些限制，并需要精细的样品处理步骤。首先，通常需要大量的起始细胞（每毫升常需数百万个细胞），其中相当一部分细胞&#62;15–20%）含有标记细胞群。其次，细胞制备可能需要多次密度梯度离心步骤，以去除胶质成分、碎片及可能堵塞喷嘴或流动池的细胞团块。第三，流式细胞分选（FACS）通常需对活/死细胞染色进行染色与脱色步骤例如， 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）和Cytotracker染料），这些步骤会额外耗时。第四，对于双色分选（例如DAPI与绿色/红色荧光蛋白GFP/RFP），通常需要两个样品和一个对照，除目标小鼠品系外，还需处理一个未标记的样品。第五，为预防流式细胞分选仪（FACS）样品管路堵塞，通常在分选前和分选过程中需多次进行过滤。第六，在大多数常用的FACS系统中，必须预留时间用于初始化和稳定液流，并进行液滴校准。第七，在正式样品采集之前，通常需依次运行对照样品，以设置补偿矩阵、排除双联体、设定门控参数 等等。 用户可提前自行完成第六步和第七步，或同时寻求技术人员的协助。最后，在流式分选后，通常需要采取一些步骤以确保每个孔中仅存在标记的单个细胞；例如，可通过高内涵筛选系统（如快速微孔板成像仪）检查样品。
为避免上述步骤，实现对少量单个荧光标记神经元的快速、靶向测序，我们描述了一种手动分选方法，随后进行两轮高灵敏度的扩增 体外 扩增方案，称为具有绝对计数测序的双重体外转录法（DIVA-Seq）。RNA扩增和cDNA文库构建步骤改编自Eberwine 等6 和 Hashimshony 等7，但进行了一些修改以适应细胞体积较小的小鼠中间神经元；此外，我们还发现该方法同样适用于兴奋性锥体神经元。

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA 加标对照混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNA片段化缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>货号 E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>货号 74204</td><td></td></tr><tr><td>南极磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>货号 M0289</td><td></td></tr><tr><td>多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>货号 M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶2，截短型</td><td>New England Biolabs</td><td>货号 M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp 磁珠&amp;nbsp; 珠粒</td><td>贝克曼库尔特</td><td>货号 A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect 大小选择磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>货号 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>货号 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>货号 1078</td><td></td></tr><tr><td>灰色链霉菌蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 P5147</td><td></td></tr><tr><td>Message Amp II 试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 AM1751</td><td></td></tr><tr><td>碳合气</td><td>Airgas</td><td>货号# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>货号 RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA Pico 芯片</td><td>安捷伦</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪高灵敏度DNA芯片</td><td>安捷伦</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备荧光和明场照明及微分干涉差（DIC）光学系统的解剖显微镜。&amp;nbsp; （徕卡型号 MZ-16F）</td><td>Leica</td><td>Model MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微量移液管：硼硅酸盐毛细管，500支/包。外径=1 mm，内径=0.58 mm，壁厚=0.21 mm，长度=150 mm。</td><td>沃纳仪器</td><td>型号 GC100-15，货号 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>毛细管移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机组织冷却装置</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞rna测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（diva-seq）

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

单细胞RNA测序（RNA-seq）现已成为检测基因表达的常用工具。市面上可获得的单细胞RNA测序平台会无差别地处理所有输入细胞。有时会在上游使用荧光激活细胞分选（FACS）来分离特定标记的目标细胞群体。FACS的一个局限性在于需要大量输入细胞，并且其中被显著标记的细胞比例需足够高，这使得从鼠脑中收集和分析稀有或稀疏标记的神经元群体变得不切实际。本文介绍一种从新鲜解离的小鼠脑组织中手动收集稀疏荧光标记单个神经元的方法。该方法可实现高纯度捕获单个标记神经元，并可进一步与后续分析流程整合。 体外 一种基于转录的扩增方案，可保留内源性转录本的比例。我们描述了一种利用独特分子标识符（UMIs）生成单个mRNA计数的双线性扩增方法。经过两轮扩增，可实现每个单细胞中高程度的基因检出。

采用上述方案，对GABA能神经元进行手动分选（图1）并扩增RNA，然后构建cDNA文库（图2）并在高深度下进行测序8扩增的RNA（aRNA）产物大小在200–4,000 bp之间，峰值分布略高于500 bp（图3A）。经磁珠纯化的cDNA文库通过第二轮磁珠纯化进一步进行片段大小筛选，去除小于200 bp的较小片段（图3B 和 3C）并在约 350 bp 处出现峰值。片段过短会导致空读（无 mRNA 插入片段，仅有接头和引物序列），而片段过长则会占据测序芯片上更多空间，从而降低总读长产出。测序时，我们通常获得 4.8 x 105 中位数，或 6.9 x 105 每个细胞的平均比对读段数<strong class="...

本方案描述了手动分选单个荧光标记神经元的步骤，随后进行 体外 基于转录的mRNA扩增技术用于高深度单细胞RNA测序

使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

单细胞RNA测序（RNA-seq）现已成为检测基因表达的广泛应用工具。市面上可获取的单细胞RNA测序……

该方法有助于解决单神经元分离与测序领域中的一个关键障碍，例如从用户自定义的脑区收集特定群体或荧光标记神经元的亚群。该技术的主要优势在于能够确保目标单神经元被准确捕获，且无碎片污染。该方法也相对温和，对于在传统流式细胞术分选所用的流体压力下容易快速死亡的脆弱神经元类型而言，这一点尤为重要。首先使用毛细管拉制仪制备拉制的玻璃微毛细管，使其末端出口直径为10至15微米。使用精细剪刀剪切毛细管尖端，以获得所需的孔径大小。然后使用管路连接器将一段长度为120至150厘米、内径为0.8毫米的柔性硅胶管连接至一个0.2微米PVDF膜注射器滤器和一个双向管路阀上。准备500毫升冰冷的人工脑脊液（ACSF），并通过气石向其中通入含5%二氧化碳的平衡氧气体15分钟，或直至溶液完全澄清。准备三个150毫升烧杯，每个烧杯中加入100毫升ACSF。向其中一个加入活性阻断剂混合物。向另一个加入链球菌蛋白酶组分，使其终浓度为每毫升1毫克。向最后一个烧杯中加入胎牛血清（FBS），使其终浓度为1%，并通过曝气石以含5%二氧化碳的平衡氧气进行氧合。最后，通过在明火上滚动制作三支具有逐渐减小出口直径的长柄巴斯德吸管。使用小型剪刀切开已处死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出新鲜脑组织，注意不要损伤皮层。将脑组织置于冰冷且充氧的人工脑脊液（ACSF）中，并在整个切片过程中保持连接通有5%二氧化碳混合氧气的曝气石。将脑组织置于振动切片机的样品夹上，以300微米厚度切取冠状面或矢状面切片。收集足够数量的切片，以获得至少10至50个标记细胞。将切片置于烧杯内盛放的覆有棉网的切片架上，使其浸没于充氧人工脑脊液（ACSF）中。将切片转移至含有含活性阻断剂的ACSF的烧杯中，使用气石通入氧气，在室温下孵育15至20分钟。随后将切片转移至含有含蛋白酶溶液ACSF的烧杯中，在室温下进行温和消化。消化完成后，将切片移回含有含活性阻断剂ACSF的烧杯中，在室温下冲洗5至10分钟，以去除蛋白酶。持续通入氧气。接下来，准备一个直径为100毫米的培养皿，其中含有室温的含1%FBS的ACSF，并将单个脑片转移至培养皿中用于显微解剖。在荧光解剖显微镜下，使用一对精细镊子对含有至少10至50个细胞的感兴趣区域和层次进行显微解剖。使用巴斯德移液管，将显微解剖的组织块转移至含有约 0.8 毫升 ACSF 溶液中 1% FBS 的 2 毫升微量离心管中。在室温下对微量离心管中的解剖组织进行滴定。使用经火焰处理的巴斯德移液管，从出口直径最大的开始，到最小的结束，每根移液管各吹打约 10 次。将解离的细胞接种至含有充氧人工脑脊液（ACSF）的100毫米培养皿中，静置5到7分钟，使细胞逐渐沉降。在解剖显微镜下观察GFP和RFP信号。在明场照明下通过观察形态学特征来识别碎片。确定一个细胞碎片较少的区域后，使用毛细管并连接到管路，通过用舌头堵住管路阀门的末端来吸取细胞。然后将毛细管靠近细胞，松开毛细管的堵塞，随即迅速重新堵住，利用毛细作用捕获细胞。将毛细管转移至含有新鲜含氧人工脑脊液（ACSF）的100毫米培养皿中，在荧光显微镜下观察毛细管尖端的同时，轻轻向管内吹气，以将细胞释放到培养皿中。重复收集操作，直至收集到100至150个细胞，并确保在明场微分干涉差（DIC）显微镜下观察时杂质（如碎片）极少。最后，每次使用新的微毛细移液管，挑选单个细胞，并将其排出至含有1微升带引物的样品收集缓冲液的0.2微升微量离心管中，排出体积不超过0.5微升。将移液器吸头折断于微量离心管中，以确保细胞保留在收集缓冲液内。将管子置于干冰上，冷冻细胞。在进行RNA扩增处理前，将样品储存在-80摄氏度冰箱中。从小鼠脑的扣带回皮层中分离出GABA能神经元。从手工分选的神经元中扩增得到的RNA片段大小介于200至4,000个碱基对之间，峰值分布略高于500个碱基对。经过磁珠纯化后，cDNA文库通过使用磁珠进行第二轮纯化进一步限制片段大小，以去除小于200个碱基对的片段，并使主峰集中在约350个碱基对处。测序结果显示，每个细胞的中位映射读段数为4.8 × 10⁵，平均映射读段数为6.9 × 10⁵。在利用UMI去除重复RNA后，每个单细胞的中位唯一读段数为1.0 × 10⁵，平均唯一读段数为1.4 × 10⁵。在每个单细胞外源RNA对照联盟（ERCC）实验中，均使用外源添加的RNA作为内参对照，以计算加入样本中的分子绝对数量。输入量与观测到的计数之间存在线性关系，斜率为0.92，校正后的R平方为0.94。采用该方法，每个单个神经元平均检测到约10,000个基因，其中超过95%的单细胞检测到的基因数超过6,000个。该技术建立后，为分子生物学家探索特征明确的小鼠皮层中间神经元的转录组铺平了道路，并鉴定了负责编码细胞身份的特定基因类别。

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荧光标记小鼠神经元的单细胞 RNA 序列的人工分选和双体外转录与绝对计数测序 (天后-Seq)

本视频展示了一种从小鼠脑中分离荧光标记神经元的方法。...

从小鼠大脑中分离荧光标记的神经元

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利用激光显微切割技术从小鼠脊髓运动神经元胞体中制备转录组分析用RNA

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,...

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。...

视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。...

从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

本文建立了一种用于制备受精后小鼠胚胎单细胞和细胞核高质量悬液的流程，以进行单细胞和单细胞核测序。...

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本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

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