使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

该方法有助于解决单神经元分离与测序领域中的一个关键障碍，例如从用户自定义的脑区收集特定群体或荧光标记神经元的亚群。该技术的主要优势在于能够确保目标单神经元被准确捕获，且无碎片污染。

该方法也相对温和，对于在传统流式细胞术分选所用的流体压力下容易快速死亡的脆弱神经元类型而言，这一点尤为重要。首先使用毛细管拉制仪制备拉制的玻璃微毛细管，使其末端出口直径为10至15微米。使用精细剪刀剪切毛细管尖端，以获得所需的孔径大小。

然后使用管路连接器将一段长度为120至150厘米、内径为0.8毫米的柔性硅胶管连接至一个0.2微米PVDF膜注射器滤器和一个双向管路阀上。准备500毫升冰冷的人工脑脊液（ACSF），并通过气石向其中通入含5%二氧化碳的平衡氧气体15分钟，或直至溶液完全澄清。准备三个150毫升烧杯，每个烧杯中加入100毫升ACSF。

向其中一个加入活性阻断剂混合物。向另一个加入链球菌蛋白酶组分，使其终浓度为每毫升1毫克。向最后一个烧杯中加入胎牛血清（FBS），使其终浓度为1%，并通过曝气石以含5%二氧化碳的平衡氧气进行氧合。

最后，通过在明火上滚动制作三支具有逐渐减小出口直径的长柄巴斯德吸管。使用小型剪刀切开已处死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出新鲜脑组织，注意不要损伤皮层。将脑组织置于冰冷且充氧的人工脑脊液（ACSF）中，并在整个切片过程中保持连接通有5%二氧化碳混合氧气的曝气石。

将脑组织置于振动切片机的样品夹上，以300微米厚度切取冠状面或矢状面切片。收集足够数量的切片，以获得至少10至50个标记细胞。将切片置于烧杯内盛放的覆有棉网的切片架上，使其浸没于充氧人工脑脊液（ACSF）中。

将切片转移至含有含活性阻断剂的ACSF的烧杯中，使用气石通入氧气，在室温下孵育15至20分钟。随后将切片转移至含有含蛋白酶溶液ACSF的烧杯中，在室温下进行温和消化。消化完成后，将切片移回含有含活性阻断剂ACSF的烧杯中，在室温下冲洗5至10分钟，以去除蛋白酶。

持续通入氧气。接下来，准备一个直径为100毫米的培养皿，其中含有室温的含1%FBS的ACSF，并将单个脑片转移至培养皿中用于显微解剖。在荧光解剖显微镜下，使用一对精细镊子对含有至少10至50个细胞的感兴趣区域和层次进行显微解剖。

使用巴斯德移液管，将显微解剖的组织块转移至含有约 0.8 毫升 ACSF 溶液中 1% FBS 的 2 毫升微量离心管中。在室温下对微量离心管中的解剖组织进行滴定。使用经火焰处理的巴斯德移液管，从出口直径最大的开始，到最小的结束，每根移液管各吹打约 10 次。

将解离的细胞接种至含有充氧人工脑脊液（ACSF）的100毫米培养皿中，静置5到7分钟，使细胞逐渐沉降。在解剖显微镜下观察GFP和RFP信号。在明场照明下通过观察形态学特征来识别碎片。

确定一个细胞碎片较少的区域后，使用毛细管并连接到管路，通过用舌头堵住管路阀门的末端来吸取细胞。然后将毛细管靠近细胞，松开毛细管的堵塞，随即迅速重新堵住，利用毛细作用捕获细胞。

将毛细管转移至含有新鲜含氧人工脑脊液（ACSF）的100毫米培养皿中，在荧光显微镜下观察毛细管尖端的同时，轻轻向管内吹气，以将细胞释放到培养皿中。重复收集操作，直至收集到100至150个细胞，并确保在明场微分干涉差（DIC）显微镜下观察时杂质（如碎片）极少。最后，每次使用新的微毛细移液管，挑选单个细胞，并将其排出至含有1微升带引物的样品收集缓冲液的0.2微升微量离心管中，排出体积不超过0.5微升。

将移液器吸头折断于微量离心管中，以确保细胞保留在收集缓冲液内。将管子置于干冰上，冷冻细胞。在进行RNA扩增处理前，将样品储存在-80摄氏度冰箱中。

从小鼠脑的扣带回皮层中分离出GABA能神经元。从手工分选的神经元中扩增得到的RNA片段大小介于200至4,000个碱基对之间，峰值分布略高于500个碱基对。经过磁珠纯化后，cDNA文库通过使用磁珠进行第二轮纯化进一步限制片段大小，以去除小于200个碱基对的片段，并使主峰集中在约350个碱基对处。

测序结果显示，每个细胞的中位映射读段数为4.8 × 10⁵，平均映射读段数为6.9 × 10⁵。在利用UMI去除重复RNA后，每个单细胞的中位唯一读段数为1.0 × 10⁵，平均唯一读段数为1.4 × 10⁵。在每个单细胞外源RNA对照联盟（ERCC）实验中，均使用外源添加的RNA作为内参对照，以计算加入样本中的分子绝对数量。

输入量与观测到的计数之间存在线性关系，斜率为0.92，校正后的R平方为0.94。采用该方法，每个单个神经元平均检测到约10,000个基因，其中超过95%的单细胞检测到的基因数超过6,000个。该技术建立后，为分子生物学家探索特征明确的小鼠皮层中间神经元的转录组铺平了道路，并鉴定了负责编码细胞身份的特定基因类别。