Name: 原代人细胞中寨卡病毒抗体依赖性增强的定量研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解利用原代人免疫细胞和患者血清定量研究寨卡病毒抗体依赖性增强的方法。该技术通过实时PCR检测病毒RNA水平，为疫苗开发提供重要免疫学见解。

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本工作获得了1R21AI129881-01（资助对象：T.M.C.）、国家新发传染病实验室的启动资金以及波士顿大学医学院的资助。

本研究中使用的血清样本来自哥伦比亚一个队列的人类受试者。样本采集已获得哥伦比亚南美洲帕姆普洛纳大学（Universidad de Pamplona）和洛斯波蒂奥斯医院（Los Potios Hospital）伦理审查委员会（IRB）的批准。8样本为匿名提供，研究人员无法获取患者信息。血清样本经检测确定登革病毒（DENV）血清型，并进一步确认其可中和DENV感染。 体外 作为对照，使用来自美国的健康个体（HC）的血清样本。
注意：本方案可用于研究在表达 Fcγ 受体的任何人类细胞类型中寨卡病毒（ZIKV）复制的抗体依赖性增强（ADE）效应。该方案包括三个部分（图1）。
1. 细胞接种与感染设置
注意：本研究使用人原代巨噬细胞或U937髓单核细胞系（ATCC-CRL-1593.2）。细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，在37 °C、含5%二氧化碳（CO2）的培养箱中孵育。所有操作均在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>接种 3 × 104 每孔加入100 µL培养基，在无菌平底96孔板中接种细胞，并置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.</li>
	<li>接种细胞后，将血清样本在室温下解冻，并进行10倍系列稀释（即，1/10，1/100，1/1,000，1/10,000）的稀释液，将样品与无血清培养基混合。将稀释后的样品分装至无菌的96孔板中。使用不含血清的病毒作为额外对照。</li>
	<li>将ZIKV毒株在37 °C水浴中解冻1 - 2分钟，随后迅速转移至冰上，以备后续使用。</li>
	<li>向血清等分试样中加入0.1感染复数（MOI）当量的ZIKV毒株MR766。 
	注意： 确保稀释倍数保持恒定，总体积约为 200 µL，足以进行每个处理组的三复孔实验。保留三个未感染的孔，作为后续分析的阴性对照。</li>
	<li>将添加病毒的血清稀释液置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育2 孵育1小时，以使登革病毒抗体与寨卡病毒颗粒形成复合物（为方便起见，下文简称 &#34;免疫复合物&#34;).</li>
	<li>吸弃平底96孔板中已接种细胞的培养基，用无菌的1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>将50 µL免疫复合物加入每孔中，置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育2 2小时。</li>
	<li>孵育2小时后，使用多通道移液器吸出含有免疫复合物的培养基，并用1×PBS洗涤细胞2次，以彻底去除免疫复合物及未结合的病毒颗粒。</li>
	<li>向每孔加入100 µL含10% FBS的新鲜完全培养基，将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2 48 小时。</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>从培养箱中取出96孔板，并将其转移至生物安全柜中。</li>
	<li>吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞2次，随后进行RNA提取。 
	注意： RNA提取可采用任意合适的方法（参见材料表）。</li>
	<li>每孔加入含10% β-巯基乙醇的250 µL细胞裂解缓冲液。用移液器反复吹打至少5次，同时用枪头刮擦孔底以加速裂解过程。</li>
	<li>将细胞裂解物转移至新的、已标记的无菌1.5 mL离心管中。</li>
	<li>加入等体积的70%乙醇（250 µL）。上下吹打4–5次，直至混合液变得澄清。</li>
	<li>将混合液（约500 µL）转移至标记好的硅胶膜柱（置于2 mL收集管中），在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液，将柱子保留在同一收集管中。</li>
	<li>向每个柱子中加入700 µL洗涤缓冲液1，在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液，将柱子保留在同一收集管中。</li>
	<li>向每个柱子中加入500 µL洗涤缓冲液2，在15,000 × g 条件下离心30秒。弃去上清液。重复此步骤2次。</li>
	<li>将柱子转移至新的2 mL收集管中，在15,000 × g 条件下离心2分钟。确保硅胶膜柱完全干燥，无残留的洗涤缓冲液2中的乙醇。</li>
	<li>弃去2 mL收集管，将柱子放入新的、无菌且已标记的1.5 mL回收管中。</li>
	<li>在每个柱子中央加入预热（42 °C）的30 µL无RNase水，在15,000 × g 条件下离心1分钟。</li>
	<li>收集洗脱的RNA，并使用分光光度计在260 nm波长下定量样品。 
	注意： 理想情况下，通过计算260 nm与280 nm处吸光度值的比值来评估RNA纯度。纯化后RNA的260/280比值理想范围为1.8–2.0。</li>
</ol>
3. 定量实时聚合酶链式反应
注意： 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）可使用任何SYBR Green预混液进行，该预混液通常包含SYBR Green I染料、Taq DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及被动参照染料。任何具备SYBR Green检测功能的qPCR仪均可用于实施反应并获取数据。本实验采用了一步法RT-PCR试剂盒，其中含有SYBR Green I、ROX参比染料、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及逆转录酶的复合物（参见 材料表). 本研究中用于定量ZIKV基因组水平的包膜区引物为ZIKV-qF（CCGCTGCCCAACACAAG）和ZIKV-qR（CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT）。作为对照，检测人β-2-微球蛋白（B2M）并用于ZIKV表达水平的标准化（内参基因）。本研究中用于定量B2M基因表达的引物序列为B2M-qF（CTCCGTGGCCTTAGCTGTG）和B2M-qR（TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT）。每份样本的ZIKV基因和B2M基因均需设置三个技术重复。逆转录PCR的实验步骤简述如下。
<ol>
	<li>RT-PCR 反应体系的建立
	<ol>
		<li>每份样品使用 100 ng RNA。</li>
		<li>每个反应中加入特定基因的正向和反向引物各1 µL，引物储备液浓度为10 µM。</li>
		<li>每个样本加入 0.25 µL 逆转录酶混合液。</li>
		<li>每次单独反应中加入 12.5 µL 的 SYBR Green 混合液。</li>
		<li>加入最多 25 µL 水。除 RNA 外，将上述所有试剂配制成预混液，分装至 96 孔 PCR 板中，最后加入 RNA。</li>
		<li>用透明胶带密封板孔。</li>
		<li>将培养板在1,000 x g条件下离心 g 1分钟以混匀试剂。</li>
		<li>将培养板放入qPCR仪中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-PCR 扩增曲线 
	注意： 使用所示的RT-PCR程序 表1.
	<ol>
		<li>在50 °C下孵育样品10分钟，以确保互补DNA（cDNA）的合成。</li>
		<li>cDNA合成后，在95 °C下激活Taq DNA聚合酶5分钟。</li>
		<li>进行40个循环的变性（95 °C，10 s）以及引物退火和延伸（60 °C，30 s）。</li>
		<li>在最后添加熔解曲线步骤（65°C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>通过点击用于运行qPCR仪器程序中的熔解曲线选项卡来监测熔解曲线，理想情况下，特定基因的所有样本应呈现单一峰形，以确认仅存在单一扩增产物，并且当算法将2视为100%扩增效率时，扩增值应高于1.6（扩增值根据qPCR仪器所使用的算法而有所不同）。为获得最佳结果，在熔解曲线程序中应采用0.5 °C的温度递增值，每步至少保持10秒的恒温时间。</li>
		<li>在确认存在单一扩增产物且扩增效果良好后，首先点击定量数据标签，获取每个样本的定量循环值（Ct/Cq值），并导出至Microsoft Excel。</li>
		<li>使用电子表格，根据 Ct 值计算每个样本的平均值。接着，在公式栏中点击并选择平均值。每个样本（重复）的平均 Ct 值将用于后续分析。</li>
		<li>接下来，使用公式 ΔCt = 目标基因的平均 Ct 值 - 内参基因的平均 Ct 值 计算 ΔCt（本例中，ΔCt = ZIKV 基因的平均 Ct 值 - B2M 基因的平均 Ct 值）。</li>
		<li>计算 ΔΔCt 以对数据进行归一化处理（本例中，ΔΔCt = ZIKV 样本的 ΔCt - B2M 样本的 ΔCt）。</li>
		<li>通过输入公式 2^-(ΔΔCt) 计算每个经归一化的 ΔΔCt 值对应的基因表达倍数变化。用于统计分析的倍数变化结果可参照先前研究中的方法获得9,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

登革病毒（DENV）抗体的交叉反应性导致其他DENV血清型的抗体依赖性增强（ADE），这阻碍了有效疫苗的开发11。寨卡病毒（ZIKV）属于同一科，即黄病毒科（Flaviviridae），与其他黄病毒尤其是DENV具有较高的同源性12。ZIKV和DENV中和抗体的主要靶标均为包膜蛋白，该蛋白在两种病毒之间具有极高的结构和四级序列同源性13,14,15。已有研究表明，对DENV或ZIKV的预先免疫可增强另一种病毒的感染能力8,16。
在 ADE 实验中，有多种不同的方法用于量化病毒的感染性，包括蚀斑实验17、使用荧光染料标记抗体进行细胞内病毒抗...

在蚊媒传播的病毒性疾病中，寨卡病毒感染是临床上最为重要的疾病之一1。该感染由黄病毒属的寨卡病毒（ZIKV）引起，在大多数情况下以埃及伊蚊（Aedes aegypti）为主要传播媒介1,2。然而，已有研究报道在某些寨卡病毒暴发疫情中，白纹伊蚊（Aedes albopictus）亦可作为主要传播媒介3。尽管许多感染者无明显症状，最常见的临床表现仍为发热、头痛和肌肉疼痛2。目前尚无针对寨卡病毒感染的特效治疗方法或疫苗，临床上主要采取支持性治疗。近年来南美洲暴发的寨卡病毒疫情导致了大量重症病例，并使胎儿神经发育障碍——小头症（microcephaly）的发生率上升约20倍2。由于南美洲是登革病毒（DENV）和西尼罗病毒等多种虫媒病毒的流行区域，因此亟需研究机体对其他黄病毒的既往免疫是否会影响寨卡病毒感染的严重程度和疾病进程。
在漫长的进化过程中，病毒发展出多种策略以提高其感染能力，从而劫持宿主细胞的生物机制并抑制抗病毒反应。其中最引人注目的策略之一是病毒利用宿主的先天免疫抗体，通过抗体依赖性增强（ADE）现象来促进自身复制4。登革病毒（DENV）所有四种血清型的ADE效应已被广泛研究，并证实可提高病毒滴度并加重疾病结局5,6,7。在先前的一项体外研究中，我们已证明在人原代免疫细胞中，由于既往存在的DENV免疫，寨卡病毒（ZIKV）的复制显著增强8。我们还建立了一种相关的体外方法，用于定量评估既往存在的DENV抗体在原代细胞中增强ZIKV复制的能力。
我们开发的实验方案采用人血清样本，在具有生物学相关性的细胞或寨卡病毒（ZIKV）可感染的组织来源细胞中，通过TCID-50或蚀斑减少中和试验（PRNT）检测登革病毒（DENV）的中和能力。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>GEMINI</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>iCycler&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>型号 CFX96 光学模块</td></tr><tr><td>Microfuge 18 离心机</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>Thermoscientific&amp;nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>Quantifast SYBR-One step RT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>204154</td><td>用于一步法 RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy RNA 提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>74106</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>RPMI 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

寨卡病毒（Zika virus）作为一种黄病毒属新发病毒，其感染与吉兰-巴雷综合征及婴儿小头症等神经系统并发症相关，已引发严重的公共卫生安全问题。在诸多风险因素中，抗体依赖性增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE）构成最显著的威胁，因为寨卡病毒（ZIKV）的近期再次暴发主要发生在人群既往已暴露于其他密切相关黄病毒（尤其是登革病毒，DENV）并处于预存免疫状态的地区。本文介绍一种用于定量评估人血清中抗登革病毒（DENV）抗体对寨卡病毒（ZIKV）在原代人细胞或细胞系中感染效果影响的实验方案。

在图1中，逐步以示意图形式展示了执行ADE实验方案的全部步骤。该图是由于既往存在登革病毒（DENV）免疫而引发寨卡病毒（ZIKV）ADE效应的完整流程示意图。图2展示了人血清样本如何被分为三组：经登革病毒感染确认的样本称为DENV感染组，经登革病毒抗体确认的样本称为DENV暴露组，而无登革病毒中和抗体或RNA的健康个体血清则称为健康对照（HC）组。（图2）
将所有血清样本与寨卡病毒（ZIKV）孵育形成复合物后，用于感染巨噬细胞。感染后48小时，提取RNA并进行qRT-PCR分析。图3所示的代表性实验表明，含有登革病毒（DENV）血清型1至4抗体的大多数血清均能在不同程度上增强ZIKV的复制。与血清型1和3相比，含有D...

我们描述了一种利用人血清、原代人细胞以及实时定量聚合酶链式反应进行感染定量的方法，用于评估针对登革病毒的预存免疫对寨卡病毒感染的影响。

寨卡病毒（Zika virus）这一黄病毒属新发病毒的出现，及其引发的神经系统并发症，如吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome）和婴儿小头症，已引起……

该方法可用于评估登革病毒预存免疫力对寨卡病毒感染的影响，使用真实的临床患者血清和原代人免疫细胞。利用真实临床患者血清样本和人原代细胞，可更深入地研究预存血清和抗体介导的寨卡病毒抗体依赖性增强作用。该方法有助于了解患者血液中抗体增强其他人类细胞病毒感染的能力。确保病毒感染水平足够高以便检测，但又不能过高而对细胞造成过度负荷或干扰数据分析。首先，在无菌的平底96孔板中，每孔接种3 × 10⁴个细胞，加入100 µL细胞培养基。所有细胞接种完毕后，将培养板置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育，并在无血清培养基中对解冻的人血清样本进行10倍系列稀释。在将稀释液加入病毒溶液和细胞之前，务必确保所有免疫前血清的血清稀释度和稀释因子保持一致。接下来，将寨卡病毒毒株的储备液在37摄氏度水浴中解冻一至两分钟，然后迅速转移至冰上。向血清等分试样中加入0.1感染复数等效体积的寨卡病毒，并将培养板置于细胞培养箱中孵育一小时，以使登革热病毒抗体与寨卡病毒颗粒形成复合物。孵育结束后，每孔加入100微升PBS洗涤细胞，然后每孔加入50微升免疫复合物。经过两小时孵育后，吸去培养基，并用每孔100微升PBS洗涤两次，以彻底去除免疫复合物及未结合的病毒颗粒。随后，每孔加入100微升含10%胎牛血清的细胞培养基对细胞进行培养。然后将细胞放回细胞培养孵育箱中培养48小时。感染后两天，用100微升无菌PBS每孔洗涤两次，随后每孔加入250微升含10%β-巯基乙醇的细胞裂解缓冲液。用移液器反复吹打至少五次，并轻轻刮擦以加速裂解过程，然后将细胞裂解液转移至无菌且标记好的1.5毫升离心管中。向每根试管中加入等体积的70%乙醇，用移液器将裂解液上下吹打四到五次。当裂解液变得澄清后，将每种溶液转移至贴有标签的硅基离心柱中，放入2毫升收集管内进行离心。弃去穿流液，将离心柱保留在同一收集管中，然后向每个离心柱中加入700微升洗涤缓冲液1，进行第二次离心。 弃去穿流液后，再用500微升洗涤缓冲液二分别洗涤柱子两次，每次500微升。第二次洗涤后，将柱子转移至新的2毫升收集管中，进行另一次离心。向每个柱子的中心加入30微升42摄氏度的无RNase水，离心并回收洗脱的RNA。进行定量实时聚合酶链式反应（QRTPCR）分析时，每个反应中加入1微升来自10微摩尔储备液的基因特异性正向引物和反向引物，以及0.25微升逆转录酶混合物。请注意，识别寨卡病毒遗传物质的引物可检测病毒基因，从而实现感染程度的定量。接下来，向每个反应中加入12.5微升SYBR Green Mix，随后加入25微升水，并将15微升主混合液加入96孔QPCR板的每个孔中。使用预混液时，将100纳克RNA样本加入预混液中，并用移液器将预混液分别加入定量PCR板的各个孔中。注意，样本应在同一块定量PCR板上设置三个复孔。然后根据表格中列出的参数，在定量PCR仪上运行样本。点击系统软件中的熔解曲线选项卡以监测熔解曲线。对于特定基因，所有样本的熔解曲线应显示单一峰，以确认仅存在一种扩增产物。为获得最佳结果，在熔解曲线程序中，各步骤之间的温度增量应为0.5摄氏度，每步最低保持时间为10秒。然后点击定量数据标签页，获取每个样本的定量循环数据，并将数据导出至电子表格以进行进一步的定量分析。人血清样本可分为三组：登革病毒感染确认样本、登革病毒抗体确认样本，以及无登革病毒中和抗体或RNA的健康血清样本。感染48小时后，qRT-PCR分析显示，大多数含有登革病毒1至4型抗体的血清能够在不同程度上增强寨卡病毒的复制。与血清型一和三相比，含有登革病毒血清型二和四抗体的血清处理的巨噬细胞中寨卡病毒滴度升高最为显著，而血清型一和三仅引起相对较低的寨卡病毒增殖。保持无菌环境、穿戴适当的个人防护装备，以及始终将解冻后的病毒血清样本和QPCR试剂置于冰上，至关重要。该方案可轻松修改，用于研究其他黄病毒（如黄热病毒、登革病毒或西尼罗病毒）的抗体依赖性增强效应，只需使用一组患者血清即可。该技术对于今后在节肢动物传播病毒或病毒学领域开展抗体依赖性增强效应研究具有重要意义。实验过程中应始终使用适当的生物安全二级个人防护装备，所有病毒废弃物在丢弃前须用10%漂白剂处理30分钟以彻底去污。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

原代人细胞中寨卡病毒抗体依赖性增强的定量研究

来源：Asad, S., 等. 在原代人细胞中对寨卡病毒的抗体依赖性增强作用进行定量分析. J. Vis. Exp.

登革病毒抗体在人原代巨噬细胞中对寨卡病毒的抗体依赖性增强作用

本视频演示了一种利用寨卡病毒恢复期血清检测登革病毒感染的抗体依赖性增强（ADE）的实验方法。该实验采用编码绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）。针对寨卡病毒的血清抗体与RVPs发生交叉反应，形成复合物。结合的抗体可增强表达Fc受体的细胞对RVPs的摄取，通过流式细胞术检测该过程。...

一种用于检测病毒抗体依赖性增强感染的体外实验方法

一种用于筛选强效抑制寨卡病毒生长的干扰素的体外检测方法

本视频展示了一种用寨卡病毒感染人类胎儿神经干细胞的操作流程。感染后的细胞可用于进一步的研究。...

寨卡病毒感染胎儿神经干细胞

寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常及小头症相关。建立有效的感染性细胞培养系统对于研究ZIKV复制以及疫苗和药物开发至关重要。本研究展示并讨论了与ZIKV相关的多种病毒学检测方法。...

寨卡病毒感染性细胞培养系统及 体外 干扰素的预防作用

本方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中回收具有感染性的寨卡病毒的方法。...

从一种新型寨卡病毒感染性克隆中拯救与鉴定重组病毒

我们介绍一种简单易行的实验方案，利用登革病毒报告病毒颗粒，通过寨卡病毒感染恢复期血清来检测抗体依赖性增强感染效应。...

一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

本文描述了一种用于评估Zika病毒（ZIKV）感染的Ifnar1-/-小鼠模型中免疫豁免器官内抗原特异性T细胞反应的实验方案。该方法对于研究ZIKV疫苗的细胞保护机制和免疫病理发生机制至关重要，同时也可用于评估疫苗的有效性。...

评估感染寨卡病毒的Ifnar1-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

本实验方案的目的是通过从感染小鼠的多个器官中分离和定量寨卡病毒，展示研究病毒性疾病的常用技术。...

从小鼠多个器官中分离与定量寨卡病毒

本实验方案描述了在Vero非洲绿猴肾细胞中扩增寨卡病毒（ZIKV）的方法，并利用基于细胞的比色免疫检测法，在24孔板和96孔板（高通量）格式中对ZIKV进行定量。...

病毒增殖与基于细胞的比色定量

本文展示了细胞电学阻抗（CEI）技术作为一种极为简便直接的方法，用于实时研究寨卡病毒在人细胞中的感染与复制过程。此外，CEI检测法还可用于抗病毒化合物的评估。...

基于细胞的电学阻抗平台实时评估寨卡病毒抑制剂

了解利用原代人免疫细胞和患者血清定量研究寨卡病毒抗体依赖性增强的方法。该技术通过实时PCR检测病毒RNA水平，为疫苗开发提供重要免疫学见解。

寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

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