寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

该方法可用于评估登革病毒预存免疫力对寨卡病毒感染的影响，使用真实的临床患者血清和原代人免疫细胞。利用真实临床患者血清样本和人原代细胞，可更深入地研究预存血清和抗体介导的寨卡病毒抗体依赖性增强作用。该方法有助于了解患者血液中抗体增强其他人类细胞病毒感染的能力。

确保病毒感染水平足够高以便检测，但又不能过高而对细胞造成过度负荷或干扰数据分析。首先，在无菌的平底96孔板中，每孔接种3 × 10⁴个细胞，加入100 µL细胞培养基。所有细胞接种完毕后，将培养板置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育，并在无血清培养基中对解冻的人血清样本进行10倍系列稀释。

在将稀释液加入病毒溶液和细胞之前，务必确保所有免疫前血清的血清稀释度和稀释因子保持一致。接下来，将寨卡病毒毒株的储备液在37摄氏度水浴中解冻一至两分钟，然后迅速转移至冰上。向血清等分试样中加入0.1感染复数等效体积的寨卡病毒，并将培养板置于细胞培养箱中孵育一小时，以使登革热病毒抗体与寨卡病毒颗粒形成复合物。

孵育结束后，每孔加入100微升PBS洗涤细胞，然后每孔加入50微升免疫复合物。经过两小时孵育后，吸去培养基，并用每孔100微升PBS洗涤两次，以彻底去除免疫复合物及未结合的病毒颗粒。随后，每孔加入100微升含10%胎牛血清的细胞培养基对细胞进行培养。

然后将细胞放回细胞培养孵育箱中培养48小时。感染后两天，用100微升无菌PBS每孔洗涤两次，随后每孔加入250微升含10%β-巯基乙醇的细胞裂解缓冲液。用移液器反复吹打至少五次，并轻轻刮擦以加速裂解过程，然后将细胞裂解液转移至无菌且标记好的1.5毫升离心管中。

向每根试管中加入等体积的70%乙醇，用移液器将裂解液上下吹打四到五次。当裂解液变得澄清后，将每种溶液转移至贴有标签的硅基离心柱中，放入2毫升收集管内进行离心。弃去穿流液，将离心柱保留在同一收集管中，然后向每个离心柱中加入700微升洗涤缓冲液1，进行第二次离心。

弃去穿流液后，再用500微升洗涤缓冲液二分别洗涤柱子两次，每次500微升。第二次洗涤后，将柱子转移至新的2毫升收集管中，进行另一次离心。向每个柱子的中心加入30微升42摄氏度的无RNase水，离心并回收洗脱的RNA。

进行定量实时聚合酶链式反应（QRTPCR）分析时，每个反应中加入1微升来自10微摩尔储备液的基因特异性正向引物和反向引物，以及0.25微升逆转录酶混合物。请注意，识别寨卡病毒遗传物质的引物可检测病毒基因，从而实现感染程度的定量。接下来，向每个反应中加入12.5微升SYBR Green Mix，随后加入25微升水，并将15微升主混合液加入96孔QPCR板的每个孔中。

使用预混液时，将100纳克RNA样本加入预混液中，并用移液器将预混液分别加入定量PCR板的各个孔中。注意，样本应在同一块定量PCR板上设置三个复孔。然后根据表格中列出的参数，在定量PCR仪上运行样本。

点击系统软件中的熔解曲线选项卡以监测熔解曲线。对于特定基因，所有样本的熔解曲线应显示单一峰，以确认仅存在一种扩增产物。为获得最佳结果，在熔解曲线程序中，各步骤之间的温度增量应为0.5摄氏度，每步最低保持时间为10秒。

然后点击定量数据标签页，获取每个样本的定量循环数据，并将数据导出至电子表格以进行进一步的定量分析。人血清样本可分为三组：登革病毒感染确认样本、登革病毒抗体确认样本，以及无登革病毒中和抗体或RNA的健康血清样本。感染48小时后，qRT-PCR分析显示，大多数含有登革病毒1至4型抗体的血清能够在不同程度上增强寨卡病毒的复制。

与血清型一和三相比，含有登革病毒血清型二和四抗体的血清处理的巨噬细胞中寨卡病毒滴度升高最为显著，而血清型一和三仅引起相对较低的寨卡病毒增殖。保持无菌环境、穿戴适当的个人防护装备，以及始终将解冻后的病毒血清样本和QPCR试剂置于冰上，至关重要。该方案可轻松修改，用于研究其他黄病毒（如黄热病毒、登革病毒或西尼罗病毒）的抗体依赖性增强效应，只需使用一组患者血清即可。

该技术对于今后在节肢动物传播病毒或病毒学领域开展抗体依赖性增强效应研究具有重要意义。实验过程中应始终使用适当的生物安全二级个人防护装备，所有病毒废弃物在丢弃前须用10%漂白剂处理30分钟以彻底去污。