使用与生物素及光裂解连接子相连的RNA一步纯化大分子复合物

该方法适用于致力于分离RNA-蛋白质复合物并利用质谱技术鉴定其组分的研究人员。我们相信，本实验方案在纯化细胞内含量有限且在长时间多步骤纯化过程中易于解离的复合物时尤为有用。该方法的主要优势在于仅需一步纯化步骤，且可适用于任意长度和序列的RNA结合位点。

演示部分步骤的是我们团队的高级研究技术员Xiao-cui Yang。对于显著长于65个核苷酸的结合位点，按照文本方案获取T7体外转录生成的RNA和一条适配器PCB寡核苷酸。在含有100微升结合缓冲液的1.5毫升离心管中，将20皮摩尔的RNA与100皮摩尔的适配器寡核苷酸混合。

将试管放入沸水中，孵育5分钟。然后让水冷却至室温。首先，在1毫升小鼠核提取物中加入pH 8的80毫摩尔EDTA，使其终浓度达到10毫摩尔。

然后加入5至10皮摩尔带有PCB基团标记的RNA底物。冰上孵育5分钟，期间需不时混匀样品。接着使用预冷至4摄氏度的微量离心机，以10,000 × g离心10分钟，以去除任何可能存在的沉淀物。

将上清液小心收集到预冷的新离心管中，注意避免转移沉淀物。取约 100 µL 链霉亲和素琼脂糖珠悬液转移至 1.5 mL 离心管中。加入约 1 mL 结合缓冲液，开始洗涤珠子。

将离心管在25 × g条件下离心2至3分钟，吸除上清液。重复此洗涤和离心过程2至3次，以使磁珠与结合缓冲液达到平衡。将先前收集的含有组装复合物的上清液加载到已平衡的磁珠上。

使用试管旋转仪，在 4 摄氏度下旋转孵育 1 小时，使 RNA 及其结合复合物固定在磁珠上。随后在 25 ×g 条件下离心 2 至 3 分钟，使磁珠沉降至管底。吸除上清液。

随后用结合缓冲液冲洗磁珠两次，采用前述的洗涤步骤。第二次洗涤后，移除上清液，加入1毫升结合缓冲液，在4摄氏度下旋转孵育1小时。然后在25 × g离心2至3分钟，使样品沉淀。

随后加入1毫升结合缓冲液，并将悬液转移至新离心管中。在4摄氏度下旋转孵育样品，时间最长为1小时。将固定化的复合物在25 × g条件下离心2至3分钟。

然后吸去上清液，加入200微升结合缓冲液。将磁珠转移至500微升离心管中。打开发射365纳米紫外光的高强度紫外灯，并使其达到完全亮度。

将培养皿底部填满紧密堆积的冰块，并将冰块堆叠至培养皿盖上方。短暂涡旋含有固定化复合物的离心管。然后将其水平放置在冰上，并用预热的灯罩覆盖，确保样品距离灯泡表面2至3厘米。

将样品照射总共30分钟，期间频繁倒置并涡旋离心管，以确保均匀暴露并防止过热。照射结束后，在25 × g条件下离心2至3分钟以沉淀磁珠，并收集上清液。使用相同条件对该上清液再次进行离心。

收集上清液，注意在离心管底部保留少量液体，以避免转移任何残留的微珠。使用SDS-PAGE电泳分离部分经紫外洗脱的上清液，以及紫外洗脱后留在微珠上的对应组分。随后，使用市售的银染试剂盒对凝胶进行染色。

通过比较紫外洗脱上清液中蛋白质的强度与紫外照射后仍留在珠子上的蛋白质强度，评估紫外洗脱的效率。切下感兴趣的蛋白质条带，并通过质谱法确定其身份。随后，直接对部分紫外洗脱上清液进行质谱分析，以无偏倚的方式确定纯化材料的完整蛋白质组。

本研究中，将带有光裂解生物素标记的茎环RNA与1毫升从小鼠骨髓瘤细胞中提取的细胞质S100提取物共同孵育，并通过银染法分析紫外光洗脱的效果和效率。在紫外光洗脱前，可在链霉亲和素磁珠上检测到多种蛋白质。

长波紫外照射仅能释放部分蛋白质进入上清液，导致磁珠上残留非特异性背景。这凸显了紫外洗脱步骤的重要性。质谱分析鉴定出主要的紫外洗脱蛋白为3'hExo和SLBP，其中SLBP既包含全长蛋白，也包含多种较短的降解产物。

其他被鉴定为多种RNA结合蛋白的蛋白质也有少量在紫外照射下选择性地释放到溶液中。将带有光解性生物素标记的果蝇组蛋白pre-mRNA固定后与核提取物孵育，经紫外洗脱后，仅少量蛋白质被选择性释放至上清液中，而大量非特异性结合的蛋白质仍保留在微珠上。质谱分析鉴定出这些被释放的蛋白质为U7 snRNP的组分。

在存在可阻断U7 snRNP与组蛋白pre-mRNA结合的加工竞争物时，无法检测到这些复合物。应使用高强度紫外灯，并将其置于靠近照射样品的位置，同时确保样品不会过热。紫外洗脱法可获得不含主要污染物的天然RNA-蛋白质复合物，且该复合物可直接用于后续纯化步骤和功能分析。

进行紫外照射时，避免眼睛和皮肤暴露。