生物素和光裂解链接器所附 rna 对高分子配合物的单步纯化

这种方法应该对试图分离RNA蛋白复合物和通过质谱法识别其成分的研究人员感兴趣。我们相信，我们的协议将特别适用于纯化存在于细胞中的复杂物，这些复合物在有限的量中，并且往往在长时间的多步骤纯化过程中分离。这种方法的主要优点是，它只涉及一个纯化步骤，可用于任何长度和序列的RNA结合位点。

展示一些步骤的将是杨晓翠，他是我们团队的高级研究技术人员。对于显著超过65个核苷酸的结合位点，获得T7生成的RNA和文本协议中概述的适配器PCB寡核苷酸。在含有100微升结合缓冲液的1.5毫升管中，将RNA的20个皮毛与100个适配器寡核苷酸的100个皮毛混合。

将管子放入沸水中，让它孵育5分钟。然后让水冷却到室温。首先补充1毫升小鼠核提取物与80毫摩尔EDTA在pH 8到最终浓度10毫摩尔。

然后添加 5 到 10 个与 PCBmoiety 标记的 RNA 基质的皮毛。在冰上孵育5分钟，确保偶尔混合样品。接下来，使用4摄氏度的预冷微离心机，将混合物在10，000倍g下离心10分钟，以去除任何潜在的沉淀物。

小心地将上一液收集到冰上的新管中，同时小心避免转移颗粒。将大约 100 微升的链球菌珠悬浮液转移到 1.5 毫升管中。加入约1毫升的结合缓冲液，开始清洗珠子。

将管以25倍g离心2至3分钟，吸进上一代。重复此洗涤和离心过程 2 至 3 次，以将珠子与结合缓冲液平衡。将先前收集的上一页液加载，该上则包含在平衡珠上组装的复合物。

使用管旋转器，在 4 摄氏度下旋转管 1 小时，使 RNA 固定，将复合物绑在珠子上。接下来在25倍g旋转管2至3分钟，收集管底的珠子。吸上一道。

并使用前面描述的洗涤过程用结合缓冲液冲洗珠子两次。去除第二次洗涤的上经剂后，加入1毫升的装订缓冲液，在4摄氏度下旋转样品1小时。在 25 次 g 下旋转样品 2 到 3 分钟。

接下来添加1毫升的装订缓冲液，并将悬浮液转移到新管。在 4 摄氏度下旋转样品长达 1 小时。将固定化复合物以 25 倍 g 离心 2 至 3 分钟。

然后吸升上一个，并添加200微升的绑定缓冲液。将珠子转移到 500 微升管中。打开在 365 纳米下发射紫外线的高强度紫外灯，让其达到全亮度。

用紧密包装的冰在菜盖上装满培养皿的底部。短暂涡旋含有固定复合物的管子。然后水平地放在冰上，用预热灯盖住，确保样品距离灯泡表面 2 到 3 厘米。

对样品进行总共30分钟的照射，同时经常反转和涡旋管子，以确保均匀的曝光和防止过热。在此之后，在25倍g下旋转珠子2至3分钟，并收集上经剂。使用相同的条件再次离心此上一代。

收集产生的上清液，确保在管底留下少量，以避免转移任何残留的珠子。使用 SDS-PAGE 电泳，将紫外线洗脱的上经液的一小部分和相应的分数与紫外线洗脱后珠子上留下的材料分离。接下来使用市售的银染色套件来染色凝胶。

通过比较紫外洗清液中存在的蛋白质和紫外线照射后珠子上留下的蛋白质的强度来评估紫外线洗脱的效率。通过质谱法切除感兴趣的蛋白质带，并确定其特性。在此之后，通过质谱法直接分析UV洗净上清液的一小部分，以无偏的方式确定纯化材料的整个蛋白质组。

在这项研究中，用光可切割生物素标记的干细胞环RNA用从小鼠骨髓瘤细胞中获得的1毫升细胞质S100提取物进行孵化。通过银染色分析紫外线洗脱的效果和效率。在紫外线洗脱之前，在链球菌珠上检测到许多蛋白质。

长波紫外线照射只释放部分这些蛋白质进入上清液，在珠子上留下非特异性背景。这强调了紫外线洗脱步骤的重要性。质谱法将主要的UV洗发蛋白识别为3'hExo和SLBP，SLBP由全长蛋白和一些较短的降解产物表示。

被鉴定为各种RNA结合蛋白的少量其他蛋白质也通过紫外线照射选择性地释放到溶液中。用核提取物孵育的可光切割生物素标记的固定果蝇组蛋白前mRNA的紫外线洗脱导致只有少量蛋白质选择性地释放到上清液中，珠子上仍然存在非特异性蛋白质的强烈背景。质谱法确定这些蛋白质是U7 snRNP的组成部分。

在阻止 U7 snRNP 与组蛋白预 mRNA 绑定的处理竞争对手面前，不会检测到它们。使用高强度紫外灯，使其与辐照样品保持距离，同时确保其不会过热，这一点很重要。紫外线洗脱方法产生缺乏主要污染物的原生RNA蛋白复合物，并直接适用于额外的纯化步骤和功能测定。

避免在紫外线照射期间接触眼睛和皮肤。