Name: 生物素和光裂解链接器所附 rna 对高分子配合物的单步纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解利用光裂解链接器和温和紫外洗脱技术对RNA/蛋白质复合物进行单步纯化的方法。该技术可保持复合物的天然功能，适用于质谱分析，特别适合纯化含量有限的复合物。

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感谢我们的同事和合作者对本研究工作的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM 29832 支持。

1. 底物制备
注意：短于约65个核苷酸的RNA底物可通过化学合成方法制备，其5’端共价连接有生物素（B）和光裂解连接子（pc）（二者合称为光裂解型生物素或pcB）顺式 构型）。需要生成包含显著更长结合位点的RNA底物 体外 通过T7（或SP6）转录生成，随后与一条在5’端含有pcB基团的短互补接头寡核苷酸退火转 构型）（图1).
<ol>
	<li>对于长度少于约65个核苷酸的结合位点，应使用商业供应商合成材料表) 通过化学方法合成目标RNA，并在RNA的5'端共价连接pcB图1A 和 图2A）。用无菌水溶解至所需浓度，并分装成小份于 -80 °C 保存。</li>
	<li>对于显著长于约65个核苷酸的结合位点，可形成部分双链结构 体外 目标RNA及在5’端含有pcB基团的互补接头寡核苷酸图3A).
	<ol>
		<li>对线性化的质粒DNA或合适的PCR模板进行T7转录，以生成在3’端延伸约20个核苷酸任意序列的含有目标结合位点的RNA。</li>
		<li>使用商业生产商（材料表) 化学合成一种接头寡核苷酸，该寡核苷酸与T7生成的RNA的3’延伸端互补，并在5’端含有pcB (图 3A). 
		注意：可在寡核苷酸5’端添加两个18原子间隔基和2-3个非互补核苷酸，以减少结合复合物与链霉亲和素磁珠之间可能的空间位阻。此外，建议对寡核苷酸均匀修饰2’-O-甲基基团，以增强双链稳定性并提高对多种核酸酶的抗性。</li>
		<li>将T7体外转录生成的RNA与pcB接头寡核苷酸退火。
		<ol>
			<li>将20 pmol的RNA与100 pmol的接头pcB寡核苷酸（摩尔比1:5）混合于1.5 mL离心管中，加入100 µL结合缓冲液，其组成为：75 mM KCl、15 mM HEPES（pH 7.9）、15%甘油、10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。 
			注意：在退火反应中，应使用足以与大多数（即使不是全部）pre-mRNA底物形成双链的最少量衔接子寡核苷酸。该用量可通过将RNA底物的5’端标记来方便地确定 32P，通过使用不同的缓冲条件，将标记的底物与不断增加量的衔接寡核苷酸进行退火，并在用结合缓冲液多次洗涤链霉亲和素磁珠后，检测磁珠上放射性信号的保留情况。</li>
			<li>将试管放入沸水中5分钟。</li>
			<li>让水冷却至室温。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 复合物组装
<ol>
	<li>向1 mL小鼠核提取物（或其他选定的提取物）中加入80 mM EDTA（pH 8），使其终浓度达到10 mM，以抑制提取物中存在的非特异性金属依赖性核酸酶。 
	注意：这将使提取物中的缓冲液成分调整至与结合缓冲液相同（参见步骤 1.2.3.1）。EDTA 不影响 体外 组蛋白前体mRNA的加工过程可能会受到干扰，但在纯化以镁离子依赖方式组装的蛋白质或蛋白质复合物时，EDTA可能产生不利影响。在这些情况下，应避免使用EDTA。</li>
	<li>加入5-10 pmol带有pcB基团标记的RNA底物 顺式 （参见步骤 1.1）或 转 （参见步骤 1.2.3.3）至含有 10 mM EDTA 的 1 mL 提取液中。 
	注意：RNA 的用量需要通过一系列预实验仔细评估。当使用过量的 RNA 底物来纯化有限量的复合物时，可能会适得其反，导致非特异性 RNA 结合蛋白的背景显著增加，而对特异性蛋白的得率并无改善。</li>
	<li>将RNA底物与提取物在冰上孵育5分钟，期间偶尔混合样品。 
	注意：孵育的时间和温度需通过实验确定，可能因RNA/蛋白质复合物的具体性质不同而有显著差异。</li>
	<li>在预冷的微量离心机中以10,000 × g离心10分钟，去除可能存在的沉淀物，并小心收集上清液，避免转移沉淀。</li>
</ol>
3. 将RNA/蛋白质复合物固定在链霉亲和素磁珠上。
<ol>
	<li>从商业供应商处（材料表）取约 100 µL 链霉亲和素琼脂糖珠悬浮液，加入结合缓冲液（75 mM KCl，15 mM HEPES pH 7.9，15% 甘油，10 mM EDTA）使总体积增加。 
	注意：该缓冲液的组成应与退火混合物及用于复合物组装的提取物（步骤 2.1）中的缓冲液相同。</li>
	<li>在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，使珠子沉降至管底，吸除上清液。</li>
	<li>重复相同的洗涤/离心步骤 2–3 次，使珠子与结合缓冲液达到平衡。 
	注意：此步骤结束时，珠子沉淀的体积应约为 30 µL。</li>
	<li>将含有已组装复合物的上清液（步骤 2.4）加载至已平衡的链霉亲和素琼脂糖珠上。</li>
	<li>在 4 °C 下旋转孵育 1 小时，使 RNA 及其结合的复合物固定在珠子上。</li>
	<li>在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，使珠子沉降至管底。 
	注意：若使用角转子时珠子容易粘附于管壁，建议使用水平转子以避免珠子大量损失。</li>
	<li>吸除上清液，并用 1 mL 结合缓冲液洗涤珠子两次，每次均采用相同的离心条件。</li>
	<li>加入 1 mL 结合缓冲液，在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。 
	注意：若底物上形成的复合物容易解离，此步骤可适当缩短。</li>
	<li>在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟使珠子沉淀，加入 1 mL 缓冲液，将悬浮液转移至新管中。</li>
	<li>若复合物不稳定，可额外旋转孵育 1 小时或更短时间，随后在 25 × g 条件下离心 2–3 分钟，将珠子用 200 µL 结合缓冲液重悬并转移至 500 µL 管中。</li>
</ol>
4. 紫外洗脱。
<ol>
	<li>在使用高强度紫外灯照射前，先开启发射365 nm紫外光的紫外灯，预热5-10分钟，直至达到最大亮度。 
	注意：此步骤对于在照射开始时获得最大紫外发射能量至关重要。</li>
	<li>将一个培养皿（100 mm × 15 mm）底部装满紧密堆积的冰块，并将其倒置放置在培养皿盖上。</li>
	<li>短暂涡旋含有固定化复合物的离心管，将其水平放置于冰上，并用预热的紫外灯覆盖，确保样品位于灯泡表面2-3 cm的距离范围内。 
	注意：若距离过远，可使用额外的培养皿或其他合适物体将样品调整至更接近灯泡的位置。</li>
	<li>总共照射30分钟，期间频繁翻转并涡旋离心管，以确保悬浮液均匀暴露于紫外光下，并防止过热。 
	注意：为提供额外冷却，紫外洗脱步骤可在低温房间内进行。若冰块融化过多，应更换为装有新鲜冰块的培养皿。</li>
	<li>在25 × g条件下离心2-3分钟，收集上清液。</li>
	<li>使用相同条件再次离心上清液，并收集上清液。 
	注意：保留底部少量上清液，以避免转移残留的微珠。</li>
</ol>
5. 样品分析：银染后接质谱检测。
<ol>
	<li>采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离部分紫外光洗脱的上清液以及紫外光洗脱后留在珠粒上的等量组分。 
	注意：分析时也可包括在紫外光洗脱前从样品中取出的部分珠粒。</li>
	<li>使用市售的银染试剂盒对含有分离蛋白的凝胶进行染色。</li>
	<li>通过比较紫外光洗脱上清液中蛋白质与紫外光照射后仍留在珠粒上的蛋白质条带强度，评估紫外光洗脱效率。</li>
	<li>切下目标蛋白条带，按照标准方案通过质谱法确定其身份10,15。</li>
</ol>
6. 通过质谱法对紫外洗脱样品进行全局分析。
<ol>
	<li>通过质谱直接分析部分紫外洗脱上清液，以无偏倚的方式确定纯化材料的完整蛋白质组。 
	注意：可通过将纯化样品在溶液中用胰蛋白酶处理，然后采用标准质谱分析流程，鉴定所生成肽段的序列10,15。</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
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<li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10%2C+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li>
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<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5%27-end-labeling%2C+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li>
<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li>
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<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本文所述方法简便易行，除引入光裂解接头和紫外洗脱步骤外，其余操作与常规利用生物素和链霉亲和素之间极强相互作用的方法并无差异。紫外洗脱步骤效率很高，通常可释放超过75%的固定化RNA及其结合蛋白，但会留下大量非特异性结合于微珠的蛋白质背景。通过消除这一背景干扰，紫外洗脱步骤可获得纯度极高的样品，可直接用于银染、质谱分析及功能实验。
由于步骤相对较少且操作简单，紫外洗脱法具有高度可重复性，仅需100 µL小鼠和Drosophila核提取物即可获得足量的U7 snRNP，适用于银染分析15。该方法为以往用于纯化RNA/蛋白质复合物的其他实验策略提供了一种理想的替代方案，后者包括在RNA底物上标记MS2结合位点，并通过MS2-MBP融合蛋白将相关复合物固定在麦芽糖珠上。尽管MS2策略在分离相对丰度较高的剪接体和经典的3'端加工复合物方面已取得成功22,23，但无法获得足量的含有U7 snRNP的加工复合物（Z...

在真核生物中，由RNA聚合酶II生成的信使RNA前体（pre-mRNA）在进入细胞质作为蛋白质合成的成熟mRNA模板之前，需在细胞核内经历多个成熟过程。其中一项关键步骤是3'端加工。对于绝大多数pre-mRNA而言，3'端加工包括与多聚腺苷酸化偶联的切割反应。这一两步反应由一个包含15种以上蛋白质的相对丰富的复合物催化1。而动物中依赖复制的组蛋白pre-mRNA则通过另一种不同的机制进行3'端加工，其中U7核小核糖核蛋白（U7 snRNP）发挥关键作用。U7 snRNP是一种丰度较低的复合物，由长约60个核苷酸的U7 snRNA和多种蛋白质组成2,3。U7 snRNA通过与组蛋白pre-mRNA中的特定序列碱基配对，其复合物中的一个亚基催化切割反应，从而产生成熟的、不带poly(A)尾的组蛋白mRNA。组蛋白pre-mRNA的3'端加工还需要茎环结构结合蛋白（Stem-Loop Binding Protein, SLBP），该蛋白结合于切割位点上游保守的茎环结构，并促进U7 snRNP向底物的募集2,3。由于U7 snRNP在动物细胞中浓度极低，且在纯化过程中容易因使用温和去污剂4,5,6、高盐洗涤和/或多次层析步骤7,8,9而发生解离或部分蛋白水解，因此针对U7 snRNP各个组分的鉴定研究一直面临挑战。
最近，为了确定依赖U7的加工机器的组成，将带有生物素标记的组蛋白前体mRNA短片段（位于3'端或5'端）与核提取物共同孵育，并利用链霉亲和素包被的琼脂糖磁珠捕获组装形成的复合物5,6,10。由于生物素与链霉亲和素之间的结合极为牢固，固定在链霉亲和素磁珠上的蛋白质需在变性条件下通过SDS煮沸洗脱，并通过银染和质谱分析进行检测。尽管这种简单的方法鉴定出了U7 snRNP的多个组分，但所获得的样品纯度相对较低，常常被大量非特异性结合到链霉亲和素磁珠上的背景蛋白污染，这可能掩盖加工机器中的某些组分，从而阻碍其在银染凝胶上的检测5,6,10。更重要的是，该方法排除了对分离材料进行任何功能性研究的可能性，也无法通过其他方法进一步纯化至均一状态。
为了应对生物素/链霉亲和素相互作用几乎不可逆的特性，人们陆续提出了多种改进方法，其中大多数旨在削弱该相互作用，或在含生物素的试剂中引入可化学切割的间隔臂11,12。然而，这些改进方法的缺点在于会显著降低方法的效率，和/或在洗脱步骤中常常需要非生理条件，从而可能损害纯化后蛋白质的完整性或活性。
此处，我们描述了一种不同的方法，通过使用在5'端共价连接生物素的RNA底物，以解决生物素/链霉亲和素策略的固有缺陷。 通过 对长波紫外光敏感的光裂解性1-(2-硝基苯基)乙基部分13,14我们测试了该方法用于从限速的依赖U7的加工机器中进行纯化 果蝇 哺乳动物核提取物15在将含有生物素和光裂解连接子的组蛋白前体mRNA与核提取物进行短暂孵育后，组装形成的加工复合物被固定在链霉亲和素磁珠上，经充分洗涤后，通过暴露于约360 nm的紫外光下，以天然形式温和地释放至溶液中。该紫外洗脱方法高效、快速且操作简便，可获得足量的U7 snRNP，通过银染即可观察其组分&#160;仅需 100 µL 提取液15紫外光洗脱的产物不含背景蛋白，可直接用于质谱分析、进一步纯化步骤以及酶学检测。该方法也可用于纯化其他需要相对较短RNA结合位点的RNA/蛋白质复合物。生物素和光裂解连接子还可共价连接至单链和双链DNA，因而有望将紫外光洗脱法拓展应用于多种DNA/蛋白质复合物的纯化。
化学合成含有共价连接的生物素和光裂解连接臂的RNA底物仅适用于长度不超过约65个核苷酸的序列，对于显著更长的序列则变得昂贵且效率低下。为解决这一问题，我们还开发了一种适用于更长RNA结合靶标的替代方法。该方法可生成任意长度和核苷酸序列的RNA 体外 通过T7或SP6转录生成，并与一条短的互补寡核苷酸退火，该寡核苷酸在5'端含有生物素和光裂解连接子（转 构型）。随后利用链霉亲和素磁珠，按照与共价连接光裂解生物素的RNA底物相同的纯化方案，对形成的双链进行单个结合蛋白或大分子复合物的纯化。顺式 构型）。通过这一改进，光裂解生物素可与 体外 含有数百个核苷酸的转录产物，扩展了紫外洗脱法在多种RNA/蛋白质纯化中的应用。

<table><tbody><tr><td>链霉亲和素-琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>S1638-5ML</td><td></td></tr><tr><td>高强度长波紫外灯</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-00</td><td></td></tr><tr><td>替换灯泡</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-19</td><td>100 瓦汞 H44GS-100M 灯泡，发射 366 nm 紫外光（Sylvania）</td></tr><tr><td>含有生物素和光裂解接头的 RNA 和寡核苷酸，位于 &lt;em&gt;cis&lt;/em&gt;</td><td>Dharmacon (科罗拉多州拉法叶) 或 Integrated DNA Technologies, Inc. (爱荷华州科勒维尔)</td><td></td><td>向 Dharmacon 申请报价</td></tr><tr><td>Beckman GH 3.8 摆桶转子</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（T7 聚合酶）</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX 大规模 RNA 生产系统（SP6 聚合酶）</td><td>Promega</td><td>P1280</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 银染试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24612</td><td></td></tr></tbody></table>

使用与生物素及光裂解连接子相连的rna一步纯化大分子复合物

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

多年来，生物素与链霉亲和素之间异常强且快速形成的相互作用已被成功用于部分纯化具有重要生物学意义的RNA/蛋白质复合物。然而，该策略存在一个主要缺点，限制了其更广泛的应用：生物素与链霉亲和素的相互作用只能在变性条件下被破坏，而这些条件同时会破坏洗脱复合物的完整性，从而无法进行后续的功能分析和/或通过其他方法进一步纯化。此外，洗脱样品常常被非特异性结合到链霉亲和素磁珠上的背景蛋白所污染，这使得通过银染和质谱分析纯化后的复合物变得复杂。为克服这些局限性，我们开发了一种生物素/链霉亲和素策略的改进方法，其中生物素通过光裂解连接子共价连接至RNA底物，将复合物固定在链霉亲和素磁珠上后，利用长波紫外光照射选择性地以天然构象形式将目标复合物洗脱至溶液中，而背景蛋白则保留在磁珠上。较短的RNA结合底物可通过化学合成方法制备，将生物素和光裂解连接子共价连接至RNA的5'端；而对于较长的RNA底物，则可通过互补寡核苷酸引入这两个基团。这两种紫外光洗脱方法均已被用于纯化依赖U7 snRNP的加工复合物（该复合物负责在3'端切割组蛋白前体mRNA），结果表明其性能优于此前开发的其他纯化方法。经紫外光洗脱的样品中含有可清晰检测到的U7 snRNP，且基本无主要蛋白污染物，适用于直接进行质谱分析和功能检测。所述方法可轻松适用于其他RNA结合复合物的纯化，并可结合单链或双链DNA结合位点，用于纯化DNA特异性蛋白及大分子复合物。

采用UV洗脱法对两种在5'端共价连接pcB基团的化学合成RNA底物进行了测试（顺式 配置）：pcB-SL（图1）和 pcB-dH3/5m RNA（图2）。31个核苷酸的pcB-SL RNA包含一个茎环结构，其后接一个5个核苷酸的单链尾部，其序列与成熟组蛋白mRNA的3'端相同（即，发生在U7 snRNP对组蛋白前体mRNA进行切割之后）。这一独特序列是哺乳动物细胞质组分中两种蛋白质SLBP和3'hExo的已知结合位点16,17,18.pcB-dH3/5m 是一段 63 个核苷酸的片段 果蝇 H3组蛋白pre-mRNA除茎环结构外，还含有一段结合序列 果蝇 U7 snRNP（<strong class...

使用生物素-链霉亲和素策略纯化的RNA/蛋白质复合物在变性条件下洗脱至溶液中，其形式不适合进一步的纯化和功能分析。在此，我们描述了该策略的一种改进方法，该方法在RNA中利用光裂解接头并结合温和的紫外洗脱步骤，从而获得天然且完全具有功能的RNA/蛋白质复合物。

使用与生物素及光裂解连接子相连的RNA一步纯化大分子复合物

多年来，生物素与链霉亲和素之间极其牢固且快速形成的相互作用已被成功用于部分……

该方法适用于致力于分离RNA-蛋白质复合物并利用质谱技术鉴定其组分的研究人员。我们相信，本实验方案在纯化细胞内含量有限且在长时间多步骤纯化过程中易于解离的复合物时尤为有用。该方法的主要优势在于仅需一步纯化步骤，且可适用于任意长度和序列的RNA结合位点。演示部分步骤的是我们团队的高级研究技术员Xiao-cui Yang。对于显著长于65个核苷酸的结合位点，按照文本方案获取T7体外转录生成的RNA和一条适配器PCB寡核苷酸。在含有100微升结合缓冲液的1.5毫升离心管中，将20皮摩尔的RNA与100皮摩尔的适配器寡核苷酸混合。将试管放入沸水中，孵育5分钟。然后让水冷却至室温。首先，在1毫升小鼠核提取物中加入pH 8的80毫摩尔EDTA，使其终浓度达到10毫摩尔。然后加入5至10皮摩尔带有PCB基团标记的RNA底物。冰上孵育5分钟，期间需不时混匀样品。接着使用预冷至4摄氏度的微量离心机，以10,000 × g离心10分钟，以去除任何可能存在的沉淀物。将上清液小心收集到预冷的新离心管中，注意避免转移沉淀物。取约 100 µL 链霉亲和素琼脂糖珠悬液转移至 1.5 mL 离心管中。加入约 1 mL 结合缓冲液，开始洗涤珠子。将离心管在25 × g条件下离心2至3分钟，吸除上清液。重复此洗涤和离心过程2至3次，以使磁珠与结合缓冲液达到平衡。将先前收集的含有组装复合物的上清液加载到已平衡的磁珠上。使用试管旋转仪，在 4 摄氏度下旋转孵育 1 小时，使 RNA 及其结合复合物固定在磁珠上。随后在 25 ×g 条件下离心 2 至 3 分钟，使磁珠沉降至管底。吸除上清液。随后用结合缓冲液冲洗磁珠两次，采用前述的洗涤步骤。第二次洗涤后，移除上清液，加入1毫升结合缓冲液，在4摄氏度下旋转孵育1小时。然后在25 × g离心2至3分钟，使样品沉淀。随后加入1毫升结合缓冲液，并将悬液转移至新离心管中。在4摄氏度下旋转孵育样品，时间最长为1小时。将固定化的复合物在25 × g条件下离心2至3分钟。然后吸去上清液，加入200微升结合缓冲液。将磁珠转移至500微升离心管中。打开发射365纳米紫外光的高强度紫外灯，并使其达到完全亮度。将培养皿底部填满紧密堆积的冰块，并将冰块堆叠至培养皿盖上方。短暂涡旋含有固定化复合物的离心管。然后将其水平放置在冰上，并用预热的灯罩覆盖，确保样品距离灯泡表面2至3厘米。将样品照射总共30分钟，期间频繁倒置并涡旋离心管，以确保均匀暴露并防止过热。照射结束后，在25 × g条件下离心2至3分钟以沉淀磁珠，并收集上清液。使用相同条件对该上清液再次进行离心。收集上清液，注意在离心管底部保留少量液体，以避免转移任何残留的微珠。使用SDS-PAGE电泳分离部分经紫外洗脱的上清液，以及紫外洗脱后留在微珠上的对应组分。随后，使用市售的银染试剂盒对凝胶进行染色。通过比较紫外洗脱上清液中蛋白质的强度与紫外照射后仍留在珠子上的蛋白质强度，评估紫外洗脱的效率。切下感兴趣的蛋白质条带，并通过质谱法确定其身份。随后，直接对部分紫外洗脱上清液进行质谱分析，以无偏倚的方式确定纯化材料的完整蛋白质组。本研究中，将带有光裂解生物素标记的茎环RNA与1毫升从小鼠骨髓瘤细胞中提取的细胞质S100提取物共同孵育，并通过银染法分析紫外光洗脱的效果和效率。在紫外光洗脱前，可在链霉亲和素磁珠上检测到多种蛋白质。长波紫外照射仅能释放部分蛋白质进入上清液，导致磁珠上残留非特异性背景。这凸显了紫外洗脱步骤的重要性。质谱分析鉴定出主要的紫外洗脱蛋白为3'hExo和SLBP，其中SLBP既包含全长蛋白，也包含多种较短的降解产物。其他被鉴定为多种RNA结合蛋白的蛋白质也有少量在紫外照射下选择性地释放到溶液中。将带有光解性生物素标记的果蝇组蛋白pre-mRNA固定后与核提取物孵育，经紫外洗脱后，仅少量蛋白质被选择性释放至上清液中，而大量非特异性结合的蛋白质仍保留在微珠上。质谱分析鉴定出这些被释放的蛋白质为U7 snRNP的组分。在存在可阻断U7 snRNP与组蛋白pre-mRNA结合的加工竞争物时，无法检测到这些复合物。应使用高强度紫外灯，并将其置于靠近照射样品的位置，同时确保样品不会过热。紫外洗脱法可获得不含主要污染物的天然RNA-蛋白质复合物，且该复合物可直接用于后续纯化步骤和功能分析。进行紫外照射时，避免眼睛和皮肤暴露。

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生物化学

生物素和光裂解链接器所附 rna 对高分子配合物的单步纯化

本视频演示了一种 体外 RNA下拉实验用于鉴定与mRNA中腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）序列相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。将细胞裂解液中的目标RBPs与RNA探针混合，形成RNA-蛋白质复合物，随后分离这些复合物 通过...

RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

本文描述了一种高效纯化双Strep标签融合蛋白及其特异性复合物的方法，该方法采用经Bis(sulfosuccinimidyl)...

一步纯化双Strep-tag标记蛋白及其复合物的Strep-Tactin树脂交联方法：使用BS3（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂

microRNA（miRNA）是一类广泛保守的调控分子。本文介绍一种miRNA克隆方法，该方法依赖于两个高效的连接步骤，随后进行高通量测序。本方法可实现miRNA的全基因组范围内精确量化。...

小RNA分子的高效连接用于基于高通量测序的微小RNA定量

RNA-蛋白质相互作用是许多细胞过程的核心。本文介绍一种在活体（in...

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此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA...

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本文介绍了一种应用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略的详细方案，用于鉴定与编码RNA和非编码RNA结合的蛋白质。...

利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白

本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol...

用于解析共转录 RNA 加工事件的人工 RNA 聚合酶 II 延伸复合物

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方案，称为FbioCLIP-seq，通过FLAG-生物素串联纯化技术来确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。...

基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

本文介绍了一种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的测序方法的详细实验方案，该方法可作为直接测序短链RNA（&lt;35...

2D-HELS MS Seq：一种基于液相色谱-质谱的通用方法，用于直接从头测序含不同核苷酸修饰的RNA混合物

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

了解利用光裂解链接器和温和紫外洗脱技术对RNA/蛋白质复合物进行单步纯化的方法。该技术可保持复合物的天然功能，适用于质谱分析，特别适合纯化含量有限的复合物。

使用与生物素及光裂解连接子相连的RNA一步纯化大分子复合物

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