Name: 在研究隐球菌-阿米巴相互作用中,显微技术和荧光读数的补充应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习利用共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜研究隐球菌与阿米巴的共培养吞噬作用。该方法结合定量与定性数据，深入解析Cryptococcus neoformans在感染过程中的细胞行为机制。

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本工作得到了南非国家研究基金会（资助编号：UID 87903）和自由州大学的资助。我们还感谢Pieter van Wyk和Hanlie Grobler在显微镜研究过程中提供的服务与协助。

Cryptococcus neoformans 和某些 Acanthamoeba castellanii 菌株被视为生物安全等级2（BSL-2）病原体；因此，研究人员在操作这些生物体时必须采取适当的预防措施。例如，实验室人员应接受专门培训，并穿戴个人防护装备（PPE），如实验服、手套和护目用具。对于可能引起感染的操作，应使用二级生物安全柜14。
1. 真菌细胞的培养与标准化（改编自 Madu 等人15）
<ol>
	<li>从储备培养物（不超过9个月）中将测试真菌菌株（即 C. neoformans UOFS Y-1378 和 C. neoformans LMPE 046）划线接种至酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂平板上。YPD 琼脂的成分信息见表1。 
	注：C. neoformans UOFS Y-1378 被证实可产生3-羟基脂肪酸，而 C. neoformans LMPE 046 不产生3-羟基脂肪酸。有关这些分子存在性检测方法的信息，请参见补充文件1。</li>
	<li>将琼脂平板在30 °C下培养48小时。 
	注：平板可在4 °C下保存最多2个月，之后可丢弃或用于制备储备培养物16。</li>
	<li>用接种环从培养48小时的平板上刮取适量隐球菌细胞（C. neoformans UOFS Y-1378 或 C. neoformans LMPE 046），接种至含有100 mL化学成分明确的YNB肉汤（6.7 g/L）并添加4%（w/v）葡萄糖的250 mL锥形瓶中。YNB肉汤的成分信息见表2。</li>
	<li>将锥形瓶置于30 °C、160 rpm的旋转摇床中振荡培养24小时。</li>
	<li>培养24小时后，使用血细胞计数板对真菌细胞进行计数，并用pH 7.4的PBS将细胞浓度调整至1 × 106 个/mL。 
	注：制备好的 C. neoformans UOFS Y-1378 接种物用于步骤3.1和3.2，而 C. neoformans LMPE 046 接种物仅用于步骤3.2。</li>
</ol>
2. 变形虫细胞的培养与标准化（改编自 Madu 等人15）
<ol>
	<li>解冻一管Acanthamoeba castellanii储备培养物，并将其恢复至室温（RT）。 
	注：阿米巴培养物的制备依据Axelsson-Olsson等8和Schuster17改良的实验方案。</li>
	<li>用移液器吸取1 mL解冻后的培养物，接种至含有15 mL ATCC培养基712的无菌50 mL离心管中。ATCC培养基712的成分信息见表3。</li>
	<li>手动轻轻振荡混匀，立即在30 °C条件下以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于15 mL ATCC培养基712中，于30 °C培养14天。 
	注：定期使用普通光学显微镜观察细胞，判断其是否处于滋养体状态。一旦细胞进入滋养体状态，即开始新的培养。</li>
	<li>从处于滋养体状态的培养物中吸取1 mL，接种至含有15 mL新鲜无菌ATCC培养基712的无菌50 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管置于30 °C恒温摇床中，以160 rpm振荡培养1周。</li>
	<li>一周后，使用血细胞计数板对阿米巴细胞进行计数，并用新鲜无菌的ATCC培养基712将细胞浓度调整至1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>按照Strober18所述方法，使用台盼蓝染色进行细胞活力检测。仅继续使用细胞活力不低于80%的培养物进行后续实验。</li>
</ol>
3. 研究吞噬作用的细胞荧光染色（改编自 Madu 等人15）
<ol>
	<li>通过荧光显微镜获取定性数据 
	注意：本实验需使用 Acanthamoeba castellanii 和 C. neoformans UOFS Y-1378。
	<ol>
		<li>将200 µL标准化的阿米巴悬液（浓度为1 × 107 个细胞/mL，溶于ATCC培养基712）加入粘附载玻片的腔室孔中，在30 °C下孵育2小时，使细胞贴附于表面。</li>
		<li>在阿米巴细胞沉降贴附的同时，将标准化的C. neoformans UOFS Y-1378细胞（调整至1 × 106 个细胞/mL，溶于999 µL PBS中）转移至1.5 mL塑料离心管中，并加入1 µL异硫氰酸荧光素进行染色。 
		注意：染色液的配制方法为将1 mg异硫氰酸荧光素溶解于1 mL丙酮中。</li>
		<li>将C. neoformans UOFS Y-1378细胞置于摇床（转速设为50 rpm）上，在室温、避光条件下轻轻振荡2小时。</li>
		<li>2小时后，在30 °C下以960 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，去除含染料的PBS。</li>
		<li>向离心管中加入1 mL PBS以洗涤细胞沉淀，通过轻柔吹打进行清洗。</li>
		<li>在30 °C下以960 × g离心5分钟，弃去上清液。再重复洗涤一次。</li>
		<li>将洗涤后的细胞重悬于1 mL PBS中。</li>
		<li>取200 µL染色后的C. neoformans UOFS Y-1378细胞悬液加入含有未染色阿米巴细胞的腔室孔中。</li>
		<li>将共培养体系在30 °C下继续孵育2小时。 
		注意：可根据实验目的调整共培养的孵育时间。</li>
		<li>共孵育结束后，吸除孔内所有内容物。</li>
		<li>向孔中加入300 µL PBS，轻轻吹打以洗涤腔室孔并去除未结合的共培养细胞，随后吸除孔内液体。再重复洗涤一次。</li>
		<li>通过将3 mL戊二醛加入97 mL蒸馏水中，配制3%戊二醛固定液。</li>
		<li>向腔室孔中加入250 µL 3%戊二醛溶液，固定共培养细胞，孵育1小时。</li>
		<li>吸除固定液，并按照步骤3.1.13所述方法洗涤腔室孔。</li>
		<li>使用随腔室载玻片提供的工具拆卸腔室。</li>
		<li>在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭剂1,4-二氮杂双环[2.2.2]-辛烷，盖上盖玻片，并用指甲油封边以防止蒸发。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜的100倍物镜（油镜）观察共培养细胞。 
		注意：应同时在明场和荧光模式下拍照，以观察阿米巴与隐球菌细胞之间的相互作用。如条件允许，可将荧光图像叠加至明场图像上。阿米巴细胞通常较大（约45–60 µm），滋养体形态不规则；隐球菌细胞直径为5–10 µm，呈球形至卵圆形。当受到激光激发时，未染色的阿米巴细胞可能产生自发荧光。有关降低自发荧光的方法，请参阅Beisker和Dolbeare19以及Clancy和Cauller20。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光酶标仪获取定量数据 
	注意：本实验需使用Acanthamoeba castellanii与C. neoformans UOFS Y-1378或C. neoformans LMPE 046。
	<ol>
		<li>将100 µL标准化的阿米巴悬液（浓度调整为1 × 107 个细胞/mL，溶于ATCC培养基712）加入黑色粘附型96孔微孔板中。</li>
		<li>将微孔板在30 °C下孵育2小时，使阿米巴细胞贴附于孔底表面。</li>
		<li>在阿米巴细胞沉降贴附的同时，将标准化的C. neoformans UOFS Y-1378细胞（调整至1 × 106 个细胞/mL，溶于999 µL PBS中）转移至1.5 mL微量离心管中，并加入1 µL pHrodo Green Zymosan A BioParticles进行染色。另取一管对C. neoformans LMPE 046细胞进行同样染色。 
		注意：该染料与FITC不同，仅特异性地标记被吞噬细胞酸性环境包裹的细胞21,22。因此，实验过程中必须保持隐球菌细胞处于中性pH的介质（PBS）中，阿米巴细胞处于中性pH的培养基（ATCC培养基712）中。若使用酸性环境的培养基，会导致相对荧光单位出现假阳性读数，错误提示有更多隐球菌被内化。</li>
		<li>将隐球菌细胞置于摇床（转速设为50 rpm）上，在室温、避光条件下轻轻振荡2小时。</li>
		<li>2小时后，在30 °C下以960 × g离心5分钟，使细胞沉淀。吸除上清液以去除含染料的PBS。</li>
		<li>向离心管中加入1 mL PBS以洗涤沉淀细胞，通过轻柔吹打进行清洗。</li>
		<li>在30 °C下以960 × g离心5分钟，弃去上清液。再重复洗涤一次。</li>
		<li>将洗涤后的细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。</li>
		<li>取100 µL染色后的隐球菌细胞悬液加入含有未染色阿米巴细胞的孔中。</li>
		<li>将共培养体系在30 °C下继续孵育2小时。 
		注意：可根据实验目的调整共培养的孵育时间点。</li>
		<li>共孵育结束后，使用微孔板荧光读数仪检测荧光强度，并将对数信号转换为相对荧光单位。 
		注意：该染料的激发波长为492 nm，发射波长为538 nm。有关降低自发荧光的方法，请参阅Beisker和Dolbeare19以及Clancy和Cauller20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 利用透射电子显微镜研究吞噬作用（改编自 van Wyk 和 Wingfield23）
<ol>
	<li>将5 mL阿米巴悬液（用ATCC培养基712调整至1 × 107 个细胞/mL）加入15 mL离心管中，在30 °C下静置30分钟，使其沉降。</li>
	<li>向含有5 mL标准化阿米巴细胞的同一离心管中加入5 mL新型隐球菌（C. neoformans）UOFS Y-1378细胞悬液（用PBS调整至1 × 106 个细胞/mL）。</li>
	<li>将离心管在30 °C下静置2小时。</li>
	<li>在30 °C下以640 × g离心3分钟，使共培养细胞沉淀，吸除上清液。共培养细胞无需洗涤。</li>
	<li>通过将沉淀重悬于3 mL 1.0 M（pH = 7.0）磷酸钠缓冲的3%戊二醛中，固定共培养细胞，固定时间为3小时。</li>
	<li>在30 °C下以1,120 × g离心5分钟，使共培养细胞沉淀，吸除上清液。</li>
	<li>向离心管中加入5 mL磷酸钠缓冲液以洗涤沉淀细胞。轻轻吹打管内内容物20秒进行洗涤。</li>
	<li>在30 °C下以1,120 × g离心5分钟，使共培养细胞沉淀。</li>
	<li>重复步骤4.8–4.10，吸除上清液。</li>
	<li>再次固定共培养细胞：将沉淀重悬于3 mL 1.0 M（pH = 7.0）磷酸钠缓冲的1%四氧化锇中，固定1.5小时。</li>
	<li>以与去除3%戊二醛相同的方式洗涤共培养细胞，去除四氧化锇固定剂。</li>
	<li>对透射电镜样品（即共培养细胞）进行梯度丙酮脱水处理，依次使用30%、50%、70%、95%及两次100%丙酮，每次15分钟。具体操作为：向沉淀细胞中加入3 mL相应浓度丙酮溶液，静置15分钟；然后在室温下以200 × g离心10分钟，弃去上清液，再加入下一浓度更高的丙酮溶液。</li>
	<li>根据Spur24的方案制备常规稠度的环氧树脂。 
	注：环氧树脂用于切片。</li>
	<li>将透射电镜样品包埋于新配制的环氧树脂中。操作步骤如下：
	<ol>
		<li>向含有透射电镜样品（重悬于3 mL 100%丙酮溶液中）的离心管中加入3 mL新配制的环氧树脂，静置1小时。</li>
		<li>在30 °C下以200 × g离心10分钟，吸除环氧树脂-丙酮混合液。</li>
		<li>向管中沉淀物加入6 mL新配制的环氧树脂，静置1小时。</li>
		<li>在30 °C下以200 × g离心10分钟，吸除全部环氧树脂-丙酮混合液。</li>
		<li>向管中加入3 mL新配制的环氧树脂，静置8小时。</li>
		<li>在30 °C下以200 × g离心10分钟，吸除全部环氧树脂溶液。</li>
		<li>向管中加入3 mL新配制的环氧树脂，将透射电镜样品在环氧树脂溶液中于真空干燥器中过夜保存。 
		警告：环氧树脂为放射性物质。操作时应穿戴个人防护装备（PPE），并在通风橱中进行。研究人员应遵循各国规定的此类材料废弃安全规程25。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在70 °C下对透射电镜样品进行8小时聚合处理。</li>
	<li>在超薄切片机上，使用安装好的玻璃刀从环氧树脂包埋的样品上切取约0.1 mm × 0.1 mm、厚度为60 nm的小片。将切片收集至载网上，在染色前将载网放入透射电镜样品盒中。</li>
	<li>在避光条件下，用一滴6%醋酸铀染色10分钟，确保切片完全覆盖。 
	注：将染色剂（6 g）溶于100 mL蒸馏水中配制。 
	警告：醋酸铀为放射性物质。操作时应穿戴个人防护装备（PPE），并在通风橱中进行。研究人员应遵循各国规定的此类材料废弃安全规程25。</li>
	<li>将载网在盛有100 mL蒸馏水的烧杯中浸洗五次。 
	注：因蒸馏水中含有微量醋酸铀，应按规定妥善处理。</li>
	<li>在避光条件下，用一滴柠檬酸铅染色10分钟，确保切片完全覆盖。 
	注：柠檬酸铅应根据Reynold26的方案配制。</li>
	<li>将载网在盛有100 mL蒸馏水的烧杯中浸洗五次。</li>
	<li>将染色后的切片分别装载至载网，并放入透射电镜样品盒中。</li>
	<li>使用透射电子显微镜观察切片。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本文中，成功采用了多种技术以揭示阿米巴与隐球菌细胞相互作用时可能产生的结果。此外，我们还希望阐明3-羟基脂肪酸对相互作用结果的影响 隐球菌-阿米巴相互作用
首先采用的技术是共聚焦显微镜，该技术可获得静态图像。该方法在此处的主要缺点是仅能提供特定时间点的信息。基于实验结果所得出的任何结论均属于归纳推理，即根据一组观察结果得出结论32。然而，仅仅因为观察到多个存在某种模式的情况，并不意味着该模式在所有情况下都成立。因此，本研究展示了此类有限信息可能导致无根据结论的可能性，并对此提出了警示。具体而言，在缺乏矛盾性或支持性、互补性证据的情况下，可能会得出内化作用导致细胞吞噬作用发生的结论。
成像技术的快速发展为科学发现带来了新的机遇，呕吐胞吐作用（vomocytosis）的发现便是如此29,30。若不使用能够记录延时视频的显微镜，...

微生物在进化过程中逐渐适应并成功定殖于多种生态位，例如土壤和水体等开放的物理环境1。在这些生态位中，微生物通常会直接竞争有限的资源；尤为重要的是用于支持自身生长的营养物质，以及容纳不断扩张种群所需的空间2,3。在某些情况下，一些全动物型生物（如阿米巴原虫）甚至会以隐球菌细胞为食，通过消耗其生物量来获取营养4,5。这种捕食行为反过来使捕食者能够通过控制猎物种群数量来建立领地优势。由于这种捕食压力的存在，部分猎物微生物可能被选择性地进化出某些微生物因子（例如隐球菌荚膜6），以缓解捕食带来的不利影响。然而，作为这种压力的非预期后果，一些微生物获得了能够跨越物种屏障的能力，并进而寻找新的生态位进行定殖7，例如营养丰富且环境条件适宜的人体内部封闭空间。这一过程可能解释了像新生隐球菌（Cryptococcus (C.) neoformans）这样的陆生微生物如何演变为致病菌。
为此，研究隐球菌细胞与阿米巴原虫的初始接触及其如何选择性地使其成为致病菌至关重要。更具体地说，这可能为了解隐球菌细胞在感染过程中受到巨噬细胞作用时的行为提供线索。正是基于这一原因，本研究选择阿米巴原虫作为巨噬细胞的模型，因为其在实验室中培养成本相对较低且易于维持8。此外，还关注隐球菌次级代谢产物（即3-羟基脂肪酸9,10）如何影响阿米巴原虫与隐球菌细胞之间的相互作用。
通过肉眼观察变形虫与其猎物相互作用的一种简单方法是，在琼脂平板表面用猎物形成菌苔，然后接种变形虫。琼脂平板上出现的噬斑或透明区域可直观显示变形虫可能摄食猎物的区域。然而，在这种宏观水平下，仅能观察到该过程的最终结果，而无法观察吞噬作用的具体机制。因此，为了在单个细胞水平上深入理解这一过程，可采用多种显微镜技术11,12。例如，可使用配备培养室的倒置显微镜对吞噬细胞与其靶标之间的相互作用进行延时录像记录13。然而，由于具备延时成像功能的显微镜价格昂贵，实验室并不总能负担得起此类设备，尤其是在资源有限的环境中。
为克服上述局限性，本研究提出了一种顺序探索性设计，用于评估交互作用 C. neoformans 即 C. neoformans UOFS Y-1378 和 C. neoformans LMPE 046 与 Acanthamoeba castellani首先采用定性方法，随后进行定量方法。使用倒置荧光显微镜和透射电子显微镜拍摄阿米巴虫的静态图像以展示其形态。隐球菌 相互作用。随后使用酶标仪定量荧光，以评估阿米巴吞噬隐球菌细胞的效率。在数据分析阶段整合这些方法的结果时，所获得的信息可能与观察吞噬作用延时视频所获取的关键信息同样重要。

<table><tbody><tr><td>1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D27802</td><td>-</td></tr><tr><td>1.5 mL 塑料管&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69715</td><td>-</td></tr><tr><td>15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7252018</td><td>-</td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1132017</td><td>-</td></tr><tr><td>8孔培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1109650</td><td>-</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td>SAAR1022040LC</td><td>-</td></tr><tr><td>阿米巴原虫菌株</td><td>ATCC&lt;sup&gt;&amp;Ograve;&lt;/sup&gt;</td><td>30234&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>-</td></tr><tr><td>ATCC 培养基 712</td><td>ATCC&lt;sup&gt;&amp;Ograve;&lt;/sup&gt;</td><td>712&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>阿米巴培养基</td></tr><tr><td>黑色96孔微孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>152089</td><td>-</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hermle</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>-</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon TE 2000</td><td>-</td></tr><tr><td>环氧树脂：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] NSA</td><td>[1] ALS</td><td>[1] R1054</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] DER 736</td><td>[2] ALS</td><td>[2] R1073</td><td>-</td></tr><tr><td>[3] ERL Y221 树脂</td><td>[3] ALS</td><td>[3] R1047R</td><td>-</td></tr><tr><td>[4] S1（2-二甲氨基乙醇）</td><td>[4] ALS&amp;nbsp;</td><td>[4] R1067</td><td>-</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td>-</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>489441</td><td>-</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>374-91038C</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>-</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>ALS</td><td>R1009</td><td>-</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Boeco</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>ALS</td><td>R1209</td><td>-</td></tr><tr><td>液相色谱-质谱联用仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 34,860</td><td>-</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Lasec&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>ALS</td><td>R1015</td><td>-</td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan A BioParticles</td><td>Life Technologies</td><td>P35365</td><td>这是一种pH敏感性染料</td></tr><tr><td>生理缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>-</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Labcon</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] 二水合磷酸氢二钠&amp;nbsp;</td><td>[1] Merck</td><td>[1] 106580</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] 二水合磷酸二氢钠</td><td>[2] Merck&amp;nbsp;</td><td>[2] 106345</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Philips</td><td>Philips EM 100&amp;nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>-</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>-</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>ALS</td><td>R1260A</td><td>-</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Lasec&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>小瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29651-U</td><td>-</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Lasec&amp;nbsp;</td><td>239210</td><td>-</td></tr><tr><td>YPD 琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y-1500</td><td>-</td></tr></tbody></table>

显微技术与荧光读取在研究中的互补应用 隐球菌-阿米巴相互作用

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

为了模拟Cryptococcus感染，可以使用阿米巴原虫作为巨噬细胞的模型，因为阿米巴是环境中隐球菌细胞的天然捕食者。这种捕食性生物与巨噬细胞类似，通过吞噬作用来杀灭被内化的细胞。借助共聚焦激光扫描显微镜，可捕捉隐球菌细胞与阿米巴相互作用瞬间的图像。电子显微镜的高分辨率有助于揭示隐球菌细胞在被阿米巴食物泡捕获时的超微结构细节。由于吞噬作用是一个连续的过程，因此在分析中需整合定量数据，以解释图像拍摄时间点所发生的情况。具体而言，通过读取相对荧光单位，来量化阿米巴内化隐球菌细胞的效率。为此，隐球菌细胞会被染色，使其在进入酸性食物泡环境后产生荧光。综合使用这些技术所获得的信息，可为细胞被阿米巴内化后的行为与命运提供关键证据，并可能推断其在其他吞噬细胞中的类似行为。

微生物是肉眼无法观察到的微小生物体，但其影响可能导致临床上明显的疾病，例如皮肤感染。在研究微生物的某些特性时，包括其形态、代谢产物及相互作用，能够提供图像和视频证据至关重要。
我们首先试图观察隐球菌细胞与阿米巴之间的相互作用。为此，首先观察了共孵育2小时后的明场图像。其中一幅图像显示一个隐球菌细胞靠近阿米巴。一个阿米巴细胞伸出伪足，试图捕获一个隐球菌细胞（图1A）。接着，获取了相应的荧光图像以作对照（图1B）。染色细胞表面的绿色荧光有助于确认隐球菌细胞的存在。未染色的阿米巴也表现出自发荧光。此外，两种细胞在大小和形态上的明显差异，进一步帮助区分了这两类细胞。
自发荧光是一种常见的现...

本文详细介绍了一种制备隐球菌细胞与阿米巴原虫共培养体系的实验方案，该体系通过静态荧光图像和高分辨率透射电子显微镜图像进行研究。文中展示了定量数据如何补充此类定性信息。

为模拟隐球菌感染，可使用阿米巴作为模型，因为阿米巴是环境中隐球菌细胞的天然捕食者。

本实验的总体目的是利用显微镜技术作为研究工具，观察环境中的捕食性阿米巴吞噬病原性真菌新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的过程。本视频详细介绍了一种制备隐球菌细胞与阿米巴共培养体系的实验方案，我将采用共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜对其进行研究。通过这些技术所获得的信息，有助于揭示隐球菌细胞在感染过程中被内化后的生物学行为。将测试的真菌菌株划线接种于YPD琼脂平板上。在30摄氏度下培养48小时。从培养48小时的平板上刮取一环菌体，接种至含有100毫升添加4%葡萄糖的YNB液体培养基的250毫升锥形瓶中。将锥形瓶置于30摄氏度的摇床中孵育24小时。经过24小时的孵育后，使用血细胞计数板对真菌细胞进行计数，并用生理缓冲液将细胞浓度调整至每毫升一百万个细胞。在30摄氏度下，用蛋白胨酵母提取物葡萄糖培养基培养阿米巴细胞一周。使用血细胞计数板对阿米巴细胞进行计数，并用新鲜的无菌ATCC 712培养基将细胞浓度调整至每毫升1000万个细胞。随后使用台盼蓝染色进行细胞活力检测。建议使用细胞活力至少为80%的细胞进行后续操作。将200微升标准化的阿米巴细胞悬液加入贴壁载玻片的腔室中，在30摄氏度条件下孵育2小时，使细胞贴附于表面。在阿米巴细胞沉降期间，用异硫氰酸荧光素对标准化的隐球菌细胞进行染色。将真菌细胞在室温避光条件下轻轻振荡两小时。洗涤后，取200 µL染色的隐球菌悬液加入已含有阿米巴细胞的适当腔室中。将制备好的共培养物在30 °C下继续孵育两小时。共孵育结束后，用 PBS 洗涤小室两次，以去除所有未结合的阿米巴细胞，包括未被内化的隐球菌细胞。吸除用于固定细胞的戊二醛，并用 PBS 再洗涤小室两次。拆卸腔室载玻片。使用共聚焦激光扫描显微镜观察共培养的细胞。为补充上述实验，用pHrodo染料对隐球菌细胞进行染色，该染料可特异性地检测被吞噬于食物泡内的细胞。将染色后的细胞加入黑色黏附型微孔板的孔中，该微孔板中已接种阿米巴细胞。使用能够将对数信号转换为相对荧光单位的微孔板读板仪检测荧光。向已含有5 mL标准化阿米巴细胞的同一离心管中加入5 mL标准化的隐球菌细胞。将离心管在30°C条件下静置2小时。离心后吸去上清液。用pH 7的1摩尔磷酸钠缓冲液配制的3%戊二醛固定沉淀物，固定时间为3小时，该沉淀物代表共培养的细胞。用磷酸钠缓冲液将共培养的细胞洗涤一次。用同样缓冲的1%四氧化锇再次固定1.5小时，随后进行洗涤。将透射电镜样品（即共培养的细胞）置于梯度丙酮系列中脱水，依次为30%、50%、70%、95%和100%，每级15分钟。此处，最后的脱水步骤需更换两次丙酮重复进行。通过称取正常稠度的环氧树脂来制备环氧树脂。将样品材料包埋于环氧树脂中。在70摄氏度下聚合透射电镜样品材料8小时。使用安装在超薄切片机上的玻璃刀切割16纳米的切片。将切片在暗处用醋酸铀染色10分钟，随后再在暗处用柠檬酸铅染色10分钟。使用透射电子显微镜观察切片。为便于说明，视频中检测了两个分离株，其中一个产生3-羟基脂肪酸，另一个则不产生。3-羟基脂肪酸是次要代谢产物，不参与隐球菌细胞的生长。以下是隐球菌与阿米巴之间相互作用瞬间的图像截图。简而言之，可观察到隐球菌细胞在被内化前后的状态。在研究吞噬作用时，最好采用活体成像技术。然而，研究人员并不总能获得此类显微镜设备，以持续追踪吞噬过程。一种可能的解决方案是通过读取相对荧光单位的定量数据来弥补这一局限性。柱状图即为我用来补充图像数据的一个示例。重要的是，无论是以图像形式呈现的定性数据，还是定量数据，均可在不同时间点进行采集。通过整合所有信息，人们可以开始构建出吞噬作用过程中所发生事件的更完整图景。从定量数据可以明显看出，与不产生3-羟基脂肪酸的细胞相比，含有3-羟基脂肪酸的细胞对阿米巴作用的敏感性较低，因为被内化的细胞数量更少。透射电子显微镜（TEM）是一种特别强大的工具，因其具有高分辨率，能够对食物泡腔内提供鸟瞰式的观察视角，而这种细节在活体成像以及静态图像检查中常常被遗漏。在这张特定的透射电子显微镜照片中，可以清楚地观察到隐球菌细胞表面的突起结构。此前有理论认为，这些细胞表面结构是将3-羟基脂肪酸释放到周围环境中的通道。具体而言，这些通道可能有助于将3-羟基脂肪酸输送至阿米巴食物泡的腔内，从而改变其内部环境，进而促进细胞存活。pHrodo 或类似 FITC 的染料可能是更好的选择，因为它们仅在低 pH 条件下（如食物泡内）产生荧光。具体而言，pHrodo 仅能使研究者获取有关细胞内化情况的数据。为此，在染色前必须将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，并确保阿米巴培养基处于中性 pH。透射电子显微镜操作人员必须经过良好培训，以正确进行切片，因为这往往是结果容易因电子束轰击而导致扭曲和显微图像受损的关键环节。预计研究人员能够从本方案中获取足够信息，并在其自身研究中加以优化。此外，研究人员还可针对特定代谢物开发抗体，并将其应用于免疫荧光显微镜研究中，包括在透射电镜检查期间进行免疫金标记。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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显微技术与荧光读取在研究中的互补应用隐球菌-阿米巴相互作用

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