在研究隐球菌-阿米巴相互作用中,显微技术和荧光读数的补充应用

该程序的总体目的是利用显微镜作为工具，研究其环境捕食者阿米巴的致病真菌物种隐形球菌新形态的噬菌体。本视频详细介绍了制备隐球细胞和阿米巴联合培养的协议，我将使用共生激光扫描显微镜和传输电子显微镜来研究该协议。从使用这些技术获得的信息可以深入了解在感染期间内化时隐球细胞的行为。

在YPD芳球盘上划掉测试真菌菌株。在30摄氏度下孵育板48小时。从48小时厚的盘子里刮掉一个循环的细胞，并接种到含有100毫升YNB汤的250毫升圆锥形烧瓶中，并辅以4%的葡萄糖。

在30摄氏度的旋转摇床上孵育烧瓶24小时。经过24小时的孵育期，使用血细胞计计算真菌细胞，并使用生理缓冲液将细胞数调整为每毫升100万个细胞。培养peton酵母中的阿米巴细胞在30摄氏度下提取葡萄糖汤一周。

使用血细胞计计算阿米巴细胞，并使用新鲜无菌 ATCC 介质 712 将细胞数调整为每毫升 1000 万细胞。之后，使用锥蓝色污渍进行可行性测定。建议使用至少显示 80% 生存能力的细胞。

将标准化阿米巴细胞的 200 微升悬浮液分配到粘附幻灯片的腔室中。让细胞在 30 摄氏度下粘附在表面，需要两个小时。当阿米巴细胞沉淀下来时，用荧光素同位素染色的标准化隐球细胞染色。

在室温下和黑暗中轻轻搅动真菌细胞两小时。将染色的隐球细胞洗涤后，将200微升悬浮液分配到已经含有阿米巴细胞的适当腔室。在30摄氏度下培育准备好的共培养，再多培养两个小时。

在开投期结束时，用PBS清洗室两次，以去除任何未绑定的阿米巴细胞，包括非内化的隐球细胞。吸气用于修复细胞的谷胱甘肽，用PBS清洗室两次。拆卸腔室滑轨。

使用共合激光扫描显微镜查看共培养细胞。为了补充上述测定，用pHrodo染料对隐球细胞进行染色，选择性地允许读取被困在食物气穴内的细胞。将这些染色细胞放入已经含有种子阿米巴细胞的黑色粘附微刺激板的孔中。

测量微孔板读取器上的荧光，该显微板读取器可以将对数信号转换为相对荧光单元。将五毫升标准化的隐球细胞添加到已经包含五毫升标准化阿米巴细胞的离心管中。让管子在30摄氏度下站立两小时。

离心后吸上经。修复代表共培养细胞的颗粒，用磷酸钠一摩尔在pH 7缓冲3%谷胱甘肽3小时。用磷酸钠缓冲液清洗共培养细胞一次。

再次修复1个半小时，在类似的缓冲1%的三氧化硅，然后洗涤。在分级丙酮系列中，TEM材料也被称为共培养细胞，每个 30%50%95%和 100%的 15 分钟。在这里，在两个变化中重复最后的脱水步骤。

通过权衡正常稠度环氧树脂来准备环氧树脂。将材料嵌入环氧树脂中。在 70 摄氏度下聚合 TEM 材料 8 小时。

用安装在超原子上的玻璃刀切割 16 纳米部分。在黑暗中用醋酸烷染色10分钟，然后用铅柠檬酸盐染色10分钟，也在黑暗中。使用透射电子显微镜查看各部分。

为了说明目的，在视频中，检查了两种分离物，一种是产生3-羟基脂肪酸，另一种是不会产生的。 3-羟基脂肪酸是二次代谢物，在隐球细胞的生长中不能发挥作用。下面是显示隐球和阿米巴之间的互动时刻的快照。

到点，一个加密球菌细胞之前和之后内化可以观察到。在研究噬菌体时，利用活成像是理想的选择。然而，研究人员并不总是能够获得这种显微镜，以便持续跟踪噬菌体的过程。

补偿此限制的可能解决方案可能是通过读取相对荧光单位来补充图像的定量数据。条形图是用于补充图像的数据示例。重要的是，图像形式的定性数据和定量数据都可以在不同时间点拍摄。

通过拼凑所有信息，我们可以开始构建一个更大的图像，在吞噬过程中发生的事情。从定量数据中可以清楚地看出，与不产生3-羟基脂肪酸的细胞相比，含有3-羟基脂肪酸的细胞对阿米巴作用的影响较小，因为内化细胞较少。TEM 是一个特别强大的工具，因为它具有高分辨率，它可以让鸟瞰食物气液的流明，这是检查实时成像和静止图像时经常错过的细节。

在这个特定的TEM显微图中，可以清楚地看到隐球细胞表面的 protube。此前，理论认为这些细胞表面结构是3-羟基脂肪酸释放到周围环境的通道。到点，这些渠道可以帮助提供3-羟基脂肪酸到阿米巴的食物气液的流明，以改变内部条件，从而促进细胞生存。

pHrodo 或像 Fitc 可能是一个更好的污渍使用， 因为它只荧光在低 pH， 像在食物气管内。具体说来，pHrodo只允许研究人员获得有关内化细胞的数据。为此，重要的是细胞在染色前悬浮在磷酸盐缓冲液中，而阿米巴介质是中性pH值的。

传输电子显微镜操作员应经过良好的训练，以正确分段，因为这通常是结果可能失真和显微图被电子轰击损坏的点。据设想，研究人员将能够从提出的协议中获得足够的信息，并在他们自己的研究中对其进行优化。此外，研究人员还可以开发针对靶向代谢物的抗体，并在免疫荧光显微镜研究中应用这些抗体，包括在TEM检查期间使用免疫金标签。