小鼠表皮角质形成细胞的分离及其体外克隆培养

我们从成年小鼠中分离表皮细胞的方法适用于角质形成细胞干细胞等后续实验应用。该技术具有高度可重复性，可与小鼠体内实验相结合，适用于皮肤癌发生模型的研究。从安乐死后的成年小鼠获取背部皮肤样本后，使用经高压灭菌的镊子和手术刀，将每一片背部皮肤有毛面朝下置于一个薄的培养皿中，刮除皮下组织（包括脂肪），直至背侧皮肤组织变得半透明。

将刮取的皮肤置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至所有剩余皮肤处理完毕。然后使用解剖刀将皮肤样本切成 0.5 × 1 至 1.5 厘米的条状。将条状样本毛面朝上放置于无菌培养皿中，随后将其毛面朝上漂浮于塑料 100 × 20 毫米培养皿中 20 毫升 PBS 加 2× 庆大霉素并补充 0.25% 胰蛋白酶的溶液表面，在 32 °C 条件下孵育 2 小时。

孵育结束后，将一个含有15毫升收获培养基的无菌塑料方形培养皿倾斜30度放置，用弯头镊子小心地将漂浮的皮肤条转移至培养皿中。取一把新的刀片，使其与皮肤表面垂直，施加足够但不过量的力度，将表皮和毛发从样本上刮下并落入培养基中。当所有皮肤条均被刮过后，小心地将含有表皮细胞的上清液倾入一个无菌的60毫升广口瓶中，瓶内预先放入一根1.5英寸的磁力搅拌子，随后用额外的收获培养基冲洗培养皿，以收集残留的表皮细胞。

加入新鲜培养基至瓶中液体终体积为30毫升，在室温下以每分钟100转的速度搅拌表皮细胞悬液20分钟。在生物安全柜中完成搅拌孵育后，取出搅拌子，将细胞悬液通过70微米滤网过滤至50毫升锥形管中。使用镊子然后用移液器将毛发和角质层物质压过滤网，以充分处理组织并释放被困的毛囊细胞，再用额外5毫升收获培养基冲洗，将残留的被困毛囊细胞全部转移至管中。

必须操作表皮细胞和毛发，以使细胞从毛囊中释放出来。用新鲜培养基将管中的总体积补足至50毫升，通过离心收集细胞滤液。用5毫升移液器进行约20次吹打，将沉淀重悬于5毫升新鲜收获培养基中。

取0.5毫升1比20的稀释液，转移至一个2毫升的微量离心管中。轻轻混匀样品后，从微量离心管中取200微升，与等体积的0.4%台盼蓝溶液轻柔混匀。将此溶液轻柔混合三次，然后将细胞转移至血细胞计数板，用于计数有核角质形成细胞。

将所有深蓝色细胞记为非活细胞，将小型的金色和粉红色细胞记为活细胞。细胞活力平均约为80%，每只小鼠最终应获得约3000万个活角质形成细胞。计数后，通过再次离心收集细胞，进行大规模培养时，将每35毫米培养皿中2至4×10⁶个活角质形成细胞重悬于2毫升细胞培养基中。

进行克隆形成集落实验时，将细胞重悬于4毫升改良William's E培养基中，每毫升含1×10³个角质形成细胞，并加入补充剂和血清，接种于经X射线照射的Swiss小鼠3T3饲养层细胞上，培养皿为胶原包被的60毫米培养皿。进行大量培养时，将培养物置于5%二氧化碳环境中，32°C下培养适当时间。大量培养接种后24小时更换培养基，之后每周更换三次。

克隆培养结束后，吸去培养基，用10%缓冲福尔马林在室温下固定克隆集落过夜。次日早晨，用无菌水中含0.5%罗丹明B染色1小时，然后用冷的无菌水冲洗培养皿，直至冲洗液澄清。随后将培养皿倾斜置于皿盖上晾干，再进行克隆集落计数。

此处展示了经过不同局部处理后角质形成细胞克隆形成实验的典型结果。通过针对小鼠毛囊干细胞标志物的流式细胞术染色评估，毛囊干细胞通常约占从成年 C57BL/6 小鼠背部皮肤分离得到的细胞的 9%。在本图中，可观察到角质形成干细胞克隆在四种不同培养基条件下培养后的生长特性。

采用此方法后，细胞可用于流式细胞术、荧光激活细胞分选、细胞培养以及分子生物学分析。该技术使我们得以确定表皮干细胞的数量是一个数量性状和复杂性状，从而鉴定出一种新的干细胞调控基因。