小鼠表皮角质细胞的分离及其体外克隆培养物

我们收集成年小鼠表皮细胞的方法对于下游应用（如角蛋白细胞干细胞）非常有用。我们的技术是高度可重复的，可以在皮肤致癌模型的背景下与小鼠体内手术结合使用。从安乐死成年小鼠身上采集后，使用自 <3>化钳和手术刀将一个支护皮肤一次放入一个薄薄的培养皿中，然后从皮下组织（包括从腹皮组织中脱发脂肪）中脱掉，直到组织半透明。

将刮擦的皮肤放在 PBS 中，直到处理所有其他剩余皮肤。然后使用手术刀将皮肤样本切成 0.5 比 1.5 厘米的条状。将毛质的条状放在无菌培养皿中，然后将毛质的样品向上浮放在 20 毫升 PBS 和两个 x gentamicin 溶液的表面，在 32 摄氏度的高温下在塑料 100 x 20 毫米 Petri 盘中补充 0.25% 的三辛，两小时。

在孵化结束时，在30度倾斜处放置一个无菌的塑料方形培养皿，内含15毫升的收获介质，并使用弯曲的钳子小心地将漂浮的皮肤条转移到盘中。以与皮肤垂直角握住新的手术刀刀片，使用足够但非过度的力，将表皮和头发从样品中刮掉到介质中。当所有条带被刮擦后，小心地将含有上清液的表皮细胞放入一个无菌的60毫升罐中，里面装着一个1.5英寸的磁搅拌棒，并用额外的收获介质冲洗Petri盘，以收集任何剩余的表皮细胞。

用新鲜介质将罐中的最终体积调至30毫升，并在室温下以每分钟100次旋转搅拌表皮细胞溶液20分钟。在生物安全柜中的搅拌孵育结束时，拆下搅拌棒，并通过 70 微米滤架将细胞溶液过滤到 50 毫升锥形管中。使用钳子，然后用移液器通过过滤器按压头发和层角膜材料，以操纵组织释放被困的毛细胞，并使用额外的五毫升的收获介质将仍被捕获的毛细胞释放到管中。

表皮细胞和头发纵，以便从毛囊中释放细胞至关重要。用新鲜介质将管子中的总体积调至50毫升，通过离心收集细胞滤芯。将颗粒用 5 毫升新鲜收获介质中重新暂停，用 5 毫升移液器进行约 20 次三叶制。

采取0.5毫升的一到20稀释，并转移到2毫升微模糊管。仔细混合样品后，从微模糊管中拿出200微升，用0.4%的蓝色溶液轻轻混合。轻轻混合此溶液三次，将细胞转移到血细胞计中，用于计数核化角蛋白细胞。

将所有深蓝色细胞评分为不可行的细胞，将小金细胞和粉红色细胞评分为活细胞。生存能力平均约为80%，每只小鼠的最终角蛋白细胞产量应约为3000万个活细胞。计数后，收集细胞与另一个离心，并大规模培养重新暂停2至4倍10到第六可行的角蛋白细胞每35毫米培养皿在2毫升细胞培养培养。

对于克隆菌群形成测定，在X射线辐照瑞士小鼠3T3喂食层上，每四毫升修改Will william的E中培养物中，每4毫升的血清浓度补充，每胶原蛋白涂覆60毫米培养皿，再将细胞以1倍10至第三角细胞。对于大众培养，在适当的细胞培养期，在32摄氏度的二氧化碳中生长培养。在大规模文化的初始播种后24小时内改变介质，之后每周更换三次。

在克隆培养结束时，在室温下将培养基在10%缓冲的细胞中固定成型。第二天早上，在自洗水中用0.5%的罗丹B染色一小时，然后用冷的自动洗水冲洗盘子，直到水变清。然后倾斜的盘子在他们的盖子上干燥，然后计数殖民地。

在这里，角蛋白细胞群形成分析的典型结果后，各种局部治疗显示。毛囊干细胞通常占从成人C57BL/6小鼠头皮分离的细胞的大约9%，通过小鼠毛囊干细胞标记的流动细胞测量染色进行评估。在这个数字中，可以观察到在四种不同的媒介条件下培养后角蛋白细胞干细胞菌落的生长特征。

按照这个程序，这些细胞可用于流动细胞学、荧光激活细胞分选、细胞培养和分子生物学分析。这项技术使我们能够确定表皮干细胞的数量是一种定量和复杂的特征，导致新的干细胞调控基因的识别。