Name: 小鼠表皮角质细胞的分离及其体外克隆培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学习从成年小鼠背部皮肤分离表皮角质细胞的方法，用于分子生物学和干细胞研究。该技术可产生约三千万个活细胞，存活率达百分之八十，适用于皮肤癌发生模型和细胞生物学研究。

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作者无致谢。

所有脊椎动物使用方案均已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会的批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）和政府推荐的指南。
1. 饲养层的初始化与传代培养
<ol>
	<li>从液氮罐中取出一支冻存的瑞士小鼠3T3细胞冻存管，放入37 °C水浴中1–2分钟以解冻。每支冻存管中的细胞数量约为1 × 106.</li>
	<li>当冰块完全融化后，取出3T3细胞冻存管。用70%酒精棉片擦拭管壁，随后将冻存管转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将细胞缓慢转移至T-150培养瓶中，用1 mL CGM培养基冲洗3T3冻存管。向培养瓶中缓慢加入30 mL预热的3T3完全生长培养基（CGM）。轻轻摇动培养瓶，使3T3成纤维细胞均匀分布。在培养瓶上正确标记细胞系信息、日期和传代次数。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 和95%湿度。 
	注意： 根据美国模式培养物集存库（ATCC）的数据，瑞士小鼠3T3细胞的倍增时间为18小时；当细胞达到汇合状态（接触抑制）时，密度约为每平方厘米40,000个细胞2我们使用在初始化后第10至15代之间的特定3T3细胞系。当细胞代数较高时，可能出现生长速度加快或出现纺锤形细胞，这通常表明该3T3细胞作为成年小鼠角质形成细胞饲养层细胞的功能将下降。若出现快速生长现象，建议从较低代数的细胞重新建立新的细胞系。</li>
	<li>24小时后更换培养基，以去除死细胞和残留的DMSO（冷冻保存剂），之后每周更换两次。让细胞增殖至约80%汇合度，使用T-150培养瓶进行初始培养，初始化后使用T-225培养瓶进行传代培养。</li>
	<li>传代培养3T3成纤维细胞时，将培养瓶从细胞培养箱中取出，用预冷的含庆大霉素的无菌PBS（1×）洗涤两次。向每个T-225培养瓶中加入10 mL预热（37 °C水浴）的0.25%胰蛋白酶溶液。
	<ol>
		<li>将烧瓶置于加热板上 3-8 分钟。取下烧瓶，用手掌轻轻拍打瓶壁以使细胞脱落，并在倒置显微镜下确认细胞脱落情况。含有脱落 3T3 细胞的胰蛋白酶溶液可能呈现浑浊状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器吸取胰蛋白酶溶液，冲洗培养瓶的细胞生长表面3–4次，并将消化后的细胞转移至50 mL锥形管中，与30 mL CGM混合。再用50 mL锥形管中的CGM-胰蛋白酶-细胞混合液，冲洗培养瓶3–5次，每次10 mL。 
	注意： 两个烧瓶的内容物可加入一个50 mL离心管中；若仅使用一个烧瓶，则将10 mL胰蛋白酶/细胞悬液加入含有20 mL CGM的50 mL离心管中。</li>
	<li>将50 mL离心管在160 x g 4 °C下离心7分钟。</li>
	<li>现在吸除上清液，并用5 mL CGM重悬细胞沉淀，轻轻吹打约10次，以完全分散细胞团块。再加入10 mL CGM，使50 mL离心管中的总体积达到15 mL。
	<ol>
		<li>再次混匀约10次，将5 mL细胞悬液分别加入3个独立的T-150培养瓶中。传代比例为T-225培养瓶1:3，或T-150培养瓶1:4。向每个培养瓶中加入30 mL预热的3T3 CGM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用细胞系名称、细胞接种日期和传代次数标记培养瓶。</li>
	<li>在传代步骤离心后，为冻存3T3细胞，从离心机中取出50 mL离心管并置于冰桶中。吸除上清液，用1 mL 5% DMSO-DMEM混合液重悬细胞沉淀（参见 表1每个收获的烧瓶。</li>
	<li>将1 mL DMSO-DMEM混合液与细胞悬液加入每个冻存管中（每收获一管3T3培养瓶使用一个冻存管）。在冻存管上标记传代次数、细胞系名称（3T3）以及细胞冻存日期。</li>
	<li>将这些3T3细胞小管放入细胞冻存罐中（参见 材料表）并转移至 -70 °C 冰箱保存 &#62;5 小时。小心地从细胞冻存罐中取出冻存管，转移至液氮储存罐中，用于长期保存，直至下次使用。将细胞系名称、储存位置及日期等信息登记到实验室液氮库存记录表中。</li>
</ol>
2. X射线照射和接种用3T3饲养层的制备
<ol>
	<li>在照射前一周准备3T3细胞，并使其生长至约100%汇合度。3T3细胞通常处于120至130代之间。</li>
	<li>为了成功进行原代角质形成细胞的克隆形成实验，在接种3T3细胞之前，需用胶原蛋白对60 mm培养皿表面进行包被。
	<ol>
		<li>将约2–3 mL胶原包被液加入60 mm培养皿中，使其覆盖底部表面，然后去除多余的包被液（见表1）。将培养皿转移至37 °C、含5% CO2的培养箱中，孵育至少1小时。注意培养皿在孵育过程中不可干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>X射线照射步骤：按照步骤1.4–1.6操作。使用50 mL新鲜CGM重悬细胞沉淀，盖紧锥形管并用石蜡密封膜封口。为避免污染，将石蜡密封的含细胞管放入塑料袋中双层封装，并置于冰上。角质形成细胞培养中可使用基于丝裂霉素的替代饲养层7。</li>
	<li>使用生物X射线仪，以5,000 rads（50 Gy）剂量对50 mL锥形管中的成纤维细胞3T3进行照射。照射时细胞应与CGM培养基一同处理。
	<ol>
		<li>X射线照射后，在4 °C条件下以160 × g离心7分钟。吸除上清培养基，用5 mL CGM轻柔重悬细胞沉淀，轻轻吹打约10次。随后加入25 mL培养基使终体积达到30 mL，并再次吹打10次。这些吹打步骤对于克隆形成实验中获得均匀的3T3成纤维细胞层至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞计数：使用标准玻璃血细胞计数板对角质形成细胞进行计数。取约0.5 mL细胞悬液，转移至1.5 mL离心管中。取出200 µL细胞混合液，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀3–4次。将细胞悬液加入血细胞计数板，计数所有有核细胞（小的金色和粉红色细胞）作为活细胞。计算活体金色细胞的最终浓度。</li>
	<li>将1 × 106个3T3细胞（最低可使用7 × 105个）接种至60 mm胶原包被的培养皿中（步骤2.2），并轻柔加入4 mL改良高钙Williams E培养基（见表1）。让新接种的3T3细胞贴壁24小时。次日，收获新鲜的原代角质形成细胞，并将其接种于已贴壁的3T3成纤维细胞层上，进行克隆形成实验，具体操作如下所示。</li>
</ol>
3. 原代角质形成细胞的分离与接种
<ol>
	<li>根据批准的动物设施/IACUC标准，通过吸入CO2处死四至五只成年雌性小鼠。然而，本方案也可用于单只雌性或雄性小鼠。
	<ol>
		<li>使用电动动物剪毛器剪除约9 cm2背部毛发，并将所有剪毛后的小鼠放入一个500 mL的广口瓶中，加入足量聚维酮碘消毒液（非擦拭用），使其完全浸没小鼠，持续1–2分钟。充分摇晃广口瓶，使消毒液均匀覆盖小鼠体表。</li>
		<li>倒出消毒液，用清水冲洗至液体澄清。重复一次相同的消毒液清洗，随后再用清水冲洗。碘溶液消毒后，将所有小鼠浸泡于70%乙醇中5–10分钟。 
		注意：毛色较浅的小鼠（如BALB/c）经碘消毒液处理后会残留轻微黄色，而毛色较深的小鼠（如C57BL/6）则不会。值得注意的是，细胞活力或培养生长不受此黄色残留影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中使用镊子和剪刀小心剥离剪毛后的背部皮肤。将切除的背部皮肤置于装有PBS/2倍庆大霉素的锥形管中。避免使用腹部皮肤，以防乳腺细胞污染培养物。</li>
	<li>使用已灭菌的镊子和手术刀，逐个将背部皮肤有毛面朝下放置于薄型培养皿上。从皮肤组织腹侧开始刮除所有皮下组织（包括脂肪），直至皮肤呈半透明状。尽可能彻底清除皮下组织，但避免撕裂皮肤（尤其是毛囊部分）。同时，避免长时间刮擦并防止皮肤干燥。
	<ol>
		<li>将刮除后的皮肤暂时保存于PBS溶液中，待其余皮肤处理完毕。使用手术刀将皮肤切成0.5 cm × 1–1.5 cm的条状，并将有毛面朝上放置于无菌培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将20 mL PBS/2倍庆大霉素溶液与胰蛋白酶（0.25%）混合后，用移液器加入100 mm × 20 mm塑料培养皿中。使用无菌镊子将皮肤条转移至胰蛋白酶溶液表面，有毛面朝上，于32 °C培养箱中孵育2小时。 
	注意：胰蛋白酶消化的时间和温度对获得高可培养性的原代角质形成细胞至关重要。尽管其他方法可能获得较高数量的活细胞，但角质形成细胞的可培养性往往较差。
	<ol>
		<li>在2小时孵育期间，对培养皿进行胶原包被处理，并置于37 °C孵育1小时（见步骤3.1.2）。对于克隆形成实验，60 mm培养皿需在角质形成细胞收获前24小时完成包被，以便经X射线照射的3T3饲养层细胞充分贴壁并均匀铺展。 
		注意：克隆培养中培养皿的包被对于小鼠表皮角质形成细胞的正常贴附、克隆形成及最终的生长增殖至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表皮刮取步骤：准备一个无菌塑料方形培养皿，倾斜30°角，以便使用15 mL收获液（见表1）进行有效的表皮刮取。用弯头镊子小心从胰蛋白酶溶液中取出漂浮的皮肤条。使用新的手术刀片，将表皮和毛发刮入收获液中。
	<ol>
		<li>刮取时不要施加过大力量，但需施加足够力度以确保表皮被完全刮下，否则会影响细胞活力。</li>
		<li>刮取表皮时，保持刀片与皮肤片垂直。若刀片倾斜方向与移动方向一致，则更容易撕裂皮肤；若刀片倾斜方向背离移动方向，则可能导致表皮去除不充分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心将含有刮取表皮细胞的收获液倒入一个无菌60 mL广口瓶（可高压灭菌且可重复使用）中，瓶内预先放入一根1.5英寸磁力搅拌子。用额外收获液冲洗培养皿，以收集残留的表皮细胞，并将最终体积调整至30 mL。使用磁力搅拌器在室温下以100 rpm搅拌20分钟。此过程有助于将被困在毛发中的表皮细胞释放出来。</li>
	<li>将无菌70 µm细胞筛置于50 mL锥形管顶部。该细胞筛可稳固地放置在50 mL锥形管上。
	<ol>
		<li>将广口瓶移入生物安全柜中。取出搅拌子，将内容物倒入连接于50 mL锥形管的筛网上，滤除不需要的毛发和角质层碎片。</li>
		<li>按压筛网内的毛发及角质层物质，促使其释放被困的细胞。使用5 mL收获液冲洗，使残留细胞释放并流入管中。最终将锥形管内总体积补至50 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖紧装有细胞滤液的50 mL锥形管，于4 °C以160 × g离心7分钟。随后吸除上清液，加入5 mL收获液。用5 mL移液器轻柔吹打约20次，重悬细胞沉淀。
	<ol>
		<li>此步骤中应将细胞置于冰盒中，以防细胞聚集。加入25 mL收获液后再次吹打（20–25次）。</li>
		<li>为准确计数角质形成细胞，取1 mL细胞悬液加入19 mL收获液。此时细胞稀释比例为1:20，总体积为50 mL锥形管。若角质形成细胞来源于单只小鼠，则应调整细胞悬液体积：使用15 mL而非30 mL，并进行1:10稀释以进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从50 mL锥形管（1:20稀释）中吸取0.5 mL稀释后的细胞，转移至1.5 mL已灭菌的微量离心管中。取0.2 mL（200 µL）细胞混合液至另一1.5 mL微量离心管中，加入等体积（200 µL）的0.4%台盼蓝溶液。轻轻混合3次后，将细胞转移至血细胞计数板，计数有核角质形成细胞。
	<ol>
		<li>所有呈深蓝色的台盼蓝阳性细胞记为非活细胞（死亡细胞），而较小的金黄色或粉红色细胞记为活细胞。每只小鼠最终获得的活角质形成细胞数量应约为3000万个。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将原始50 mL锥形管（来自步骤3.8）在4 °C以160 × g离心7分钟。此步骤中，将细胞重悬于所需培养基中，并根据接种需求进行相应稀释。
	<ol>
		<li>进行大量培养时，每35 mm培养皿接种200万至400万个活金黄色细胞，培养基为细胞培养基（KGM型培养基+添加剂，用于单层培养）（见表1）。进行克隆形成（克隆）实验时，每60 mm培养皿接种1000个细胞，接种于经X射线照射的瑞士小鼠3T3饲养层上，培养基于胶原包被的培养皿中，使用含添加剂和血清的改良William’s E培养基。</li>
		<li>35 mm和60 mm培养皿分别使用总共2至4 mL培养基。此外，从ATCC购得的DMEM和William’s E培养基应配制为低碳酸氢钠浓度，以适用于5% CO2环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养细胞（大量培养或克隆培养）置于32 °C、95%湿度、5% CO2条件下培养。大量培养在初次接种后一天更换培养基，之后每周换液三次。克隆实验则在细胞接种后两天进行首次换液，之后每周换液三次。</li>
	<li>对于克隆培养，分别在两周和四周时间点进行培养观察。克隆培养结束后（2周或4周），吸除培养基。在室温下用10%缓冲福尔马林固定克隆过夜，随后用0.5%罗丹明B水溶液（灭菌水配制）染色1小时。然后从培养皿边缘用移液器吸除罗丹明B染液。
	<ol>
		<li>用冷灭菌水冲洗培养皿至水流澄清。将培养皿倾斜放置于皿盖上，使其自然干燥，以便最终进行克隆计数。值得注意的是，在进行克隆形成实验时，切勿接种&#60;1 mL的细胞悬液。若细胞浓度过高，应进行系列稀释。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis%2C+following+initiation%2C+and+during+promotion+of+epidermal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的角质形成细胞分离方法旨在从成年雌性小鼠背部获得高产量且具有高度可培养性的原代表皮角质形成细胞。这些角质形成细胞适用于流式细胞术、分子生物学应用以及原代细胞培养，包括本文报道的克隆形成实验。该角质形成细胞分离方法也已成功应用于皮肤化学致癌及肿瘤促进作用中其他下游环节的研究1,13。
该方案中有几个关键步骤。首先，为了确保实验的严谨性和可重复性，采用了年龄为54 ± 2天的雌性小鼠。这使我们能够从多种小鼠品系中进行灵敏且定量的克隆形成实验，并将其作为表型用于连锁分析，从而鉴定出至少一个全新的干细胞调控基因。10,11其次，将皮肤切成较小的碎片有助于提高胰蛋白酶消化的效果，比保持皮肤完整更有效。第三，胰蛋白酶漂浮处理的时间和温度对后续的细胞培养能力至关重要。此外，操作者需要 &#34;明显刺入&#34; 利用滤膜上残留的毛发来松动附着的细胞。此步骤对于获得较高产量的细胞至关重要。此外，32 °C的培养箱温度对于成年小鼠角质形成细胞的长期培养具有重要意义。最后，在本方案中，体外与体内实验可并行进行检测。1 基于原代培养而非传代培养或细胞系。值得注意的是，若首次采用本方案收获原代角质形成细胞，建议在刮取后保留剩余的真皮组织，以便通过组织病理学观察确认毛囊随表皮组织被完全去除。
本方案在分离成年小鼠角质形成细胞方面的主要优势在于，能够获得高产量且可培养的细胞，适用于多种下游应用。其主要局限性在于，某些细胞表面表位可能对胰蛋白酶消化敏感，从而影响免疫染色效果。因此，在测试新的细胞表面抗体时，建议采用基于分散酶6或热蛋白酶5的方法进行细胞收获，并与本方案进行比较。本方案的意义在于，其已得到严格验证、定量评估，并成功应用于多种不同研究场景，包括克隆性干细胞检测1,9,10,11、生物化学中的大规模培养8、干细胞分析中的FACS分选3,4、分子生物学实验3,12，以及正在进行的RNA和DNA测序研究。

哺乳动物的皮肤覆盖整个身体，具有多种功能（例如，作为主要的物理屏障、调节体温以及保持水分）。在过去五十年中，对小鼠皮肤的基础研究揭示了皮肤结构与功能的新信息。小鼠皮肤模型极大地促进了人们对化学物质或紫外线辐射诱导癌变背后复杂分子机制基本生物学的理解。这些小鼠皮肤模型为理解人类皮肤疾病及其防治作出了重要贡献。为了进一步在毛囊发育生物学、干细胞研究、癌变过程以及表皮遗传学探索中进行分子层面的深入分析，通常需要从小鼠皮肤中分离并培养原代上皮角质形成细胞，以便与体内实验平行使用。开发该方法的主要动因是需要一种用于克隆形成性表皮及毛囊干细胞的体外检测手段1,2。此外，还迫切需要获得适用于克隆形成分析3、荧光激活细胞分选以及流式细胞术3,4的表皮细胞单细胞悬液。该方法的优势在于收获细胞数量比其他方法提高一个数量级5,6，能够包含毛囊的上皮部分，并且所收获细胞具有很高的可培养性。在20世纪80年代，尚无已知方法能满足这些要求。在随后的年份中，该方法经过优化以进一步提高细胞产量。该方法的主要局限性在于可能会遮蔽某些对胰蛋白酶敏感的抗体，从而影响免疫反应活性6。
小鼠的饲养管理遵循特定病原体阴性（Specific Pathogen Free）指南。取1至5只雌性小鼠，年龄为54 ± 2天。在年龄较大的小鼠中，由于毛发周期的生长期（anagen phase），角质形成细胞的活力会降低。此外，与年轻小鼠相比，胰蛋白酶消化过程也更为困难。该组织收获方案已针对雌性小鼠较薄的皮肤进行了成功优化。通常不使用雄性小鼠进行角质形成细胞的分离，因为在饲养过程中雄性小鼠容易相互争斗，从而可能在皮肤上留下抓痕或伤口。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝 1× 溶液（溶于 0.9% 生理盐水）</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td>无菌</td></tr><tr><td>1.5 英寸带枢轴环磁力搅拌子</td><td>Bel-Art, Wayne</td><td>371101128</td><td>置于 2 oz Nalgene 广口瓶中</td></tr><tr><td>10 mL 一次性移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 无菌锥形离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (T-150) 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430825</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 螺口离心管（锥形）</td><td>Sarstedt</td><td>72.608</td><td></td></tr><tr><td>2 oz Nalgene 广口瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2118-0002</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶溶液 10×</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; (T-225) 培养瓶</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>32 oz Nalgene 方形储存瓶：PETG 材质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>35 mm 无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 一次性移液管</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌锥形离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm 直径 Spectra Mesh 滤膜，孔径 74 &amp;micro;m</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>145956</td><td></td></tr><tr><td>抗生素（青霉素-链霉素）</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清 (BCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354331</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Ram34 FITC 标记抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553733</td><td></td></tr><tr><td>CD49f (alpha6-整合素, GOH3) PE 标记抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>555736</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，70 &amp;micro;m，无菌</td><td>BD Discovery Labware</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>牛胶原蛋白 I 型，30 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 经济型细胞冻存盒，适用于 1 或 2 mL 冻存管</td><td>Biocison</td><td>BCS-136PK</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL 聚丙烯冻存管，自立式圆底</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>新鲜制备的去离子水（Milli-Q 水）</td><td></td><td></td><td>现配；经两次蒸馏的反渗透水</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液 1×，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>14190-144</td><td>无菌</td></tr><tr><td>DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH 300070.03</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4 oz 无菌样本容器</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 50 mg/mL 10×</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>KGM 培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3103</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene &amp;ldquo;Mr. Frosty&quot; 细胞冻存盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene PC 直壁广口瓶，16 oz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2116-0500</td><td></td></tr><tr><td>22 号无菌不锈钢刀片</td><td>BD Bard-Parker</td><td>371222</td><td></td></tr><tr><td>4 号手术刀柄</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>26-1200</td><td>置于盛有 70% 乙醇的容器中</td></tr><tr><td>一对全弯眼科镊</td><td>Militex</td><td>18-784</td><td>置于盛有 70% 乙醇的容器中</td></tr><tr><td>一把剪刀</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>25-1050</td><td>置于盛有 70% 乙醇的容器中</td></tr><tr><td>一对拇指镊</td><td>Militex</td><td>6-4</td><td>置于盛有 70% 乙醇的容器中</td></tr><tr><td>Oster Pro-Cord/无线修剪器，40 号刀头</td><td>Jarden Consumer Solutions/Oster</td><td>78997-010</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿，100 mm × 20 mm，无菌</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 品牌无茎玻璃漏斗</td><td>Corning</td><td>6240-75</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2aκ FITC 同型对照抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2aκ PE 同型对照抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>555844</td><td></td></tr><tr><td>SFM 培养基</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>10725-018</td><td></td></tr><tr><td>SMEM 培养基</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>SMEM：不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的最低必需培养基，用于悬浮培养</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>无菌方形塑料培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>351112</td><td></td></tr><tr><td>Swiss 小鼠 3T3 成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-92</td><td>传代次数不超过 10 代</td></tr><tr><td>Triadine；10% 聚维酮碘皮肤消毒液，16 oz</td><td>Triad Group</td><td>10-8216</td><td></td></tr><tr><td>VWR 塑料培养皿，无菌，节省空间型 100 × 10</td><td>VWR</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>Williams E 培养基</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Ziploc 密封袋</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠表皮角质形成细胞的分离及其体外克隆培养

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

本文所述方案是一种从成年雌性小鼠（54 ± 2 日龄）中可靠分离原代角质形成细胞的方法，每只小鼠可获得约 30 × 106 个活细胞。原代成年小鼠角质形成细胞取自雌性小鼠的背部皮肤。根据实验需求，也可使用雄性小鼠（约 6 周龄）进行角质形成细胞的分离。处死小鼠后，将其剃毛，并依次用聚维酮碘和乙醇溶液（70% 酒精）进行多次清洗消毒。消毒后，剥离小鼠背部皮肤，并用手术刀去除皮下脂肪和肌肉组织，弃去。将皮肤切成小片，采用温和的低温胰蛋白酶消化处理，使真皮下层与表皮分离。刮取的表皮组织在低速搅拌下悬浮，过滤去除毛发，计数后重新悬浮于培养基中。该方法可获得高质量的单细胞悬液，细胞培养活性高，适用于多种后续实验应用。

通常，每只小鼠可获得的表皮角质形成细胞产量约为 20 × 106 至 30 × 106 个拒染台盼蓝的细胞8,9。细胞活力范围为 80%–90%。典型的接种效率约为接种后 24 小时时有 30% 的细胞贴壁。在经照射的 3T3 饲养层上，C57BL/6 小鼠每 1,000 个有活力细胞可形成约 60 个克隆，而 Swiss 型小鼠每 1,000 个细胞可形成约 30 个克隆10,11。克隆形成实验的典型结果如图 1所示。C57BL/6 小鼠毛囊干细胞中 CD34+/CD49f+ 干细胞的比例约为 9%12。流式细胞术的典型结果见图 2。
四种不同培养基的生长特性如图3所示。测试的培养基包括KGM-gold、SFM、William's E培养基和Morris-2（一种由Morris实验室基于William's E改良的低钙培养基）。
<img alt="比较不同处理的细胞培养实验：Nor、Ace、DMBA、TPA。集落形成模式分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：成年小鼠角质形成细胞克隆形成实验的代表性结果。 本照片展示了来自54日龄CD-1雌性小鼠的角质形成细胞在局部施用以下处理后的集落形成情况：1）无处理；2）丙酮处理，一周后每周两次丙酮处理，持续两周；3）DMBA处理，一周后每周两次丙酮处理，持续两周；4）丙酮处理，一周后每周两次TPA处理，持续两周；5）DMBA处理，一周后每周两次TPA处理，持续两周。体内处理后，收集角质形成细胞并以每皿1,000个细胞接种于经辐照的3T3饲养层上，培养两周。随后用缓冲福尔马林固定培养皿，并用罗丹明B染色。每列中的培养皿为各小鼠处理组的重复样本。请注意，经DMBA处理后较大集落的数量增加；而在收获角质形成细胞前经TPA处理的小鼠中，总集落数量增加。缩写：DMBA：7,12-二甲基苯并[a]蒽；TPA：12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="分析成年小鼠毛囊干细胞的流式细胞术图谱；CD34-FITC、a6-PE标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：成年小鼠毛囊干细胞流式细胞术的代表性示例。 简言之，从成年小鼠背部皮肤分离原代角质形成细胞，并使用细胞滤器去除细胞碎片。将分离得到的角质形成细胞悬液用CD49f或α6-整合素（PE标记）、CD34（FITC标记）抗体以及活死细胞染料和其他对照进行标记。补偿实验使用FITC和PE同型对照抗体（大鼠IgG2akappa）（见材料表）。干细胞通过CD49f（PE通道）和CD34（FITC通道）进行鉴定：CD49f识别位于表皮基底层细胞和毛囊细胞上的半桥粒外部组分，CD34则识别毛囊干细胞（即CD34-FITC+ 和 a6-PE+ 细胞，位于右上象限，共占5%）。右侧图示展示了不同角质形成细胞亚群，包括仅CD34-FITC阳性、CD34-FITC与a6-PE双阳性（干细胞群体）、仅a6-PE阳性以及未染色细胞。请注意，如先前报道6,14，存在两个CD34+ 干细胞亚群。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="14天内细胞培养生长比较；显微镜图像；培养基类型：KGM、Morris II、William's E、SFM。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：四种不同培养基对成年雌性小鼠表皮细胞原代培养的影响比较。 从成年雌性小鼠背部皮肤分离得到的原代角质形成细胞，使用四种不同培养基（KGM、SFM、William's-E 和 Morris-2）进行接种计数。将等量的角质形成细胞接种后，观察其总体形态和生长模式。需注意，增殖中的角质形成细胞具有略微不同的形态。KGM、SFM 和 Morris-2 均为低钙培养基，在培养14天后表现出最显著的生长活性。相比之下，在含有1.4 mM钙离子及高钾钠比的William's E培养基中，细胞无法长期存活。令人意外的是，添加补充物及20%胎牛血清的William's E培养基在支持角质形成细胞克隆培养方面显著优于其他测试培养基，这可能是因为营养强化的William's E培养基更有利于3T3饲养层细胞发挥“喂养”作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液与培养基</td>
			<td>评论</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收获溶液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% 胰蛋白酶（5 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's PBS（500 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素（2 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含2倍浓度庆大霉素的PBS（45 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含2倍浓度庆大霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶溶液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞培养溶液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purecol-纤维连接蛋白包被溶液：</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES（1 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>116 mM CaCl2（1 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛血清白蛋白 1.0 mg/mL (10 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞培养基（100 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纤维连接蛋白（1 mg）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purecol 胶原蛋白（1 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞冻存液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO（2 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含10% BCS和青霉素-链霉素的DMEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收获培养基</td>
			<td>需不含钙</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 庆大霉素（1 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS（50 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMEM（500 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高钙Williams' E培养基，含：</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF（5 µg/mL) 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>谷氨酰胺 14.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氢化可的松（1 mg/mL）0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰岛素 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LinoAcid-BSA（0.1 mg/mL）0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM必需氨基酸 4 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM维生素 5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转铁蛋白（5 mg/mL）1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素A（1 mg/1,000 µL) 57.5 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素E 1 mg/mL (4°C)  3.5 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素 D2（10 mg/mL） 50 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3成纤维细胞完全生长培养基（CGM）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCS（100 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM（900 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素溶液（10 mL）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM</td>
			<td>用于大规模培养的培养基是一种钙含量降低的培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 Williams' E 相同补充剂的 Morris 2 培养基</td>
			<td>一种含补充剂的威廉姆斯E培养基低钙变体</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶液与培养基配方。

本实验方案的目的是从成年小鼠背部皮肤中分离表皮角质形成细胞，用于多种后续应用，如分子生物学、生物化学、荧光激活细胞分选以及原代体外培养（例如，克隆形成性角质形成细胞）。

此处所述方案是一种可靠的方法，用于从成年雌性小鼠（54 ± 2 日龄）中分离原代角质形成细胞，可获得约……

我们从成年小鼠中分离表皮细胞的方法适用于角质形成细胞干细胞等后续实验应用。该技术具有高度可重复性，可与小鼠体内实验相结合，适用于皮肤癌发生模型的研究。从安乐死后的成年小鼠获取背部皮肤样本后，使用经高压灭菌的镊子和手术刀，将每一片背部皮肤有毛面朝下置于一个薄的培养皿中，刮除皮下组织（包括脂肪），直至背侧皮肤组织变得半透明。将刮取的皮肤置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至所有剩余皮肤处理完毕。然后使用解剖刀将皮肤样本切成 0.5 × 1 至 1.5 厘米的条状。将条状样本毛面朝上放置于无菌培养皿中，随后将其毛面朝上漂浮于塑料 100 × 20 毫米培养皿中 20 毫升 PBS 加 2× 庆大霉素并补充 0.25% 胰蛋白酶的溶液表面，在 32 °C 条件下孵育 2 小时。孵育结束后，将一个含有15毫升收获培养基的无菌塑料方形培养皿倾斜30度放置，用弯头镊子小心地将漂浮的皮肤条转移至培养皿中。取一把新的刀片，使其与皮肤表面垂直，施加足够但不过量的力度，将表皮和毛发从样本上刮下并落入培养基中。当所有皮肤条均被刮过后，小心地将含有表皮细胞的上清液倾入一个无菌的60毫升广口瓶中，瓶内预先放入一根1.5英寸的磁力搅拌子，随后用额外的收获培养基冲洗培养皿，以收集残留的表皮细胞。加入新鲜培养基至瓶中液体终体积为30毫升，在室温下以每分钟100转的速度搅拌表皮细胞悬液20分钟。在生物安全柜中完成搅拌孵育后，取出搅拌子，将细胞悬液通过70微米滤网过滤至50毫升锥形管中。使用镊子然后用移液器将毛发和角质层物质压过滤网，以充分处理组织并释放被困的毛囊细胞，再用额外5毫升收获培养基冲洗，将残留的被困毛囊细胞全部转移至管中。必须操作表皮细胞和毛发，以使细胞从毛囊中释放出来。用新鲜培养基将管中的总体积补足至50毫升，通过离心收集细胞滤液。用5毫升移液器进行约20次吹打，将沉淀重悬于5毫升新鲜收获培养基中。取0.5毫升1比20的稀释液，转移至一个2毫升的微量离心管中。轻轻混匀样品后，从微量离心管中取200微升，与等体积的0.4%台盼蓝溶液轻柔混匀。将此溶液轻柔混合三次，然后将细胞转移至血细胞计数板，用于计数有核角质形成细胞。将所有深蓝色细胞记为非活细胞，将小型的金色和粉红色细胞记为活细胞。细胞活力平均约为80%，每只小鼠最终应获得约3000万个活角质形成细胞。计数后，通过再次离心收集细胞，进行大规模培养时，将每35毫米培养皿中2至4×10⁶个活角质形成细胞重悬于2毫升细胞培养基中。进行克隆形成集落实验时，将细胞重悬于4毫升改良William's E培养基中，每毫升含1×10³个角质形成细胞，并加入补充剂和血清，接种于经X射线照射的Swiss小鼠3T3饲养层细胞上，培养皿为胶原包被的60毫米培养皿。进行大量培养时，将培养物置于5%二氧化碳环境中，32°C下培养适当时间。大量培养接种后24小时更换培养基，之后每周更换三次。克隆培养结束后，吸去培养基，用10%缓冲福尔马林在室温下固定克隆集落过夜。次日早晨，用无菌水中含0.5%罗丹明B染色1小时，然后用冷的无菌水冲洗培养皿，直至冲洗液澄清。随后将培养皿倾斜置于皿盖上晾干，再进行克隆集落计数。此处展示了经过不同局部处理后角质形成细胞克隆形成实验的典型结果。通过针对小鼠毛囊干细胞标志物的流式细胞术染色评估，毛囊干细胞通常约占从成年 C57BL/6 小鼠背部皮肤分离得到的细胞的 9%。在本图中，可观察到角质形成干细胞克隆在四种不同培养基条件下培养后的生长特性。采用此方法后，细胞可用于流式细胞术、荧光激活细胞分选、细胞培养以及分子生物学分析。该技术使我们得以确定表皮干细胞的数量是一个数量性状和复杂性状，从而鉴定出一种新的干细胞调控基因。

isolation-mouse-epidermal-keratinocytes-their-vitro-clonogenic

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠表皮角质细胞的分离及其体外克隆培养物

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从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

利用慢病毒介导功能获得或功能缺失，对毛囊再生模型进行组织特异性分析。...

毛发再生过程中上皮-间质信号传导的快速遗传学分析

本视频介绍了通过酶消化与机械破碎相结合的方法，分离人类皮肤表皮层中最主要的细胞——角质形成细胞。该方法利用选择性培养基，促进角质形成细胞相对于其他皮肤细胞类型的优先生长。...

人皮肤角质形成细胞的分离：一种从皮肤样本中培养原代角质形成细胞的方法

在本视频中，我们对从成年小鼠分离的角质形成细胞进行克隆形成实验，以评估单个细胞增殖并形成克隆的能力。该角质形成细胞分离技术可用于研究皮肤化学致癌及肿瘤促进作用的其他下游环节。...

角质形成细胞克隆形成实验：一种评估角质形成细胞体外克隆生长能力的实验方法

研究成体干细胞生物学的理想模型是小鼠毛囊。本文介绍了一种分离不同群体毛囊干细胞和表皮角质形成细胞的方案，该方法包括对小鼠背部皮肤进行酶消化处理，随后进行流式细胞术分析。...

从背侧小鼠皮肤中分离毛囊干细胞与表皮角质形成细胞

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本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。...

一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

本方案描述了如何从小鼠模型中分离皮肤角质形成细胞，使用金属标记抗体进行染色，并通过质谱流式细胞术分析染色后的细胞，以表征目标蛋白在不同细胞周期阶段中的表达模式。...

用于质谱流式细胞术进行细胞周期特异性细胞蛋白表达分析的小鼠皮肤角质形成细胞的分离与染色

本文介绍了一种在三维悬浮培养体系中系统培养表皮球体的实验方案。该方案可广泛应用于多种上皮组织类型，并可用于多种人类疾病和病理状态的建模研究。...

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

本实验方案描述了从小鼠成年腭部分离和培养口腔角质形成细胞的方法。同时报道了一种使用免疫染色进行评估的方法。...

从小鼠成年腭部分离和培养原代口腔角质形成细胞

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。...

人包皮来源的施万细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的分离、培养与鉴定

学习从成年小鼠背部皮肤分离表皮角质细胞的方法，用于分子生物学和干细胞研究。该技术可产生约三千万个活细胞，存活率达百分之八十，适用于皮肤癌发生模型和细胞生物学研究。

小鼠表皮角质形成细胞的分离及其体外克隆培养

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