Name: 建立过度表达 dr3 的细胞系, 评估抗有丝分裂治疗的凋亡反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 了解如何通过逆转录病毒感染建立稳定过表达FLAG标记DR3的HT29细胞系，用于研究死亡受体3在有丝分裂抑制剂诱导的细胞凋亡中的作用机制。该方法为DR3功能研究提供了可靠的体外和体内工具。

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本工作获得了清华大学资助项目 53110000117（资助 G.W.）和 043222019（资助 X.W.）的支持。

请注意，本文所述所有小鼠实验均经清华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其规定进行。
1. DR3 过表达细胞系的构建
<ol>
	<li>通过将带有C端3x FLAG标签的全长DR3 cDNA插入到逆转录病毒载体pMXs-IRES-Blasticidin的BamHI/XhoI限制性酶切位点，构建用于DR3表达的质粒（pMXs-IRES-DR3-FLAG）。</li>
	<li>在60 mm培养皿中用4 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养Plat-A细胞。次日，当细胞融合度达到80% - 90%时，按照制造商说明书使用转染试剂（见材料表）将2 μg质粒pMXs-IRES-DR3-FLAG转染入细胞20。</li>
	<li>72小时后，收集上清液，用0.45 μm无菌滤器过滤培养基，并将病毒悬液避光保存于4 °C。</li>
	<li>在60 mm培养皿中用DMEM培养HT29细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。</li>
	<li>次日，当细胞融合度达到30% - 50%时，在每毫升病毒悬液中加入8 μg的1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷聚合溴化物，用2 mL病毒悬液感染细胞。在37 °C孵育4 - 6小时后，吸除病毒悬液，加入4 mL新鲜DMEM，并将培养皿放回培养箱。</li>
	<li>感染后24小时，弃去培养皿中的培养基，用2 mL预热的PBS小心洗涤细胞。向细胞中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>在10倍显微镜下观察，当大多数细胞已脱落时，加入含10%胎牛血清（FBS）的完全DMEM培养基2 mL终止消化反应。将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温（RT）下以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL DMEM中，轻轻吹打混匀。将细胞按30倍、100倍和300倍稀释，接种至150 mm培养皿中，每皿加入含1 µg/mL杀稻瘟菌素的20 mL DMEM。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育约1 - 2周。</li>
	<li>在此期间，每天使用倒置显微镜在10倍放大下观察克隆形成情况。当克隆直径约为1 - 2 mm时，在培养皿底部标记孤立良好的克隆。</li>
	<li>吸除培养基，并用3 mL预热的PBS洗涤细胞。在60 mm培养皿中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA。使用无菌镊子夹取经高压灭菌的无菌克隆环，将其放入60 mm培养皿中。将含有胰蛋白酶-EDTA的克隆环轻轻放置在已标记的克隆上方。确保每个克隆环内仅包含一个克隆，并避免与邻近克隆发生污染。</li>
	<li>将培养皿放回培养箱孵育3分钟。</li>
	<li>3分钟后，在10倍显微镜下检查细胞是否已脱落。当细胞脱落后，向每个克隆环中加入70 μL培养基以灭活胰蛋白酶。使用200 μL移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。此过程中注意不要移动克隆环。</li>
	<li>将每个克隆的细胞悬液转移至两个24孔板中，每孔含1 mL DMEM。在A板中每孔加入30 μL细胞悬液，在B板对应孔中加入70 μL。正确标记培养板后放回培养箱继续培养。</li>
</ol>
2. DR3 过表达细胞系的验证
<ol>
	<li>当B板中的细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用1 mL PBS小心洗涤细胞。彻底去除PBS后，加入50 μL 1x SDS-PAGE上样缓冲液裂解细胞。将细胞裂解液从24孔板转移至1.5 mL离心管中，在100 °C下煮沸10分钟。</li>
	<li>在恒定电压80 V下电泳15分钟，随后在120 V下电泳1小时，使用10%十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶分离样品。</li>
	<li>通过湿转法在恒定电流400 mA下电转2小时，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>使用抗FLAG抗体检测不同克隆中的DR3表达，以野生型HT29细胞作为阴性对照（图1）。将一抗用含0.1% Tween-20的TBST（Tris缓冲盐水）中溶解的5%脱脂奶粉按1:5,000稀释，在4 °C下与膜孵育过夜。</li>
	<li>在室温下，将膜置于脱色摇床上以200 rpm的速度用TBST洗涤，每5分钟更换一次TBST，总洗涤时间为15分钟。</li>
	<li>将膜与按1:10,000稀释于5%脱脂奶粉中的抗小鼠二抗在4 °C孵育5–6小时。</li>
	<li>再次按照步骤2.5所述方法洗涤膜。</li>
	<li>使用Western增强化学发光（ECL）底物检测FLAG表达，并用凝胶成像系统成像（参见材料表）。将表达DR3的克隆确定为阳性克隆。</li>
	<li>将A板中对应于B板阳性克隆的细胞转移至6孔板，继续扩增细胞直至在10 cm培养皿中培养。对来自阳性克隆的细胞制备冻存样本，并储存于-80 °C以备后续使用。</li>
</ol>
3. 细胞对有丝分裂抑制剂凋亡反应的评估
注意：Diazonamide 是一类新型海洋天然产物，具有显著抑制癌细胞生长的活性，其作用与其它微管去稳定剂相似21。然而，其作用机制仍不明确。为检测细胞对有丝分裂抑制剂的反应，使用紫杉醇（paclitaxel）和 diazonamide 处理野生型 HT29 细胞及 HT29-DR3 细胞。将药物溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 mM 的储备液，再用 DMSO 进一步稀释为不同浓度：30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM 和 10,000 nM。
<ol>
	<li>通过胰酶消化收集HT29和HT29-DR3细胞。使用自动细胞计数仪测定细胞密度。随后，将细胞以3 × 10⁵个/毫升的密度接种于12孔板中，培养基为DMEM。4 每孔细胞。次日，加入10 nM重氮酰胺，以1% DMSO作为阴性对照。处理48小时后，在10倍放大倍数下于显微镜下观察细胞图2).</li>
	<li>将HT29和HT29-DR3细胞以3 x 10⁵个/毫升的密度接种于96孔板中，培养基为DMEM3 每孔接种适量细胞，于37 °C培养过夜。随后向各孔加入浓度递增的重氮酰胺，分别为0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM和100 nM，以含1% DMSO的溶液作为阴性对照。</li>
	<li>处理48小时后，根据制造商说明书，使用基于荧光素酶的细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。
	<ol>
		<li>从培养箱中取出96孔板，在室温下静置约30分钟。然后向每孔加入50 µL检测试剂，在室温下振荡孵育2分钟以裂解细胞，再于室温下继续孵育10分钟。使用微孔板读板仪测定各孔的发光值图3). 
		注意：细胞活力表示各孔相对于用1% DMSO处理的对照孔的相对发光强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用6周龄雌性BALB/c裸鼠进行实验 体内 研究14. 
	注意：小鼠在特定无病原体条件下饲养。
	<ol>
		<li>用预热至37 °C的DMEM终止HT29和HT29-DR3细胞的胰蛋白酶消化，收集细胞悬液至50 mL离心管中，在室温下以1,000 rpm离心10 min。弃去上清液，用不含FBS的DMEM重悬细胞沉淀。再次离心细胞，并用PBS重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞稀释至浓度为 2.5 x 107 cells/mL，用PBS制备。通过在每只小鼠右侧 flank 皮下注射200 μL HT29或HT29-DR3细胞悬液（5 x 106 细胞/小鼠22.</li>
		<li>使用游标卡尺在移植后每2天测量一次肿瘤体积（TV）。采用以下公式计算肿瘤体积：TV = 1/2L × W × W（其中，W：肿瘤宽度，L：肿瘤长度）。当平均肿瘤体积达到约100 mm³时3，将小鼠随机分配至对照组或处理组（n 每组6只，并开始治疗。</li>
		<li>按如下步骤配制紫杉醇溶液：首先，将紫杉醇完全溶解于相当于总体积5%的乙醇中，然后加入相当于终体积5%的聚氧乙烯35蓖麻油。最后，用D5W（5%葡萄糖水溶液，pH 7.4）补足剩余90%的体积。</li>
		<li>以20 mg/kg的剂量每周3次静脉注射紫杉醇，持续两周。每周测量3次肿瘤体积和体重14若动物体重下降达20%或肿瘤体积达到约2,000 mm³，应终止实验并对动物实施安乐死。3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何声明。

在本文中，我们描述了一种生成 HT29-DR3 稳定细胞系的方法。HT29-DR3 细胞为研究 DR3 在抗有丝分裂药物诱导凋亡过程中所参与的分子机制提供了一个模型。该方法具有良好的通用性和可重复性。为确保实验成功，需重点关注方案中的四个关键步骤：首先，为获得足够高的病毒滴度，建议在 Plat-A 细胞融合度达到 80%–90% 时进行 DNA 转染。其次，病毒悬液应避光保存于 4 °C，且保存时间不应超过 2 周。第三，在将感染后的细胞分种至 150 mm 培养皿时，建议进行梯度稀释，以获得分离良好的单克隆集落，因为不同细胞的感染效率存在差异。最后，在挑取单个克隆时，应避免周围其他克隆的污染。
该方案适用于大多数细胞系，但对于不易形成单细胞克隆的细胞可能效果较差。在此类情况下，需要采用其他细胞分选技术，例如联合使用抗生素与荧光激活细胞分选（FACS）。
稳定转染包括病毒和非病毒方法。在本方案中，我们采用逆转录病毒感染的方法来获得过表达DR3的细胞，理由是物理方法（如电穿孔）对细胞的毒性较大...

异源基因表达常用于研究目的基因的功能。在细胞与分子生物学中，瞬时转染和稳定转染是两种常用方法，用于将一段DNA或RNA导入宿主细胞。1,2瞬时转染的DNA或RNA无法传递给子代细胞，因此遗传改变只能维持较短时间。相比之下，在稳定转染的细胞中，外源基因被整合到宿主细胞基因组中，从而在细胞系中持续表达。因此，稳定转染通常用于长期基因调控的研究。稳定细胞系还可作为异种移植移植物植入小鼠模型中 体内 研究3稳定转染可分为病毒性和非病毒性两类。与非病毒性转染相比，病毒感染能以更高的效率将基因导入更多种类的人类细胞中。4,5,6,7此外，来自单克隆的稳定细胞系具有均一性和克隆纯度的优势。
不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床治疗中，抗有丝分裂药物是多种肿瘤的主要治疗手段8。然而，抗有丝分裂药物的一些重要局限性不容忽视。首先，这类化疗药物在杀伤异常癌细胞的同时也可能杀死正常细胞，从而导致严重的副作用8。其次，尽管微管蛋白作为细胞骨架蛋白在多种组织中广泛表达，但抗微管药物并非对所有类型的肿瘤都有效9,10。目前尚不清楚为何抗微管药物在临床治疗中对卵巢癌、肺癌和血液系统肿瘤表现出良好的疗效，却对肾癌、结肠癌或胰腺癌无效11。&#160;最后，即使是患有同种类型肿瘤的患者，对抗有丝分裂药物的反应也可能存在不可预测的个体差异&#160;。可能存在某种关键效应分子，影响不同患者对抗有丝分裂药物的敏感性，从而导致临床治疗中观察到的多样化结果12。因此，在优化治疗干预策略时，应充分考虑患者对抗有丝分裂治疗潜在的个体化敏感性差异13。
一项高通量全基因组siRNA文库筛选表明，DR3基因敲低可使敏感细胞对有丝分裂抑制药物产生抗性，提示DR3在化疗诱导的细胞凋亡中发挥作用14。作为肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，DR3已被报道在多种系统中介导细胞凋亡15,16,17,18。因此，我们着手建立稳定过表达DR3的细胞系，以研究有丝分裂抑制药物诱导凋亡的分子机制。人结肠癌细胞系HT29可作为研究DR3过表达的合适细胞模型，因其被发现缺乏DR3表达。此外，在临床中，结肠癌对有丝分裂抑制药物不敏感19。
本文介绍了一种通过逆转录病毒感染生成 HT29-DR3 稳定细胞系的方法。我们进一步展示了如何利用蛋白质印迹法验证这些细胞中 DR3 的表达，并通过细胞活力检测和形态学观察来评估其对有丝分裂抑制剂的敏感性。这些细胞由单克隆扩增而来，因此具有同质性良好的遗传背景。此外，DR3 上的 FLAG 标签使得可通过显微镜观察细胞内 DR3 的定位，并可通过生化方法分析基因表达和蛋白质相互作用。同时，这些细胞还可移植至小鼠体内，以进一步在活体（in vivo）条件下分析肿瘤进展对有丝分裂抑制剂的响应14。
本文介绍的HT29-DR3细胞系统为研究抗有丝分裂药物如何杀死癌细胞的分子机制提供了一种有效工具14。由于过表达和基因敲低细胞系是研究基因功能的常用工具，本实验方案可轻松适用于其他目的基因或其他细胞系，因而有望成为一种广泛应用的研究方法。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>添加10% FBS和1%青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>发光法细胞活力检测</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷多甲基溴化物</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠二抗</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>抗Flag抗体</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A细胞系</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>克隆环</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>细胞成像多功能读板仪</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm细胞培养皿</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m无菌滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96孔白色聚苯乙烯微孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL底物</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>脱色摇床&amp;nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I减血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

建立过表达dr3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

通过调控目的基因的表达水平，可以研究其功能，例如利用基因敲低细胞系降低其表达，或利用过表达细胞系提高其表达。瞬时转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬时转染仅适用于短期表达，而稳定转染可使外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现持续表达。因此，稳定转染通常用于长期遗传调控的研究。本文介绍一种简单的实验方案，用于构建稳定过表达带标签的死亡受体3（DR3）的细胞系，以探究DR3的功能。我们在逆转录病毒感染后挑选单克隆，以确保稳定细胞系的均一性和纯度。利用该方案构建的稳定细胞系可使DR3缺陷的HT29细胞对抗有丝分裂药物产生敏感性，从而在HT29细胞中重建凋亡反应。此外，DR3上的FLAG标签弥补了优质DR3抗体难以获得的不足，并有助于通过生物化学方法研究抗有丝分裂药物诱导凋亡的分子机制。

稳定表达DR3的HT29细胞的表征如图1所示。这些克隆表达不同水平的DR3，而作为阴性对照的野生型细胞则不显示外源基因的表达。此处仅展示五个克隆，其中克隆1和克隆5表达DR3的水平最高。我们选择克隆1和克隆5用于后续实验。
通过倒置显微镜在10倍放大倍数下观察了给予重氮酰胺后HT29和HT29-DR3细胞的形态，结果如图2所示。经10 nM重氮酰胺处理48小时后，HT29-DR3细胞表现出明显的凋亡特征，包括细胞膜破裂和细胞碎片（下图）；而HT29细胞仅表现出有丝分裂阻滞，细胞完整，呈圆形（上图）。
HT29 和 HT29-DR3 细胞经重氮酰胺处理后的细胞活力如图3</s...

建立稳定过表达目的基因的细胞系以研究基因功能，可通过稳定转染法实现，即在转染后筛选单克隆细胞。 通过 逆转录病毒感染。在此，我们展示了通过该方法生成的HT29-DR3细胞系揭示了死亡受体3（DR3）在有丝分裂抑制剂诱导的细胞凋亡中的作用机制。

建立过表达DR3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应

通过调控目的基因的表达水平（例如利用基因敲低技术降低其表达）可研究该基因的功能……

在细胞中过表达基因是研究基因功能的重要方法。通过逆转录病毒进行稳定转染，可使内源基因整合到宿主基因组中并持续表达。我们挑选了逆转录病毒感染后的单克隆，建立了稳定过表达FLAG标签DR3的细胞系。这些细胞系弥补了优质DR3抗体难以获得的不足，为体外和体内研究DR3功能提供了极佳的工具。我们通过筛选逆转录病毒感染后的单个克隆，建立了DR3过表达细胞系。来源于单克隆的细胞系能够保持高度的均一性和纯度。此外，该实验方案操作简便。开始此实验前，将plat-A细胞在含4毫升DMEM的60毫米培养皿中过夜培养。当细胞融合度达到80%至90%时，按照试剂生产商说明书中的步骤，使用转染试剂将2微克构建好的质粒转染至细胞中。72小时后，收集上清液。使用0.45微米的无菌滤器过滤培养基，并将病毒悬液置于4摄氏度避光保存。接下来，在60毫米培养皿中用DMEM培养HT29细胞过夜，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞。当细胞融合度达到30%至50%时，在每毫升病毒悬液中加入8 µg的polybrene，用2 mL病毒悬液感染细胞。将感染后的细胞在37 °C条件下孵育4至6小时，然后吸除病毒悬液。加入 4 毫升新鲜 DMEM，然后将培养皿放回培养箱。感染后 24 小时，吸去培养皿中的培养基，并用 2 毫升预热的 PBS 轻轻洗涤细胞。加入 1 毫升胰蛋白酶 EDTA，于 37 °C 孵育 3 分钟。在10倍显微镜下观察细胞，确保大多数细胞已脱落。随后加入2毫升含10% FBS的DMEM以终止消化反应，并将细胞悬液收集至15毫升离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10毫升DMEM中，轻轻吹打混匀。接着，将细胞按30倍、100倍和300倍进行稀释。将细胞接种至直径150毫米的培养皿中，每皿含有20毫升DMEM，其中添加终浓度为1微克/毫升的杀稻瘟菌素（blasticidin）。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养约一至两周。在此期间，每天使用10倍放大倍率的倒置显微镜观察菌落。当菌落直径约为一至两毫米时，在培养皿底部标记出分离良好的菌落。孵育结束后，吸除培养基，用 3 毫升预热的 PBS 洗涤细胞。在 60 毫米培养皿中加入 2 毫升胰蛋白酶 EDTA。用无菌镊子夹取经高压灭菌的无菌克隆环，放入培养皿中。然后，取起圆柱体，此时每个圆柱体内将含有约 30 微升的胰蛋白酶 EDTA，轻轻将其覆盖在标记的克隆上。将培养皿放回培养箱中孵育 3 分钟。之后，在显微镜下检查细胞，以确保其已脱离。当细胞脱落后，向每个培养柱中加入70 µL培养基以灭活胰蛋白酶。使用200 µL移液器轻轻混匀细胞悬液，注意混匀过程中不要移动培养柱。准备两个24孔板，分别标记为A板和B板。向每个孔中加入1 mL DMEM。向A板的每个孔中加入30微升细胞悬液，向B板的对应孔中加入70微升。将培养板放回培养箱中。当B板中的细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用1毫升PBS小心洗涤细胞。彻底移除PBS后，加入50微升1× SDS-PAGE上样缓冲液以裂解细胞。五分钟后，将24孔板中的细胞裂解液转移至1.5毫升离心管中。在100°C下煮沸样品10分钟。将样品在10% SDS凝胶上以80伏恒定电压电泳15分钟，然后以120伏电泳1小时。然后在400毫安恒定电流下，通过湿转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，持续2小时。将一抗用含5%脱脂牛奶的TBST溶液稀释5,000倍。将FLAG抗体加入膜中，在4摄氏度下孵育过夜。将脱色摇床设置为 200 RPM，用 TBST 洗涤膜 15 分钟，每 5 分钟更换一次 TBST。然后，用 5% 脱脂牛奶将抗小鼠二抗稀释 10,000 倍。将膜在 4°C 下与稀释后的二抗孵育 5 至 6 小时。再次按照之前所述方法在脱色摇床中洗涤膜。随后，使用Western增强化学发光法和凝胶成像系统对膜进行成像，以检测FLAG表达。首先，通过胰酶消化收集HT29和HT29-DR3细胞，并使用自动细胞计数器测定细胞密度。将细胞以每孔30,000个细胞的密度接种到12孔板中，每孔加入DMEM培养基，并在37°C、5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，向含细胞的各孔中加入10纳米浓度的重氮酰胺，以含1% DMSO的孔作为阴性对照，然后将培养板转移至37°C、5%二氧化碳的培养箱中继续培养。处理48小时后，在显微镜下以10倍放大倍数对细胞进行成像观察。接下来，将HT29和HT29-DR3细胞分别以每孔3,000个细胞的密度接种至96孔板中，每孔加入DMEM培养基，并在37摄氏度下培养过夜。次日，按照文本方案中所述添加浓度递增的diazonamide。处理48小时后，使用基于化学发光的细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。从培养箱中取出96孔板，在室温下静置约30分钟。然后向每孔加入50 µL检测试剂，在室温下振荡孵育2分钟以裂解细胞。室温避光孵育10分钟后，使用酶标仪测定各孔的发光值。对稳定表达DR3的HT29细胞进行表征发现，不同克隆表达DR3的水平存在差异，而野生型细胞不显示外源基因表达。其中基因1和基因5的克隆表达DR3水平最高，因此被选用于后续实验。在用重氮酰胺处理48小时后，观察HT29细胞与HT29-DR3细胞的形态学变化。HT29-DR3细胞表现出明显的凋亡特征，细胞膜破裂并伴有细胞碎片。然而，HT29细胞仅表现出有丝分裂阻滞，细胞完整，呈圆形。在用3纳摩尔的重氮酰胺处理48小时后，测定这些细胞类型的存活率。HT29-DR3 细胞的死亡率超过 80%，而亲本 HT29 细胞仅表现出轻微的有丝分裂阻滞反应。这表明 DR3 的过表达在这些细胞中重建了由二氮杂内酰胺诱导的凋亡通路。适当的连续稀释对于获得单克隆的最佳密度至关重要。还需确保每个克隆环内仅含有一个克隆，并避免污染邻近的克隆。DR3过表达细胞系有助于在体外对分子机制进行生物化学研究。我们通过皮下注射HT29-DR3细胞建立了HT29-DR3异种移植模型，这有助于阐明抗有丝分裂药物在体内诱导细胞凋亡的作用机制。该方案可用于研究其他细胞系中感兴趣的基因。此外，基因敲除是进行功能研究的另一种方法，而本方案也可适用于基因敲低系统。因此，该方法可广泛用于阐明基因功能。请记得将病毒移液器丢弃至指定容器中，以确保安全处理。

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建立过度表达 dr3 的细胞系, 评估抗有丝分裂治疗的凋亡反应

在过表达或敲低特定基因后评估Ramos B细胞中的体细胞高频突变

检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。...

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

通过活细胞共聚焦成像，实时记录了菲啶类化合物PJ-34在有丝分裂过程中对癌细胞的细胞毒性作用。PJ-34可清除含有额外中心体的有丝分裂期人乳腺癌MDA-MB-231细胞。与正常的双极有丝分裂不同，在PJ-34存在下，额外的中心体未能聚集到两个纺锤体极。...

活体癌细胞中通过共聚焦成像观察到的异常有丝分裂相关的细胞死亡

本文介绍了一种用于检测活细胞与邻近死亡或濒死细胞发生物理相互作用后所诱导的细胞内信号转导事件的实验方案。该方案侧重于由受体介导的对死亡细胞识别所引发的信号事件，而非对死亡细胞的吞噬摄取或可溶性介质的释放。...

通过与正在经历凋亡性细胞死亡的邻近细胞相互作用，在活细胞中诱导的细胞内信号事件的鉴定

我们在此描述一种用于研究预先激活的CD8细胞毒性的实验方案+ 通过检测凋亡的癌细胞来识别针对癌细胞的T细胞 通过 实时显微镜技术。该方案可用于研究髓系细胞诱导的T细胞抑制机制，并评估旨在恢复T细胞功能的化合物 通过...

实时检测CD8+ T细胞诱导的体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

本文介绍了几种用于评估三维肿瘤细胞球体存活与死亡的简单方法。相比二维培养，三维细胞球体能更真实地模拟体内肿瘤的理化梯度环境。因此，该球体模型可更准确地评估抗癌药物的疗效，并提高向体内条件的转化预测能力。...

评估癌细胞三维球状培养物中的细胞活力与死亡

本方案详细描述了一种非遗传性转录延伸缺陷的小鼠癌变体外模型。在此模型中，通过持续抑制CDK9来阻抑RNA聚合酶II在促炎反应基因上的有效延伸过程，从而模拟并研究临床上观察到的TEdeff现象，该现象存在于约20%的人类癌症类型中。...

一种基于小鼠细胞系的慢性CDK9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（TEdeff）

本文介绍了一种用于免疫组织化学的福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀块对照品的制备方案。...

福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组织化学对照的标准化处理

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

了解如何通过逆转录病毒感染建立稳定过表达FLAG标记DR3的HT29细胞系，用于研究死亡受体3在有丝分裂抑制剂诱导的细胞凋亡中的作用机制。该方法为DR3功能研究提供了可靠的体外和体内工具。

建立过表达DR3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应

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