Name: 基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 了解基于CRISPR-Cas9的竞争检测方法，用于并行研究急性髓系白血病（AML）中的多个候选基因。该技术快速、可扩展，适用于其他癌细胞系，有助于识别潜在治疗靶点并加速癌症研究。

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pCW-Cas9 质粒由 Eric Lander &amp;#38; David Sabatini 惠赠（Addgene 质粒 # 50661），pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W 质粒来自 Yusa 实验室（Addgene 质粒 #67974）。我们感谢 SBP 医学发现研究所流式细胞术核心平台在流式分析与分选方面提供的及时帮助。我们感谢 Lady Tata 纪念基金会对 A.D. 的资助支持。我们同时感谢以下资助机构的支持：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 P30 CA030199 癌症中心资助项目、V 基金会以及圣地亚哥国家癌症研究所癌症中心（C3）#PTC2017 对 A.J.D. 的资助。

1. 构建高表达稳定且有活性Cas9的AML细胞系克隆
<ol>
	<li>Cas9 慢病毒的制备
	<ol>
		<li>第 0 天：在生物安全二级（BSL2）认证的细胞培养操作台中，将 4 × 106 个 293T 细胞接种于含 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素和 L-谷氨酰胺的 10 mL DMEM 培养基中，置于 10 cm 组织培养皿内。将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育。</li>
		<li>第 1 天：接种的 293T 细胞在第 1 天应达到 70–80% 汇合度。于下午按照以下方案进行转染。</li>
		<li>将转染培养基、细胞培养基和转染试剂恢复至室温。解冻转染所需的所有质粒。</li>
		<li>在 5 mL 离心管中，将 9 µg psPAX2、0.9 µg pMD2.G 和 9 µg pLenti-Cas9 质粒与 500 µL 转染培养基混合。</li>
		<li>向 14 mL 圆底离心管中加入 1.7 mL 转染培养基。将 57 µL 转染试剂直接加入管内的转染培养基中，避免接触管壁。</li>
		<li>轻柔地将全部质粒混合物加入转染试剂溶液中，并通过轻弹管壁混匀。室温孵育 20–30 分钟。在此期间，更换已接种 293T 细胞的培养皿中的培养基。</li>
		<li>将转染混合物逐滴加入培养皿中，并轻轻左右摇动培养皿以充分混匀。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育。</li>
		<li>第 2 天：轻柔地吸除转染培养皿中的上清液，避免扰动或脱落细胞。弃去上清液。沿培养皿侧壁缓慢加入 10 mL 新鲜的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，以避免细胞脱落。</li>
		<li>第 3 天：使用 10 cm 无菌注射器缓慢吸取转染培养皿中含有病毒的上清液。将上清液吸入注射器后，连接一个无菌的 0.45 µm 滤器，将注射器和滤器置于新的无菌 15 mL 聚丙烯离心管上方。轻推注射器活塞，使含病毒的上清液经 0.45 µm 滤器过滤后进入 15 mL 聚丙烯离心管中。</li>
		<li>将病毒条件培养基分装为每管 2 mL，置于 2 mL 冻存管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AML 细胞系的转导
	<ol>
		<li>第 -1 天：用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将 1 mg/mL 重组人纤连蛋白片段原液稀释至 10 µg/mL。在经 BSL2 认证的细胞培养操作台中，用 2 mL 10 µg/mL 重组人纤连蛋白片段工作液包被未经组织培养处理的 6 孔板。用保鲜膜包裹培养板以防止蒸发，并于室温过夜孵育。</li>
		<li>第 0 天：解冻含 Cas9 的病毒上清液。在离心转导（spinfection）前，彻底吸除包被板中的重组人纤连蛋白片段溶液。向每孔加入 2 mL 含 Cas9 的病毒条件培养基，并在 35 °C 下以 1,300 × g 离心 90 分钟。此步骤有助于病毒颗粒附着于孔底。</li>
		<li>同时，计数待转导的细胞，并在 15 mL 聚丙烯离心管中以 2 × 106 个细胞进行离心。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 新鲜培养基中。</li>
		<li>离心转导后，完全吸除转导孔中的病毒上清液并弃去。上清液中的逆转录病毒颗粒已附着于孔底。向该孔中加入上述步骤中重悬于 2 mL 培养基的 2 × 106 个细胞。</li>
		<li>再次短暂离心培养板（1–2 分钟），速度为 1,300 × g，以使细胞充分沉降至孔底。将培养板放回培养箱中过夜孵育，使细胞与已附着的病毒颗粒完成转导。</li>
		<li>第 1 天：根据细胞密度，向转导后的细胞中补充适量培养基，以防止过度生长。</li>
		<li>第 2 天：由于 pLenti-Cas9 质粒含有杀稻瘟菌素（Blasticidin）抗性标记，向转导和未转导（对照）的 MOLM13 或小鼠 MLL-AF9 白血病细胞中加入 10 µg/mL 的杀稻瘟菌素，以筛选表达 Cas9 的细胞。 
		注意：当所有未转导的对照细胞均被清除时，可认为 Cas9 转导的 MOLM13 或 MLL-AF9 白血病细胞的杀稻瘟菌素筛选已完成。对于 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞以外的其他细胞系，应在本实验前进行剂量-反应曲线测定，以确定最佳筛选浓度。若转导效率较低，也可对病毒上清液进行滴定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高 Cas9 表达细胞克隆的筛选 
	注意：我们发现，在某些 AML 细胞系中，可能无需进行克隆筛选：经 Cas9-杀稻瘟菌素富集的群体细胞已具备较高的基因组编辑效率。在此情况下，可跳过步骤 1.3，直接进入步骤 1.4，通过 Western 印迹法检测群体 Cas9-杀稻瘟菌素 AML 细胞中的 Cas9 表达水平。在进行竞争实验前，仍需评估这些群体 Cas9-AML 细胞的基因编辑效率（步骤 1.5）。我们推测，筛选单个高 Cas9 表达克隆可降低基因组编辑的变异性，这在测试多种不同的单导向 RNA（sgRNA）时尤为重要。
	<ol>
		<li>使用位于 BSL2 认证操作台内的 FACS 分选仪，对经 Cas9-杀稻瘟菌素筛选的 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞（以下简称 MOLM13-Cas9 和 MLL-AF9-Cas9 细胞）进行单细胞分选。分选可进行至 5–10 块未经组织培养处理的圆底 96 孔板中。</li>
		<li>在挑选并单独命名单个 MOLM13-Cas9 和 MLL-AF9-Cas9 克隆后，使用含 10 µg/mL 杀稻瘟菌素的培养基扩增 10–20 个克隆，以维持 Cas9 的持续表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫印迹法检测稳定表达的 Cas9 蛋白
	<ol>
		<li>使用核提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明，制备所有经杀稻瘟菌素筛选的 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞克隆的核提取物。使用抗 Flag M2 抗体检测 Cas9 蛋白的表达，因为 pLenti-Cas9 质粒中的 Cas9 蛋白连接有 N 端 Flag 表位。</li>
		<li>将每个核提取物中的 50 µg 总蛋白上样至 10% Bis-Tris 凝胶中，在 120 V 条件下电泳，直至上部条带充分分离。</li>
		<li>用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液封闭膜 1 小时。</li>
		<li>将膜与 1:1,000 稀释的抗 Flag M2 抗体（终浓度为 1 µg/mL）在 4 °C 下孵育过夜。</li>
		<li>次日，用 TBST 缓冲液洗涤膜，然后在室温下与 1:5,000 稀释的 HRP 标记的抗小鼠二抗（终浓度为 0.16 µg/mL）孵育 1 小时。</li>
		<li>用 TBST 缓冲液充分洗涤膜，使用 ECL 底物显影。</li>
		<li>根据 Western 印迹结果，选择 Cas9 蛋白表达水平最高的 3–4 个克隆用于后续功能分析（图 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保所选克隆中 Cas9 的高活性
	<ol>
		<li>按照步骤 1.1 所述方法，从编码靶向人或小鼠 AAVS1 安全位点的 sgRNA 载体中制备慢病毒上清液。</li>
		<li>使用上述离心转导法，将 Cas9 表达水平最高的 MOLM13 或 MLL-AF9 白血病克隆与抗 AAVS1 sgRNA 的慢病毒上清液进行转导。使用 2.5 µg/mL 嘌呤霉素筛选 4 天。</li>
		<li>在嘌呤霉素筛选后，使用基因组 DNA 提取试剂盒，按照制造商说明，从 MOLM13-Cas9 或 MLL-AF9-Cas9 白血病克隆及其相应的野生型对照中提取基因组 DNA。以 50 ng DNA 为模板，使用 AAVS1_test_primers 引物，配合 Taq DNA 聚合酶 2× 预混液，按照 表 1 所列 PCR 程序进行 PCR 扩增。</li>
		<li>将 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明回收 268 个碱基对的条带。使用 AAVS1_target-frag_F 引物对回收的 PCR 产物进行 Sanger 测序。</li>
		<li>通过在线基于网络的工具比对 AAVS1 编辑序列与野生型序列，评估编辑效率（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在 AML-Cas9 细胞中进行 sgRNA 的克隆与转导
<ol>
	<li>中高通量sgRNA克隆
	<ol>
		<li>使用基于网络的CRISPR设计软件为感兴趣基因设计4–6条sgRNA。目前有多种在线CRISPR设计工具，例如http://crispr.mit.edu/，可根据输入的DNA序列生成sgRNA序列。
		<ol>
			<li>在带星号的字段中填写适当信息。点击目标基因组以进行sgRNA设计。将目标序列粘贴至Sequence框中，然后点击Submit按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若要在pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W sgRNA表达质粒中进行克隆，在订购前需在正义链寡核苷酸前添加核苷酸“CACC”，在反向互补的反义链寡核苷酸前添加“AAAC”。向寡核苷酸合成公司订购预混的正义链和反义链寡核苷酸，并将其置于标记为Oligo-Mix的96孔板中。 
		注意：我们使用了pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W质粒，该质粒含有用于sgRNA克隆的BbsI限制性酶切位点。如果使用其他sgRNA表达质粒，则需相应调整sgRNA寡核苷酸所用的突出末端。</li>
		<li>取一个单独的U型底96孔板，标记为Annealing Plate。每轮退火反应配制1 µL T4 PNK、1 µL 10x T4 DNA连接缓冲液和6 µL水的主混合液。</li>
		<li>将8 µL主混合液加入退火板的每一孔中。向主混合液中加入各1 µL的100 µM正义链和反义链寡核苷酸（或2 µL混合的正义-反义寡核苷酸）。轻轻吹打2–3次以充分混匀，短暂离心使液体沉至孔底。</li>
		<li>在PCR仪上使用以下退火程序：37 °C孵育30分钟，95 °C孵育2分30秒，随后以0.1 °C/s的速率缓慢冷却至22 °C。退火完成后，取一个新的96孔板标记为Diluted OligoMix。使用多通道移液器将上述反应中磷酸化并已退火的寡核苷酸用水稀释200倍（1:200）。</li>
		<li>在37 °C条件下，用1.5 µL BbsI限制性内切酶（10,000单位/mL）及适当的缓冲液对5 µg pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W载体消化2小时，使其线性化以便后续连接。</li>
		<li>取一个新的96孔板标记为Ligation Plate，在每个目标sgRNA连接反应对应的孔中加入20 ng经BbsI消化的pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W载体。向其中加入2 µL来自Diluted OligoMix板的磷酸化并已退火的寡核苷酸。</li>
		<li>加入1 µL 10x T4连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。用多通道移液器轻轻吹打混匀，室温孵育连接反应混合物2小时。 
		注意：连接反应混合物可在-20 °C保存，用于后续转化步骤。</li>
		<li>在连接反应即将结束前约10分钟，将90 µL化学感受态E. coli细胞置于冰上解冻。</li>
		<li>使用多通道移液器将感受态细胞以每孔10 µL分装至另一个96孔板的各孔中。</li>
		<li>将步骤2.1.8中的连接混合物加入含感受态细胞的孔中，轻轻吹打混匀，室温孵育10分钟。</li>
		<li>用移液器直接从上述反应中取5 µL细菌-DNA混合物，点种到含有LB琼脂及100 µg/mL氨苄青霉素的6孔板中。对每个转化反应重复此操作。</li>
		<li>将每个转化反应分别接种至6孔板中独立标记的孔内。向每孔加入约5–8颗玻璃珠，将整个6孔板以圆周运动方式摇晃8–10次。</li>
		<li>用无菌20 µL移液枪头从每孔挑取1–2个单菌落，在标记清晰的含LB琼脂及100 μg/mL氨苄青霉素的10 cm培养皿上划线。划线后，直接将用于菌落划线的枪头弹入对应编号的14 mL圆底管中，该管内已含有3 mL LB-氨苄青霉素培养基。</li>
		<li>将细菌培养板直接送测Sanger测序，使用人U6启动子正向引物。</li>
		<li>在确认克隆的sgRNA序列正确后，按照制造商说明书，使用质粒小提试剂盒从对应的14 mL管中提取质粒DNA。</li>
		<li>使用分光光度计测定各小提质粒的浓度和质量。将每个小提质粒归一化至15 ng/µL的浓度，并用移液器转移至标记为sgRNA Clones Plate的96孔板中。 
		注意：该板可于-20 °C保存，或直接用于病毒制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA构建体的病毒生产与转导
	<ol>
		<li>以96孔板形式生产sgRNA慢病毒颗粒时，请遵循Broad研究所遗传扰动平台（GPP网络门户）提供的“shRNA/sgRNA/ORF高通量病毒生产（96孔）”方案（网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols）。</li>
		<li>将200 µL病毒上清液转移至无菌管中，并立即在-80 °C冷冻保存。</li>
		<li>第-1天：在BSL2级细胞培养生物安全柜中，向平底非组织培养处理的96孔板每孔加入100 µL浓度为10 µg/mL的重组人纤维连接蛋白片段。用保鲜膜包裹该板以防止蒸发，室温放置过夜。</li>
		<li>第0天：从各孔中移除重组人纤维连接蛋白片段。将各sgRNA的病毒上清液室温解冻。将每管中的50 µL病毒上清液加入转导板的各包被孔中。在35 °C、1,300 x g条件下离心90分钟。</li>
		<li>在离心感染（spinfection）即将结束时，从培养瓶中计数MOLM13-Cas9（克隆B3）细胞。每孔接种10,000个细胞，总体积为100 µL。计算所有转导孔所需的细胞数，并考虑移液过程中的死体积。</li>
		<li>90分钟离心感染结束后，使用多通道移液器缓慢倾斜板子，以50 µL的设定量从各孔中吸除上清液。沿孔壁缓慢加入100 µL MOLM13-Cas9克隆B3细胞的培养液。</li>
		<li>在35 °C、1,300 x g条件下离心2分钟，使细胞沉降至孔底。随后将板转移至37 °C组织培养级培养箱中。</li>
		<li>第1天：向每孔含有sgRNA转导的Cas9-MOLM13或Cas9-MLL-AF9白血病细胞的培养物中加入100 µL新鲜培养基，使最终培养基体积达到200 µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 竞争性生长实验
<ol>
	<li>第3天：转导后72小时（第3天），通过流式细胞术（FACS）检测每个孔中含sgRNA的BFP阳性细胞的比例。使用细胞活力染料标记并排除死细胞，以进行分析。</li>
	<li>每次FACS分析后，将部分细胞继续传代至含有新鲜培养基的新孔中，以避免在实验过程中细胞过度生长。</li>
	<li>每2–3天重复一次FACS分析，以检测BFP阳性（BFP+ve）细胞相对于BFP阴性（BFP-ve）细胞的相对比例（图3）。使用FlowJo或类似的FACS分析软件，分析每个时间点的BFP阳性细胞百分比。
	<ol>
		<li>将每个样本的Fcs文件拖入FlowJo软件。双击任一样本文件，在X轴为前向散射光（FSC）、Y轴为侧向散射光（SSC）的散点图上绘制点图，并圈选所有细胞。</li>
		<li>双击已圈选的细胞，在Y轴为活力染料信号、X轴为FSC高度（H）或面积（A）的散点图上重新绘制，圈选出活力染料阴性（活细胞）的细胞群。</li>
		<li>双击已圈选的活细胞群，在X轴为FSC（A）、Y轴为BFP的散点图上绘制，圈选BFP+ve细胞。通过将选定样本拖至Group选项卡下的All Samples，将所有这些门控应用到全部样本。</li>
		<li>点击Table Editor创建所有样本的分析表格。将某一样本中的BFP+ve细胞数量拖入表格，然后点击Table Editor中的Display按钮，生成包含所有样本的批量报告表格，显示各样本中BFP+ve细胞的百分比。将该表格保存为xls文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算随时间变化活细胞群体中BFP阳性细胞百分比的相对增加或减少，并将该比值与对照sgRNA（如荧光素酶、随机序列或GFP sgRNA）中的BFP阳性细胞比值进行比较。</li>
	<li>以第3天为基准，绘制包括目的基因及对照在内的不同sgRNA对应的BFP阳性细胞比值曲线图。</li>
</ol>

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</ol>

A.J.D 是 A2A Pharmaceuticals（新泽西）和 Salgomed Therapeutics（圣地亚哥）的顾问。其他作者无任何利益冲突需要声明。

在本文中，我们描述了一种基于CRISPR-Cas9的竞争性生长实验的详细方案，用于通过流式细胞术在人/小鼠急性髓系白血病（AML）细胞中研究候选基因在AML细胞系中的功能图5）。该检测的目的是在中等通量规模上，评估基因敲除对急性髓系白血病（AML）细胞增殖维持能力的影响，持续时间为两到三周。为顺利实现本方案的规模化，某些关键步骤需严格遵循。在制备Cas9慢病毒时，必须将病毒培养上清液通过0.45 µM滤器过滤，以避免293T细胞污染病毒上清液。在离心感染（spinfection）过程中，使用保鲜膜或封口膜包裹离心板有助于防止离心期间发生污染；但离心完成后，在将培养板放回组织培养孵箱前，必须去除保鲜膜。评估表达Cas9的克隆株的基因编辑效率至关重要。基因组编辑效率较低的克隆株提示Cas9活性不足，可能影响实验的成功率。在我们的实验中，首先使用靶向AAVS1位点的sgRNA转导人AML Cas9克隆株，随后对其基因组DNA进行测序以评估编辑效率。可利用TIDE等在线网络工具比对AAVS1编辑序列与野生型序列的差异8 （https://...

过去几十年来，大量研究致力于揭示关键分子通路在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。传统上，AML细胞中的基因失活主要通过条件性基因敲除小鼠或短发夹RNA（shRNA）来实现。尽管基因敲除小鼠能够提供时空可控的基因删除系统，但构建这类小鼠模型费时、费力且成本高昂。此外，基于重组策略的基因敲除难以扩展规模，不适合并行研究多个基因的功能。自从发现利用小干扰RNA（siRNA）或shRNA进行RNA干扰以敲低内源性mRNA的方法后，许多研究团队开始采用RNA干扰技术来探究特定基因在AML中的功能。由于小鼠和人类AML细胞均难以通过传统的脂质体转染方法进行有效转染，大多数研究采用慢病毒或逆转录病毒编码的shRNA来研究AML细胞中基因的功能。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关的Cas核酸酶（CRISPR-Cas9）系统的发现彻底改变了基因靶向技术1,2,3。利用CRISPR-Cas9，可以高效且简便地对特定基因或基因组区域进行删除、编辑或标记。由于该技术具有操作简便、效率高和适用范围广等优势，基于CRISPR-Cas9的基因编辑正逐渐成为研究多种细胞类型中基因型与表型关系的首选方法。在AML研究中，CRISPR-Cas9技术也日益成为主流方法，不仅用于分析单个基因的功能，还被广泛应用于阵列式或混合式遗传筛选中，以并行方式系统性地鉴定多个可能作为AML依赖基因的候选靶点4,5,6。
在本文中，我们描述了一种简单的竞争性生长检测方法，用于评估基因失活对急性髓系白血病（AML）细胞生长的影响。该方法基于稳定的CRISPR-Cas9介导的基因编辑，随后进行高通量流式细胞术分析。该方法操作简便、效率高，可扩展用于中等通量实验，以平行研究多个基因在AML细胞中的功能。

<table><tbody><tr><td>FLAG-M2 抗体</td><td>sigma-aldrich</td><td>F3165, 货号 # SLBS3530V</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠抗体</td><td>Invitrogen</td><td>31446, 货号 # TA2514341</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统</td><td>BIO RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>Thermo Fisher</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>SAFC</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>单gRNA载体</td><td>Addgene #67974</td><td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic 核提取试剂盒</td><td>sigma-alorich</td><td>NXTRACT</td><td></td></tr><tr><td>XtremeGENE 9</td><td>sigma-alorich</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>NEBioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接缓冲液</td><td>NEBioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9731-500</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>稳定感受态细胞</td><td>NEBiolabs</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解液</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质沉淀液</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA 水合溶液</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BbSI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>APEX 2.0x Taq Red Master Mix 试剂盒</td><td>Genessee Scientific</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯圆锥管</td><td>Fisher scientific</td><td>1495949A</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯圆锥管</td><td>Fisher scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

基因扰动研究已被广泛用于探究单个基因在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。为了实现完全的基因敲除，许多研究采用了复杂的基因敲除模型。尽管这些使用基因敲除小鼠的研究为探究基因型与表型之间的关系提供了优雅且经过长期验证的系统，但开发一种快速且可扩展的方法，用于在AML模型中评估影响AML细胞增殖或存活的候选基因，将有助于加速对多个候选基因的并行分析。近年来基因组编辑技术的进步极大地提升了我们以前所未有的规模进行遗传扰动的能力。其中一种基因组编辑系统是基于CRISPR-Cas9的方法，可用于对靶细胞基因组进行快速而高效的修饰。CRISPR/Cas9介导的基因删除因其操作简便和易于扩展，成为在表型检测中分析大量基因最具吸引力的技术之一。本文介绍一种简单的方法，结合CRISPR/Cas9介导的基因破坏与基于高通量流式细胞术的竞争性检测，用于研究可能在人和小鼠AML细胞系增殖或存活中发挥重要作用的基因。

在本研究中，我们首先用编码Cas9-杀稻瘟菌素慢病毒质粒的高滴度病毒感染携带MLL-AF9易位的MOLM13人急性髓系白血病（AML）细胞系。在我们的实验条件下，未经分选的混合MOLM13-Cas9细胞通过Western blot检测未显示高水平的Cas9表达，并且在进行基因编辑效率检测时表现不佳——所用方法如前所述7。因此，我们进一步建立了单细胞克隆，并仅选择Western blot检测显示高Cas9表达水平的克隆（图1）。我们挑选了两个不同的克隆，并用靶向AAVS1安全位点的sgRNA进行转导，方法如前文所述7。从嘌呤霉素筛选后的MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA克隆中提取基因组DNA，使用跨越AAVS1 sgRNA切割位点的引物进行PCR扩增，并对每个MOLM13克隆的10个独立菌落中特异的268 bp PCR产物进行Sanger测序。与亲本序列比对后，我们发现MOLM13-Cas9克隆B3和MLL-...

本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9 的方法，可用于并行地对多个候选基因在急性髓系白血病（AML）细胞增殖中的作用进行简单且快速的研究。该技术具有可扩展性，也可应用于其他癌细胞系。

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

基因扰动研究已被广泛用于探究单个基因在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。为了实现基因的完全敲除……

本视频将演示一种利用CRISPR-Cas9系统结合基于流式细胞术的竞争性生长实验，平行研究急性髓系白血病（AML）中多个候选基因的简便方法。该技术的主要优势在于快速且可扩展。演示该实验步骤的是本实验室的博士后Bo Rui Chen。使用基于网络的 CRISPR 设计软件为感兴趣基因设计四到六个单导向 RNA。首先，在带星号的字段中填写相应信息，然后选择单导向 RNA 设计的靶基因组。将目标序列粘贴到序列框中，然后点击提交按钮。为了在所需的单导向RNA表达质粒中进行克隆，请在正义寡核苷酸的5'端添加核苷酸CACC，在反向互补的反义寡核苷酸的5'端添加AAAC。随后向公司订购预混的正义与反义寡核苷酸，以96孔板形式提供，标记为Oligo Mix。另取一个单独的U型底96孔板，标记为退火板。为每孔退火反应配制预混液：每份包含1微升T4多聚核苷酸激酶、1微升10×T4 DNA连接酶缓冲液以及6微升水。向退火板的每个孔中加入8微升上述预混液，随后加入2微升预先混合好的正义链与反义链寡核苷酸。轻轻吹打混匀两到三次，然后短暂离心使混合液沉至孔底。在PCR仪中使用以下退火程序：37摄氏度孵育30分钟，95摄氏度变性2分30秒，随后以每秒0.1摄氏度的速率缓慢冷却至22摄氏度。退火完成后，准备一个新的96孔板，标记为“稀释寡核苷酸混合物”，将退火反应中磷酸化并已退火的寡核苷酸用水稀释1:200。使用适当的缓冲液，在37摄氏度条件下孵育2小时，加入1.5微升BBS1限制性内切酶消化5微克单导向RNA表达载体，使其线性化。接着，取一个新的标记为“连接板”的96孔板，向每个目标单导向RNA连接反应对应的孔中加入20纳克经BBS1消化的单导向RNA表达载体。向其中加入 2 µL 来自稀释后 Oligo Mix 板的磷酸化退火寡核苷酸。每孔加入 1 µL 10X T4 连接酶缓冲液和 1 µL T4 连接酶酶液，轻轻吹打混匀。将板在室温下孵育两小时。在连接反应结束前约10分钟，将90微升感受态大肠杆菌细胞置于冰上。将感受态细胞分别转移10微升至另一块96孔板的各个孔中。将连接反应混合物加入含有感受态细胞的各孔中。轻轻吹打混匀，在室温下孵育10分钟。从每种转化反应中吸取五微升细菌DNA混合物，直接加入含有含100毫克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂的6孔板中的一个孔内。向每个孔中加入约5至8颗玻璃珠，将6孔板以圆形轨迹振荡8至10次。将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。次日，用无菌的20微升移液器吸头从每个孔中挑取一至两个单菌落，并在含有LB琼脂和100毫克/毫升氨苄青霉素的无菌10厘米培养皿上标记好的位置划线接种。在LB平板上划线后，将吸头弹入标记有相应细菌克隆编号的14毫升圆底管中的3毫升氨苄青霉素培养基内。随后，将细菌平板直接送去做Sanger测序。在确认克隆的单导向RNA序列后，使用质粒小提试剂盒，按照制造商的说明从相应的14毫升离心管中纯化DNA。慢病毒单导向RNA颗粒的制备采用96孔板格式，具体步骤如文本方案所述。病毒上清液立即于-80摄氏度冷冻保存。在将单导向RNA转导至AML Cas9细胞的前一天，使用10微克/毫升浓度的重组人纤维连接蛋白片段对平底非组织培养处理的96孔板进行包被，每孔加入100微升。用保鲜膜包裹该板以防止蒸发损失，并在室温下放置过夜。次日，从96孔板的每个孔中移除重组人纤维连接蛋白片段。将每种单链向导RNA的病毒上清液在室温下解冻。从每根试管中取50 µL病毒上清液，分别加入转导板的每个包被孔中。用保鲜膜包裹培养板，以避免离心过程中可能发生的污染。在35摄氏度下，以1,300 ×g离心90分钟。在离心感染接近结束时，从培养瓶中计数高表达Cas9的克隆B3细胞。计数后，将所需数量的细胞离心沉淀，并重悬于新鲜培养基中。90分钟的离心感染后，将培养板倾斜，使用调整至50微升的多通道移液器缓慢吸出所有孔中的上清液。随后，沿孔壁缓缓加入100微升B3细胞克隆的培养物。在35摄氏度下以1,300 ×g离心2分钟，使细胞沉降至孔底。将培养板转移至37摄氏度的组织培养级孵育箱中。次日，向每孔含有单导向RNA转导细胞的孔中加入100微升新鲜培养基，使最终培养基体积达到200微升。然后将培养板放回孵育箱中。转导后72小时，通过流式细胞术检测每个孔中含单链引导RNA的BFP阳性细胞百分比。使用细胞活力染料标记并排除死细胞，以进行分析。每次检测分析后，将部分细胞继续传代至含新鲜培养基的新孔中，以避免在实验过程中细胞过度生长。每两到三天重复一次流式细胞术分析，以检测BFP阳性细胞相对于BFP阴性细胞的比例。使用流式细胞术分析软件，分析每个时间点BFP阳性细胞的百分比。竞争性增殖实验成功的关键在于采用恰当的设门技术，以确保最终活细胞数量的准确性。将每个样本的 FCS 文件拖入软件中。双击任意一个样本文件，绘制前向散射光（x 轴）与侧向散射光（y 轴）的散点图。圈选所有细胞。双击已圈选的细胞，在 y 轴上绘制活率染料信号，x 轴为前向散射光高度或面积点图，圈选活率染料阴性的细胞。双击已圈选的活细胞，在 y 轴上绘制 BFP 信号，x 轴为前向散射光信号点图。圈选BFP阳性细胞。通过在“分组”选项卡下将选定样本的门控拖拽至所有样本，将门控应用于全部样本。点击表格编辑器，为所有样本创建分析表格。将一个样本中BFP阳性细胞计数拖入表格，在表格编辑器中点击显示按钮，生成所有样本的批量报告，表格中显示BFP阳性细胞的百分比。将表格保存为Excel文件。该系统被用于研究可能在人和小鼠急性髓系白血病（AML）细胞系增殖或存活中发挥作用的基因。使用两种不同的单导向RNA靶向AAVS1安全港位点，对人MOM13 Cas9细胞的增殖无影响。相比之下，当靶向与DNA复制相关的基因RPA3时，与未转导的BFP阴性细胞相比，BFP阳性细胞的比例出现渐进且显著的下降。类似地，在小鼠MLL-AF9 Cas9细胞中检测了靶向表观遗传调控因子Dot1l和眼色素基因Rhodopsin的单导向RNA的作用。结果显示，靶向Dot1l的单导向RNA与靶向Rhodopsin的单导向RNA相比，表现出显著且渐进的竞争性增殖抑制效应。这些结果表明，表达 MLL-AF9 的大量白血病细胞对 Dot1l 的缺失具有敏感性，证实了先前已发表的研究结果。假设每个基因使用四到六个引导 RNA，该方法非常适合并行检测至少 16 至 24 个基因，也可应用于任何癌细胞系中基因依赖性的检测。当涉及更多数量的基因时，例如需要在急性髓系白血病（AML）细胞中检测整个分子通路的情况，基于 CRISPR-Cas9 文库筛选的方法将更为适用。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

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一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。...

利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

早期发育依赖于母源遗传的产物，而这些产物中许多的功能目前尚不清楚。本文描述了一种利用 CRISPR-Cas9...

利用母源性crispant确定母源性表达基因在早期发育中的作用

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。...

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

了解基于CRISPR-Cas9的竞争检测方法，用于并行研究急性髓系白血病（AML）中的多个候选基因。该技术快速、可扩展，适用于其他癌细胞系，有助于识别潜在治疗靶点并加速癌症研究。

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

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