Name: 淋巴瘤组织学标本中多路荧光组织化学染色、成像与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学习多路荧光免疫组织化学染色技术，用于淋巴瘤组织标本中多种肿瘤相关抗原的定位与定量分析。该方法可实现单张切片上多标志物的共表达评估，帮助研究人员深入理解肿瘤微环境中的空间关系。

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S.-B.N. 和 A.D.J. 获得新加坡卫生部国家医学研究理事会过渡奖（NMRC/TA/0020/2013 和 NMRC/TA/0052/2016）的支持。作者感谢新加坡国家大学癌症研究所向 A.D.J. 提供的 Yong Siew Yoon 研究资助，用于购买 Vectra 光谱成像显微镜。本研究已获得新加坡 NHG 专业领域审查委员会 B 的批准（编号：2014/00693）。

本方案中使用的所有组织均根据新加坡NHG特定领域审查委员会B的研究2014/00693获取。
1. 抗体的选择与验证
注意：在建立任何多重检测面板之前，需确保所有抗体均能强效染色，且仅识别目标抗原。目标是选择能够特异性识别组织切片中目标抗原的抗体。
<ol>
	<li>对于在免疫组化（IHC）中已有明确研究用途或常规临床应用的抗体，应通过在阳性和阴性对照组织切片上进行常规IHC5,13，确认表位修复和抗体稀释度等实验条件。对于来源于人类的组织切片，在启动实验前须确保已获得适当的伦理审批。 
	注：阳性对照是指预期表达目标抗原的组织，阴性对照则是指不表达该抗原的组织。良性扁桃体组织被选作淋巴瘤相关抗原的良好对照组织，因其含有包括B细胞、T细胞和抗原呈递细胞在内的多种免疫细胞，以及间质和上皮细胞。后者可作为有用的内部阴性对照。</li>
	<li>对于未知靶点或缺乏充分已发表数据的商用抗体，可通过CRISPR基因敲除或siRNA干扰技术，在合适的细胞系中利用标准分子生物学方法对目标抗原进行敲除或表达下调，并制备相应的阳性与阴性福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）细胞块14，以完成抗体验证。将这些FFPE细胞块替代阳性和阴性对照组织，用于步骤1.1所述的常规IHC检测。 
	注：对于非细胞类型特异性的抗原，通常使用HeLa或293T细胞；而对于淋巴细胞特异性抗原，尽管转染效率较低，仍可采用病毒转导或电穿孔作为基因递送方式，在淋巴瘤细胞系中进行实验。</li>
</ol>
2. 多重抗体组合中抗体与荧光染料顺序的设计
<ol>
	<li>规划最终多重染色中试剂的使用顺序。例如，本实验中多重染色方案的初始顺序为：第一，Bcl-6；第二，Bcl-2；第三，C-Myc；第四，CD20；第五，Ki67。 
	注意：确定染色顺序时，应优先使用亲和力较弱、需要较高浓度的抗体进行染色。在多重染色方案中，应将具有高亲和力、可能耐受多次微波剥离的抗体放在最后使用，以避免非特异性染色。</li>
	<li>为每种抗体选择相应的荧光染料配对。本示例中的选择可参见表1和材料表。 
	注意：为每种抗体选择荧光染料时，对于在细胞和组织内定位模式相似的抗体，应选择光谱上 distinct 的荧光染料，以最大限度减少光谱重叠及解混困难。</li>
</ol>
3. 基于单plex酪胺的免疫荧光在模拟5-plex多重检测面板中的应用
注意：本示例中讨论的是CD20的实验方案，该抗体计划作为上述多重染色序列中的第四个抗体。抗体在序列中的位置不同，所需的额外剥离步骤次数也会有所不同。
<ol>
	<li>使用切片机切割阳性与阴性对照组织的3 µm薄切片，并将切片置于聚-L-赖氨酸包被的显微镜载玻片上。</li>
	<li>使用适当的透明剂脱蜡，每次4分钟，重复3次。将切片依次浸入100%乙醇、90%乙醇和70%乙醇中进行水化，每种浓度各4分钟。将切片置于蒸馏水中2至3分钟。</li>
	<li>将切片置于耐微波的玻璃罐中，加入标准抗原修复缓冲液（商品化产品）以浸没切片。使用合适的微波炉，在pH9抗原修复液中于98 °C条件下进行热诱导表位修复（HIER），持续25分钟。 
	注意：可使用功率范围为 800 - 1,100 瓦的任何微波炉，并可根据实际情况优化热诱导表位修复（HIER）条件。本实验中采用了一台多功能微波组织处理仪（开放于空气中）进行 HIER 处理。&#160;剥离。特定表位回收的初始设置基于传统免疫组化（IHC）的已有经验。</li>
	<li>进行额外的微波抗原修复步骤（本例中为四重抗体标记中的第四种抗体，共进行三轮），每轮均以100%功率加热至98°C，随后以20%功率维持10分钟&#160; 相同温度下。将玻片在蒸馏水中冷却至少10分钟。 
	注意：在单重免疫荧光步骤中，需进行多轮微波修复，以使目标抗原经历与建议的多重染色方案相同次数的加热处理。由于计划将CD20作为第四种抗体，因此在孵育一抗前需进行3次微波修复，一抗孵育后再进行1次微波修复。</li>
	<li>每次微波漂白后每隔5分钟检查并补充缓冲液。重要的是，在多次漂白过程中切勿让切片干燥。从微波炉中取出切片时，使用镊子和耐热手套将其放入盛有蒸馏水的独立容器中。等待抗原修复液自然冷却。</li>
	<li>使用商用过氧化物酶阻断剂阻断组织过氧化物酶活性，孵育10分钟（也可选用3%过氧化氢作为替代试剂）。用含非离子型去污剂的Tris缓冲盐溶液（TBS）洗涤5分钟。 
	注意：TBS 由 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）和 150 mM NaCl 组成。将 TBS 配制成 TBS-D。</li>
	<li>用抗体稀释液或牛血清白蛋白封闭 15 分钟，随后与目标一抗孵育（例如，CD20，抗体稀释液中1:2,000稀释，参见 材料表室温下孵育30分钟。用TBS-D缓冲液洗涤3次，每次5分钟。每次洗涤均应使用足量的TBS-D缓冲液，确保完全浸没玻片。 
	注意：牛血清白蛋白可作为替代的抗体稀释液。抗体稀释液的体积取决于组织大小，范围从50 µL（用于活检样本）至400 µL（用于切除样本或组织微阵列样本）。</li>
	<li>使用与一抗来源物种相匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，在室温下孵育15分钟。用TBS-D缓冲液洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入适量基于酪酰胺的荧光试剂（以扩增稀释液按1:100稀释），室温孵育5分钟，使荧光基团在组织样本中与一抗结合位点发生偶联。用TBS-D缓冲液洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>使用微波法再次进行 stripping，以去除一抗和二抗。根据抗体在序列中的位置，按需重复此步骤。</li>
	<li>将载玻片放入蒸馏水中冷却。&#160;用 DAPI（以抗体稀释液按 1:100 稀释）孵育 10 分钟，随后用 TBS-D 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。用擦布擦干载玻片上无组织区域，再用适当的封片介质封片。</li>
	<li>对载玻片进行成像（参见本方案的第6和第7节），并评估染色效果的适当性（以阳性与阴性对照组织能够清晰区分作为判断标准）。 
	注意：如果染色模式不正确，请调整以下一个或多个参数后重新进行单plex染色：热修复步骤的次数、热修复强度、抗体（一抗和二抗）的孵育时间/浓度、抗体在染色流程中的顺序，以及荧光染料的选择。单plex染色步骤通常需要经过多轮优化，才能获得合适的染色参数组合。建议针对每种一抗测试多种不同的荧光染料，以便在最终确定多重染色组合时具有更大的灵活性。</li>
</ol>
4. 多重检测方案中每种抗体的单重检测重复步骤
<ol>
	<li>通过调整微波剥离步骤的次数，以类似方式对多重检测面板中其余抗体进行单重染色，具体次数取决于该抗体在染色序列中的位置。例如，在六重多重检测面板中对第三个抗体进行单重染色时，应在一抗孵育前进行两次微波剥离，在一抗孵育后进行三次微波剥离。 
	注意：需特别注意，基于微波的抗体剥离过程同时会使样本暴露于热诱导表位修复（HIER）条件下。若某一特定抗体需要不同的表位修复策略，则在设计多重染色顺序时必须考虑此因素。在此示例中，Ki67的表位修复需要在pH 9条件下进行30分钟。由于在连续染色方案中，KI67染色前已进行25分钟HIER处理，因此仅需额外增加5分钟HIER即可。</li>
</ol>
5. 多重染色方案
注意：仅在使用单plex免疫荧光染色优化所有组分后，再进行多重染色实验方案。仔细分析单plex染色的结果，并设计一个表格，展示多重染色的最终顺序以及每种抗体所选用的荧光染料。本实验中每种抗体的抗体浓度、染色时间、热修复的顺序与条件等详细信息见表1。
<ol>
	<li>使用切片机切割阳性对照组织、阴性对照组织以及目标组织（本例中为淋巴瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本）的3 µm薄切片，并将切片置于聚-L-赖氨酸包被的载玻片上（参见材料表）。 
	注意：建议在每种抗体检测中均设置阳性和阴性对照，同时进行多重检测的实际样本分析。这有助于确认染色流程是否正确执行。</li>
	<li>按照单重免疫荧光（monoplex）方案的步骤3.3–3.5进行脱蜡、热诱导表位修复（HIER）以及组织过氧化物酶活性的封闭。</li>
	<li>根据先前通过单重免疫荧光步骤优化确定的多重染色顺序，加入第一种一抗。在本示例中，BCL-6以1:30的比例溶于抗体稀释液中，在室温下孵育60分钟（参见材料表），作为多重染色流程的第一步。随后用TBS-D缓冲液洗涤5分钟。</li>
	<li>根据上一步所用一抗的宿主物种，加入相应的HRP标记的二抗（参见材料表），在室温下孵育10分钟。然后用TBS-D缓冲液洗涤5分钟。</li>
	<li>加入优化后的基于酪胺的荧光试剂（本例中为Cy5，以1:100比例溶于扩增稀释液中，参见材料表），在室温下孵育5分钟。孵育结束后，用TBS-D缓冲液洗涤5分钟。 
	注意：所选的基于酪胺的荧光试剂应依据单重免疫荧光优化结果确定。</li>
	<li>使用合适的显微镜检查第一种抗体的染色效率（参见材料表）。 
	注意：如果样本为组织微阵列（TMA）或单张玻片，则可方便地进行中间成像检查。但如果在多个玻片上同时进行染色，则此步骤可能不切实际，可予以省略。</li>
	<li>按照单重步骤中优化的条件，对流程中的第二种抗体进行微波剥离处理。随后继续进行第二种一抗（本例中为BCL2）的染色，包括使用HRP标记的二抗和基于酪胺的荧光试剂（本例中为520，参见材料表）。在完成第二轮染色后，使用荧光显微镜检查染色效率。</li>
	<li>类似地，依次对序列中的第三、第四和第五种抗体（本例中分别为c-Myc、CD20和ki67，对应的荧光染料分别为570、540和620）重复上述操作。若条件允许，每步之间均应进行成像检查。</li>
	<li>加入核复染剂（DAPI，以1:100比例溶于抗体稀释液中）孵育10分钟，然后用TBS-D缓冲液洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>使用适当的封片试剂对玻片进行封片。</li>
</ol>
6. 光谱库玻片的制备
注意：本方案的第6至8节仅适用于使用光谱相机成像的多重实验。
<ol>
	<li>在相同的对照组织上制备每种荧光染料、DAPI 和自发荧光的文库切片（单染参考图像），用于多光谱图像分析。
	<ol>
		<li>使用切片机切割2 x 3 µm厚度的目标组织类型切片（此处为淋巴瘤样本或作为对照的扁桃体），并将切片置于聚-L-赖氨酸包被的显微镜玻片上。</li>
		<li>使用单重检测方案处理两张切片（包含所有脱色和洗涤步骤），但不添加抗体或荧光染料。</li>
		<li>按照步骤5.9对其中一张切片进行DAPI染色，另一张切片保持未染色状态（用于获取组织自发荧光光谱）。 
		注意：优化后的单重检测切片（仅含一种荧光染料，不含DAPI）可用作文库切片，以生成每种荧光染料的光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的滤光片扫描这一组切片，并将其上传至图像分析文库中。</li>
</ol>
7. 光谱成像
<ol>
	<li>扫描单重染色切片
	<ol>
		<li>根据所使用的荧光染料，从可用的标准落射荧光滤光片（DAPI、FITC、CY3、Texas Red 和 CY5）中选择合适的滤光片。 
		注意：本示例中针对特定荧光染料推荐使用的滤光片组如下所示 表215.</li>
		<li>在相应的荧光通道中检查每个标记物，以确定获得清晰信号的合适曝光时间。重点关注预期对该标记物信号最强的组织成分。</li>
		<li>为每种分析物（抗体-荧光染料组合）确定固定的曝光时间，以实现不同样本间像素强度的比较（尽管某些商业平台具有归一化策略，可校正曝光差异）。
		<ol>
			<li>为确定特定通道的固定曝光时间，使用实时相机设置调节曝光时间，直至实时相机图像中无过曝区域，并对所有通道重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>扫描单重染色切片后，生成模拟的明场图像（如果所用软件具备此功能），以便与正常的免疫组化染色模式进行视觉比较，并判断染色模式是否正确图1 和 图2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描多重样本（组织芯片切片/多个样本）
	<ol>
		<li>按照扫描单重荧光图像的说明（步骤6.1）设置光学参数。首先，手动或自动调整焦距（遵循特定图像扫描仪的操作说明）。其次，调整每个荧光通道的曝光时间，以确保组织芯片（TMA）上的所有组织芯或载玻片上的所有区域均获得适当曝光。 
		注意：选择用于调整曝光时间的区域非常重要。用户需要为每个滤光片选择信号最强的区域即，扁桃体生发中心区域的Ki67信号强于非生发中心区域；因此，使用者应选择生发中心区域并设置适当的曝光时间。如果成像系统具备过饱和校正功能，也可加以采用。</li>
		<li>如果成像系统支持，使用适当的自动对焦算法，在TMA扫描模式下对TMA切片进行扫描。</li>
		<li>对于组织全切片，需由合格的病理学家对切片进行审阅，以从最具代表性的肿瘤区域中选取最佳图像。 
		注意：此处所述方案基于特定的显微镜/图像分析系统（参见 材料表还有其他仪器和图像分析软件可用于扫描和分析多重免疫组化切片7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>分析前评估与规划
	<ol>
		<li>使用自体荧光参考切片，从用于分析的扫描图像中减去自体荧光信号。</li>
		<li>在分析前检查图像，确保图像清晰且无染色伪影。</li>
		<li>使用肿瘤标志物（例如，本示例中为CD20）来识别目标细胞，并进行细胞分割、评分及批量分析。选择CD20阳性细胞进行分析。 
		注意：例如，在此处分析的DLBCL样本中，用于细胞分割的设定和参数基于细胞核大小和强度，但具体取决于所使用的图像分析软件例如，DAPI平均像素强度至少为0.05；大小介于80至320像素之间，分裂敏感度设为2［此为软件特异性参数，高度依赖肿瘤形态：对于小肿瘤细胞，分裂敏感度0.7–1较为合适；对于大肿瘤细胞，分裂敏感度可调整至4］。</li>
		<li>请求合格的病理学家审阅单个图像，判断是否需要进行组织分割以选择肿瘤细胞富集区域，并排除含有坏死区域或大量反应性细胞的区域。如需进一步组织分割，则应选择适当的对照区域（如肿瘤细胞/间质/坏死），并确认图像分析软件能够正确识别这些区域</li>
		<li>在组织分割（如有）后进行细胞分割，并请有资质的病理学家审核细胞分割图，以确保分割方法的准确性5.</li>
		<li>确定针对特定生物标志物的最符合生物学/临床意义的分析方法例如，每个细胞的阳性百分比或平均强度）。</li>
		<li>为每个标志物选择一个阈值（用于百分比阳性率）。</li>
		<li>与病理学家共同确定每种标志物的光学强度阳性截断值。使用适当的统计学软件分析标志物强度/细胞的频率分布，生成直方图（参见 材料表). 
		注意：强度值直方图可提供信号强度分布的总体概览。</li>
		<li>根据直方图确定一个近似的截断值，并通过病理学家复核进行验证，以与所选图像上手动确定的截断值相一致。在某些情况下，由于染色存在变异，无法采用统一的单一截断值，需为每个样本单独设定手动截断值。 
		注意：第8.1节应在图像分析软件中进行（参见 材料表除非另有说明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记阳性与阴性细胞 
	<ol>
		<li>针对每个感兴趣的标记物，根据所确定的阈值（通过直方图或手动设定），使用“IF”或类似的逻辑公式将阳性细胞和阴性细胞标记为数值：阳性细胞标记为数字1，阴性细胞标记为数字0。</li>
		<li>对于所有标记物的阳性判断，将每个标记物的标记值（1 或 0）分别与各列中的乘积相乘。若乘积等于 1，则表示该细胞对所有标记物均为阳性。对于特定标记物的阳性和阴性判断，使用 IF 逻辑算法。 
		注意：第8.2节需在统计学软件中完成（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数据透视表生成百分比数据和数值数据 
	<ol>
		<li>在特定细胞内生成目标标记物的百分比数据（例如，CD20阳性细胞，或CD20阴性细胞）（图6).</li>
		<li>在数据表中插入数据透视表。</li>
		<li>为计算单一标志物（如 CD20）的阳性百分比，选择 总和 功能在以下条件下 值 使用CD20的总和来统计CD20阳性细胞的总数，作为数据透视表的一部分+ 细胞数除以总细胞数，结果为CD20+ 一个核心或一个研究编号内的细胞百分比（取决于数据透视表行的选择）。</li>
		<li>使用相同方法计算多种标志物的阳性百分比（图3).</li>
		<li>生成数值数据。通过获取样本中所有研究细胞内各目标标记物的平均强度，得出每个核心或每个研究编号中各标记物的中位数标准化计数。图4). 
		注意：中位数无法直接在数据透视表中得出，需使用以下公式计算：MEDIAN(IF(研究编号所在列=特定研究编号, 归一化值所在列))。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在合适的图表中绘制数据
	<ol>
		<li>以适当的方式绘制目标细胞类型中各标志物的阳性百分比或中位强度结果，以便进行后续统计分析和展示。</li>
		<li>创建点图以直观展示数据的数量和分布情况。 
		注意：使用柱状图表示数据无法传达分布信息。建议同时使用估算图作为数据呈现的良好方法，以突出样本间差异的幅度16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Opal+Multiplex+IHC+Assay+Development+Guide%22">Opal Multiplex IHC Assay Development Guide</a>. , PerkinElmer, Inc. (2017).</li>
</ol>

A.D.J. 已获得 PerkinElmer 资助，用于参加用户组会议的差旅费用。作者无其他利益冲突需要披露。

多重免疫组化（mf-IHC）有望帮助病理学家进一步完善淋巴组织病理学中的诊断标准，并分析特定细胞类型中生物标志物的作用，从而预测临床预后。作为一种新兴的研究方法，mf-IHC 越来越多地被用于对肿瘤细胞的多种免疫参数进行定量和空间定位分析17。研究表明，mf-IHC 在检测肿瘤生物标志物共表达方面具有良好的可重复性和可靠性5。然而，该技术仍处于发展初期，其结果可能受到试剂和/或组织相关因素的影响而产生变异，例如组织固定和处理过程中的不一致性。
该技术的关键在于使用经过充分验证的抗体，这些抗体应具备特异性、灵敏性，并能产生可重复的结果。文献中已有报道，某些最初被描述为对其抗原具有特异性的抗体，后来通过基因敲除模型的实验被证明能够识别非相关蛋白14。这种敲除或敲减验证方法中，野生型细胞或抗原过表达的细胞作为阳性对照，而通过siRNA或CRISPR技术将靶标基因敲除或敲减的细胞则作为阴性对照。
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淋巴系统肿瘤是由淋巴细胞不受控制的恶性增殖所引起。这些细胞是免疫系统的重要组成部分，主要分布于骨髓、淋巴结、脾脏以及其他黏膜相关淋巴组织等初级和次级免疫器官。淋巴系统肿瘤是一组具有异质性的疾病，其分类依据包括形态学、免疫表型、遗传学特征以及临床表现等多种因素的综合判断。尽管各项参数均具有一定的作用，但细胞谱系仍是定义性特征，并构成了世界卫生组织（WHO）分类系统的基础，该系统将肿瘤分为来源于B细胞、T细胞和自然杀伤（NK）细胞的肿瘤1。
淋巴瘤分类的关键在于针对不同亚型淋巴细胞的白细胞表面标志物抗体的特征分析2。免疫组织化学（IHC）传统上被用于此类标志物的分析，其原理基于抗原-抗体的特异性识别，以检测细胞和组织中的分子，并通过光学显微镜进行可视化观察3。然而，传统的明场显色多重免疫组织化学在单张切片上同时检测多个靶标时存在局限性，因为在同一组织切片上可靠地区分多种颜色信号往往较为困难——尤其是对于表达水平极低的抗原4。染色结果的视觉评估与定量也可能具有主观性，从而导致分析过程和数据解读的变异性5。
因此，对于淋巴瘤等免疫学上具有异质性的疾病，传统的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本免疫组化（IHC）无法实现多个靶标的同步检测。此外，区分肿瘤性淋巴细胞与周围免疫细胞通常不够精确，这限制了针对淋巴瘤中新生物标志物相关性研究的开展。在此背景下，多重荧光免疫组化（mf-IHC）提供了一种有前景的替代方法，可在节约有限样本的同时，更精确地定量评估抗原共表达及其空间关系6,7. 当该成像技术与数字图像分析软件结合时，数据解读更加高效，有助于研究肿瘤及其微环境的异质性8,9。在本方案中，采用基于酪胺的免疫荧光（IF）多重标记方法以增强信号，该方法适用于来自任何宿主物种且已通过IHC验证的抗体，即使这些抗体来源于&#160;同一物种亦可使用5,7,10。基于酪胺的方案允许将荧光染料直接共价结合至目标组织，从而在每一步反应后去除一抗和二抗，实现多种染色剂的顺序应用，避免抗体间的交叉反应。
通过识别淋巴瘤中的靶点及其变异的免疫学模式，多重检测策略将有助于预测预后和治疗效果。在本实验室中，已应用多重荧光免疫组化技术研究血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）中一组T细胞和B细胞标记物以及滤泡辅助性T细胞标记物的表达情况；AITL是外周T细胞淋巴瘤的一种亚型，具有侵袭性的临床行为和肿瘤异质性特征11。该方法在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的应用价值也已得到证实，其中B细胞受体信号增强同时伴有C-MYC和BCL-2表达，提示可能适用于布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂进行治疗12。
本文详细介绍了从抗体验证到选择合适的对照组织以及使用淋巴瘤FFPE组织进行多重检测的完整方案，最终利用扫描自动化定量病理成像系统对染色切片进行分析。

<table><tbody><tr><td>抗体稀释液</td><td>DAKO</td><td>REF S3022</td><td>封闭</td></tr><tr><td>过氧化物酶阻断溶液</td><td>DAKO</td><td>S2023</td><td>用于过氧化物阻断</td></tr><tr><td>Vectra 多光谱全自动显微镜</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra2.0.8</td><td>光谱成像</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>EMSURE</td><td>1.00983.2500</td><td>用于再水化处理的乙醇</td></tr><tr><td>扩增稀释液</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1135</td><td>荧光团稀释缓冲液</td></tr><tr><td>抗小鼠IgG[山羊]HRP标记</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF822001EA</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抗兔IgG[山羊]HRP标记</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF812001EA</td><td>二抗</td></tr><tr><td>BCL2</td><td>DAKO</td><td>克隆号 124 (批号 20031561)(RRID-AB578693)</td><td>一抗</td></tr><tr><td>BCL6</td><td>LEICA</td><td>NCL-L-Bcl6-564(批号 6050438)(RRID-AB563429)</td><td>一抗</td></tr><tr><td>CD20</td><td>DAKO</td><td>克隆号 L26 (批号 20028627) (RRID-AB442055)</td><td>一抗</td></tr><tr><td>c-MYC</td><td>ABCAM</td><td>Y 69 克隆 ab32072 (批号 GR29511133)(RRID-AB731658)</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Cy 5</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1171</td><td>合适的基于酪胺的荧光试剂</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>Graph pad</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>组织透明剂 HistoClear</td><td>SIGMA</td><td>H2779-1L</td><td>用于脱蜡和透明处理的HistoClear</td></tr><tr><td>inForm Advanced&lt;br/&gt; 图像分析软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>Inform Software 2.2.1</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>KI67</td><td>DAKO</td><td>克隆号 MIB-1 (批号 20040401) (RRID-AB2314699)</td><td>一抗</td></tr><tr><td>KOS MILESTONE 多功能组织处理仪</td><td>Milestone</td><td></td><td>用于热诱导表位修复的微波设备</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>PANASONIC</td><td>NN-ST651M</td><td>微波脱片</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>81381 Aldrich Mowiol&amp;reg; 4-88</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1488</td><td>合适的基于酪胺的荧光试剂</td></tr><tr><td>Opal520</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1487B21</td><td>合适的基于酪胺的荧光试剂</td></tr><tr><td>Opal540</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1494</td><td>合适的基于酪胺的荧光试剂</td></tr><tr><td>Opal620</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1495</td><td>合适的基于酪胺的荧光试剂</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸包被载玻片</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>120-550-15</td><td>常规组织学中用于组织切片黏附的载玻片</td></tr><tr><td>光谱DAPI</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1490</td><td>核酸染料</td></tr><tr><td>靶点修复液，pH9.0(10x)</td><td>DAKO</td><td>S2367</td><td>用于HIER</td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水(TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF3030 20X4L</td><td>用于缓冲液洗涤</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>P1379-1L</td><td>Tween</td></tr></tbody></table>

淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

免疫组织化学（IHC）方法用于 原位 通过光学显微镜分析蛋白质表达是科研与诊断领域的重要工具。然而，利用传统显色免疫组化（IHC）技术在单个组织切片中对多种抗原进行可视化和定量分析具有挑战性。在淋巴瘤的研究与诊断中，多重成像尤为重要，因为相关标志物的解读必须结合复杂的肿瘤微环境背景。本文介绍一种多重荧光免疫组化染色方案，用于在淋巴瘤中对特定目标细胞类型内的多个靶标进行定量评估。该方法涵盖抗体验证、抗体优化、结合淋巴瘤亚型标志物的多重条件优化、组织微阵列（TMA）切片染色及切片扫描，并随后进行数据分析，特别针对淋巴瘤研究设计。通过该方法可获得目标标志物的平均信号强度及阳性百分比评分，以支持进一步的定量分析。多重检测可减少样本消耗，并为每种目标标志物提供空间定位信息。

显示了具有C-MYC和BCL2基因重排（双重打击淋巴瘤）的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）样本的多重免疫组化（mf-IHC）图像，见图1。图2展示了模拟的明场免疫组化图像。图3说明了百分比数据的生成过程。图4展示了用于生成数值数据的中位数公式的详细信息。图5展示了在血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤中应用T细胞抗体组合进行多重免疫组化（mf-IHC）的结果。图6显示了扁桃体对照样本的优化图像及该样本的数据分析结果。
<img alt="细胞标志物 CD20、BCL2、MYC、BCL6、Ki67 的免疫荧...

本文介绍了一种用于淋巴瘤组织中多种癌症相关抗原同时定位的多重荧光免疫组织化学染色与成像方案。该方案可推广应用于所有组织切片中生物标志物的共定位分析。

用于通过光学显微镜对蛋白质表达进行原位分析的免疫组织化学（IHC）方法，是研究和诊断领域的重要工具……

淋巴瘤在组织学上属于复杂的肿瘤。因此，与传统的显色免疫组织化学相比，多重荧光免疫组织化学在研究肿瘤细胞及其微环境中目标标志物方面具有优势。该技术有望实现组织学淋巴瘤样本中基于抗体染色评分的标准化，而这一过程由于肿瘤微环境的复杂性，在过去一直具有挑战性。具体而言，多重荧光免疫组织化学结合光谱成像技术可在单张切片上对多种染色进行定量测量，从而实现对临床样本中抗原共表达及空间关系的评估。首先，将脱蜡并复水的切片浸入标准抗原修复缓冲液中，置于微波炉安全的玻璃罐内，并在适当的微波炉中进行加热诱导的表位修复。根据抗体在最终多重染色序列中的位置，进行额外轮次的微波 stripping 处理。例如，第四种抗体在染色前需要额外进行三轮微波剥离。完成剥离过程后，使用镊子和耐热手套将切片转移至室温蒸馏水中，冷却至少10分钟。当抗原修复液冷却后，用商用过氧化物酶阻断剂阻断组织中的过氧化物酶活性，作用10分钟，随后在Tris缓冲盐水（TBS）中加入非离子型去污剂洗涤5分钟。用封闭缓冲液室温孵育10分钟，以阻断任何非特异性染色，随后加入目标一抗，室温孵育30分钟，并用TBS-D缓冲液洗涤三次，每次五分钟。接着，将样品与适当的辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育15分钟，然后如上所述用TBS-D缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，向切片加入适当的基于酪胺的荧光试剂，室温孵育五分钟，随后进行三次TBS-D缓冲液洗涤，每次五分钟。按照所示方法，使用新鲜的抗原修复液进行额外的微波介导剥离，以去除一抗和二抗。修复结束后，将切片在蒸馏水中冷却，并用实验室擦拭纸擦干切片上无组织的区域。室温下用 dappy 孵育切片 10 分钟，随后进行三次 TBS-D 洗涤。然后，使用实验室擦拭纸小心地将载玻片干燥，避免接触组织，并用适当的封片介质封片以进行成像。对于单plex载玻片扫描，根据用于标记样本的荧光染料选择相应的滤光片，并逐一检查每个标记物及其对应的荧光通道，以确定获得清晰信号的合适曝光时间，重点关注该标记物应呈现最强信号的组织成分。为了实现样本间的像素强度比较，使用实时相机模式调节每个独立通道的曝光时间，直至实时图像中无过曝区域。扫描完所有切片后，获取模拟明场图像，以便与正常的免疫组化模式进行直观比较，并判断染色模式是否正确。扫描组织芯片切片时，使用成像系统中的组织芯片扫描模式及适当的自动对焦算法。对于完整的组织切片，应由合格的病理学家对切片进行评估，以从最具代表性的肿瘤区域中选择最适宜的图像。开始分析前，选择一种肿瘤标志物以识别分析所需的感兴趣细胞。请病理学家审阅图像，并判断是否需要进行组织分割。如果需要，选择适当的对照区域进行分割，并检查图像分析软件能否正确识别这些区域。完成细胞分割后，应由病理学家审查分割图，以确保所采用的分割方法准确可靠，并逐一检查图像，判断细胞分割是否充分，或是否需要进一步进行组织分割，以选择富含肿瘤细胞、间质和/或坏死区域的区域。随后，在病理学家的协助下确定每个标记物的光学强度阳性阈值，并使用适当的统计软件生成直方图，以分析每个细胞标记物强度的频率分布。为了获得特定标记物在定义细胞群体中的百分比数据，可在数据表中插入数据透视表，并选择“求和”以计算单个目标标记物的阳性百分比。将计算标记阳性细胞总数占细胞总数的比例。该结果即为单个组织芯或单个研究编号的标记阳性细胞百分比。为了获得数值数据，需获取样本中所有细胞内各目标标记物的平均强度，以提取每个组织芯或研究编号中各标记物的中位数归一化计数。此处展示了具有 c-MYC 和 BCL2 基因重排的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤样本的代表性多重荧光免疫组化图像。模拟的明场免疫组化图像显示出相似的肿瘤标志物染色模式。将多重荧光免疫组化技术应用于血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤的 T 细胞抗体组合，可揭示该肿瘤样本中的细胞异质性。此处展示了扁桃体对照样本的优化过程及相应的数据分析结果。在完成光谱分离步骤后，可使用多种图像分析软件对肿瘤细胞及肿瘤微环境中的标志物表达水平和定位情况进行定量分析。该技术为研究人员在淋巴瘤单张组织切片中特定细胞类型内研究多种标志物的共表达提供了可行路径。在进行微波处理步骤时，注意防止热损伤，并在甲板上进行扫描步骤时注意防滑倒风险。

multiplexed-fluorescent-immunohistochemical-staining-imaging-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

淋巴瘤组织学标本中多路荧光组织化学染色、成像与分析

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。...

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。...

优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。...

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

本方案详细描述了如何利用多重免疫组织化学对肿瘤微环境中的免疫细胞进行表征。...

肿瘤微环境中空间免疫细胞格局的多重免疫组织化学分析

本实验方案描述并优化了一种多重免疫组织化学（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件，并调整抗体与通道的设置，以解决来源于临床肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。...

多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

多重循环免疫组织化学技术能够 原位...

多重循环荧光免疫组织化学

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。...

用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

学习多路荧光免疫组织化学染色技术，用于淋巴瘤组织标本中多种肿瘤相关抗原的定位与定量分析。该方法可实现单张切片上多标志物的共表达评估，帮助研究人员深入理解肿瘤微环境中的空间关系。

淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

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