一项免疫组织病理学研究：描绘巨细胞动脉炎中叶酸受体β巨噬细胞及血管免疫微环境

该免疫组织化学和组织病理学方案可用于检测叶酸受体β，后者是巨细胞动脉炎血管微环境中具有潜在预后和治疗价值的候选蛋白。本方案经过长期验证且被广泛应用，可用于研究颞动脉组织中叶酸受体β的特性，即使组织经过长期储存亦可适用。获取组织切片时，使用切片机对石蜡包埋的颞动脉组织进行切片，厚度为四到五微米，每获得一片即置于40°C水浴中展平，以去除皱褶。

使用玻璃显微镜载玻片，每张载玻片采集三个切片，并将载玻片置于60°C的加热板或烘箱中，加热60分钟。待切片牢固附着于载玻片后，将载玻片放入垂直架中，在37°C下干燥24小时。次日，将载玻片转移至载玻片储存盒中，在4°C下保存至少12小时。

接下来，将切片放入切片架中，使用两轮各五分钟的100%二甲苯浸泡对组织进行水化，并依次进行每种浓度五分钟的梯度乙醇脱蜡处理，每次浸泡期间每30秒振荡10秒。在70%乙醇浸泡后，用双蒸水冲洗切片两次，每次五分钟，每次冲洗期间同样每30秒振荡10秒。进行抗原修复时，将切片架转移至盛有200 µL、95 °C、10 mmol/L柠檬酸缓冲液的玻璃容器中，孵育30分钟。

孵育结束后，将载玻片在室温下冷却20分钟，然后用流水冲洗5分钟。为消除内源性过氧化物酶活性，首先使用疏水性标记笔在每份组织样本周围画圈，随后将样本在200 µL的3%过氧化氢溶液中孵育10分钟，接着每次用200 µL的Tris缓冲盐溶液（TBSS）清洗，共清洗3次。最后一次清洗后，轻轻拍干每张载玻片以去除多余的缓冲液，然后向每张载玻片上加入200 µL感兴趣的初级抗体混合液，并加盖盖玻片，在室温下的湿盒中孵育1小时。

孵育结束后，弃去盖玻片，并用新鲜的TBSS对载玻片进行三次、每次两分钟的洗涤。除去多余的缓冲液后，向每张载玻片上加入200 µL适当的生物素标记二抗溶液，并加盖盖玻片，在室温湿盒中孵育45分钟。弃去盖玻片后，按前述方法用TBSS冲洗载玻片。

去除多余的缓冲液。在室温下，用200微升DAB底物缓冲液对切片进行标记，孵育10分钟。孵育结束后，用TBSS和流动的自来水冲洗载玻片10分钟，然后用苏木精复染3分钟。

然后，向每张载玻片加入 70 µL 适当的封片介质，并缓慢将玻璃盖玻片倾斜覆盖在封片介质上，以避免盖玻片完全盖下时产生气泡。进行组织病理学分析时，将载玻片置于光学显微镜载物台上，观察第一张组织切片的血管结构。随后，定量每张切片中巨噬细胞相对于淋巴细胞的数量。

进行免疫组织化学分析时，观察每张组织切片上叶酸受体β的染色模式，并在每张切片随机选择的10个高倍视野中定量叶酸受体β阳性、CD68阳性及CD3阳性细胞的数量。正常标本的苏木精和伊红染色显示正常的动脉结构：内膜层含有内皮细胞，中膜层含有平滑肌细胞，外膜层则包含异质性的胶原基质，其中有成纤维细胞以及称为滋养血管（vasa vasorum）的小血管。巨细胞动脉炎阳性的颞动脉显示中度至重度炎症，伴有聚集的巨噬细胞（即组织细胞）、淋巴细胞、偶见的浆细胞以及多核巨细胞。

管腔狭窄亦可见，并伴有内膜增厚以及内弹性膜90%的破坏。所有巨细胞动脉炎阳性标本中均可见CD3阳性淋巴细胞和CD68阳性巨噬细胞，所有活检样本的染色模式相似。叶酸受体β的染色仅限于巨噬细胞和多核巨细胞，这些细胞 преимущественно定位于外膜和中膜。

值得注意的是，叶酸受体β约占总巨噬细胞的30%。颞动脉活检样本的处理、切片和脱蜡需要熟练的操作技巧，以确保后续步骤的顺利进行。切片的判读需要由经验丰富的心血管病理学家完成。

提醒观众在处理标本和试剂时采取接触防护和呼吸道防护措施，例如佩戴手套和使用通风罩。