Name: hiv-1 反向转录过程中鼻部单链病毒 dna 分子的 3 -特米尼和序列的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 了解用于HIV-1逆转录研究的深度测序方法，通过杂交捕获和接头连接技术精确绘制新生cDNA的3'-末端。该技术为病毒复制机制研究提供了强大工具。

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作者感谢Malim实验室成员、Luis Apolonia、Jernej Ule和Rebecca Oakey提供的支持。作者感谢伦敦国王学院基因组中心的Matt Arno以及伦敦大学学院（UCL）神经学研究所下一代测序平台的Debbie Hughes在MiSeq测序运行方面提供的帮助。本研究得到了英国医学研究理事会（M.M.，项目编号G1000196和MR/M001199/1）、惠康信托基金（M.M.，项目编号106223/Z/14/Z）、欧洲委员会第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号PIIF-GA-2012-329679（D.P.）以及英国卫生部的资助。 通过 由英国国家卫生研究院研究综合生物医学研究中心授予盖伊医院与圣托马斯国民保健基金会信托，合作方为伦敦国王学院和国王学院医院国民保健基金会信托。

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作者声明无任何利益冲突。

快速、可靠且经济高效的深度测序技术的广泛应用，已彻底改变了生命科学领域的诸多方面，使得基于测序的分析能够达到前所未有的深度。目前仍存在的挑战在于如何创新性地设计并构建具有代表性的测序文库。本文描述了一种用于捕获新生病毒cDNA分子（特别是HIV-1逆转录过程中间产物）的实验方案。
该策略中最关键的步骤是以定量且无偏倚的方式将接头连接至开放的3'-末端。针对两种单链DNA末端之间的连接效率，包括分子间和分子内连接，已针对多种应用进行了研究和优化11,26,27,28,29. 在步骤3.3所述条件下使用发夹接头与T4 DNA连接酶的选择是经验性优化的结果，我们在此过程中评估了不同的连接酶、接头和试剂，用于连接代表HIV-1序列的合成寡核苷酸（表 2）（数据未显示）。在这些 体外 测试反应，我们证实了T4 DNA连接酶介导的发夹接头连接，如Kwok所述 等.11，具有极低的偏差，在接头过量使用时可实现受体分子接近完全的连接。添加核苷酸序列以使接头适用于多重引物系统对接头连接效率无影响（见 图4）。相比之下，我们发现一种耐热的5' DNA/RNA连接酶（&#34;连接酶A&#34;，参见 材料表 与此处比较的精确连接酶相比），它是一种经过改造的RNA连接酶，部分开发目的是为了提高以单链DNA作为受体时的连接效率27，确实在连接两条单链DNA分子方面比RNA连接酶更有效&#34;连接酶 B&#34;）但存在显著偏差，即使在长度仅相差一个碱基的寡核苷酸之间，连接效率也表现出显著差异[表 2；HTP 含 mid G（a）和（b）]。此外，我们发现仅在含有 mid G 的反应中存在极小的偏好性 &#34;连接酶 C&#34; 结合带有随机化5'末端的接头（该策略用于抵消已知的核苷酸偏好性） &#34;连接酶 C&#34;；例如参见 Ding 等.30）。然而， &#34;连接酶 C&#34;介导的分子间连接不完全，因此T4 DNA连接酶系统成为更优的选择。
在整个实验流程中设置多个质量控制步骤，并包含阳性和阴性对照，可在继续进行检测前发现潜在问题，并为故障排查提供指导。步骤 2.2.2 和 2.3.12 中的 qPCR 定量可确保输入材料的量足够。典型的 cDNA 拷贝数在 200 µL 洗脱液（来自步骤 2.1）中每 µL 约为 10,000 至 300,000。杂交捕获步骤可能导致总体 HIV-1 cDNA 量有所损失，但应实现对特异性 HIV-1 cDNA 相对于细胞 DNA 的显著富集；可通过使用适当的引物在富集前后利用 qPCR 定量基因组 DNA，或通过测定总 DNA 浓度来评估富集效果。杂交捕获步骤后回收的 HIV-1 cDNA 应至少达到输入量的 10%。起始材料过少可能解释为何寡核苷酸阳性对照成功（见步骤 3.3.2），但样本中获得的有效测序读段数量有限。总体测序读段数偏低也可能由于存在不含 MiSeq 接头的无关 DNA 物种，导致文库浓度被高估。这将导致簇密度偏低，可通过除荧光定量法测定总 DNA 量外，再使用 qPCR 测定文库中 HIV-1 序列的浓度来改善。由于该方法具有高度敏感性，必须特别注意避免任何低水平污染，包括来自其他样本（特别是高浓度对照寡核苷酸储备液）以及实验室设备的污染。在此方面，在紫外灭菌的 PCR 工作站中操作具有优势。最终文库的自动化凝胶电泳（步骤 6.1.2）是另一项质量控制措施。通常观察到的核酸片段大小范围为 150 至 500 nt。在 PCR 后、纯化前的可选对照中可检测到的引物（见步骤 5.2 注释），此时应已不存在。在代表性结果中，样本强度曲线在 160 至 170 nt 处出现一个峰，在 320 至 350 nt 处出现第二个更尖锐的峰。这可能反映了两种常见高丰度逆转录产物：较短片段（插入长度为 1 至 20 nt）和全长强终止产物（插入长度为 180 至 182 nt）（图 3b）。
尽管本实验方案和所选引物专门针对早期HIV-1逆转录产物，但该方法总体上适用于任何旨在确定DNA开放3'末端的研究。在其他应用场景中，主要需调整的是杂交捕获方法和引物设计策略。例如，若目标改为晚期HIV-1转录本，则建议使用更多种类、沿cDNA全长分布的生物素化寡核苷酸进行捕获，这有望降低杂交捕获步骤中的产物损失。如引言中所述，在设计用于检测3'末端的区域范围时，必须考虑其局限性，以避免多种偏差来源。首先，若连接了接头的模板长度差异较大，PCR反应中可能出现偏差。其次，本研究所使用的测序平台（例如，MiSeq）对插入片段长度具有最佳范围要求，过短或过长的产物可能无法以相同效率被测序。部分问题可通过计算方法加以校正，例如通过计算线性长度偏差的校正因子（见图4，底部图示）。然而，若希望进行3'末端定位的目标区域较长（&#62; 1000 nt），更合理的做法是将连接后的转录本分反应处理，并使用多个上游引物分段检测3'末端。
该分析程序为专门分析HIV-1序列末端紧邻固定接头序列的最后一个核苷酸以及所有碱基的碱基变异以识别任何突变而自行编写。具体步骤如下：首先，使用fastx-0.0.13工具包去除接头序列；然后，去除所有重复序列（即包含条形码在内的完全相同序列）。所有剩余的唯一序列读段随后使用Bowtie（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）比对至HIV-1序列，最大错配数设为三个碱基。模板序列为HIV-1 cDNA（NL4.3株）的前635个核苷酸（nt），包含-sss序列以及从第一链转移产物至多聚嘌呤 tract（U5-R-U3-PPT；见图1）的区域。因此，所提供的软件和模板仅在将该方法用于相同应用（检测HIV-1NL4.3的早期逆转录本）时可直接适用。若用于其他目标序列，则需进行相应调整。每条读段3'末端的位置由其在比对中的位置确定。记录每个位置的碱基判读结果，并根据每个碱基的总覆盖深度计算突变率；由于读段长度不同，且较长的插入片段可能无法被Read2的125个碱基测序完全覆盖，因此各碱基的覆盖深度存在差异。
总之，我们认为所描述的方法是适用于多种研究的有力工具。其显而易见的应用包括通过抗逆转录病毒药物或细胞限制因子来研究逆转录抑制机制。然而，只需进行相对较小的调整，即可将该系统应用于其他单链DNA病毒中间体的3'末端定位分析，例如细小病毒复制过程中存在的中间体。此外，该方法的原理——特别是其优化的连接步骤——可为任何3'端DNA延伸片段的表征提供文库构建设计的核心部分，包括由细胞内双链DNA聚合酶催化的延伸反应。

为了深入剖析并全面理解病毒复制过程，需要采用日益精细的技术来捕获复制中间体。特别是，在感染细胞的背景下精确定义病毒核酸的种类可提供新的见解，因为迄今为止许多病毒复制机制都是在分离条件下进行研究的 体外 反应。一个典型的例子是逆转录病毒（如人类免疫缺陷病毒1型，HIV-1）中的逆转录过程。HIV-1逆转录的各个步骤，即病毒酶逆转录酶（RT）将单链RNA基因组复制为双链DNA的过程，主要通过使用纯化的蛋白质和核酸进行引物延伸实验来研究。1,2,3,4,5尽管已确立了基本原理，但此类检测未包含所有病毒和细胞组分，可能无法反映相关因子在生物学上真实的化学计量关系。因此，我们设计了一种强大的技术，用于确定具有精确cDNA 3'-末端的逆转录中间产物谱即， 确定其在活细胞感染背景下的确切长度和核苷酸序列6时间序列实验数据的收集可用于比较不同条件下转录本的表达模式，例如在存在抗病毒分子或蛋白质的情况下，这些条件可能影响DNA合成与积累的效率和持续性。这有助于更深入地理解病原体的自然生命周期，而该理解往往是靶向药物设计和成功治疗干预的基础。
HIV-1 逆转录包含一系列连续事件，起始于tRNA引物与基因组RNA模板的退火，随后由逆转录酶（RT）延伸，生成一段短的单链cDNA转录本，称为负链强终止（-sss）（见图1）。随后，-sss cDNA从基因组RNA的5'-长末端重复序列（LTR）转移至3'-LTR，在此处退火并作为引物，启动RT介导的负链DNA的持续延伸（参见关于逆转录的综述1,2,3,4）。这一第一次链转移是逆转录过程中的限速步骤之一，因此已知-sss cDNA会积累。在感染细胞中捕获逆转录产物的基本工作流程和文库设计如图2a所示。本方案中使用的特异性引物和分析设置（列于表1）可靶向长度范围在23至约650 nt之间的所有早期逆转录cDNA中间体，其中包括180–182 nt的-sss DNA。然而，对该策略进行适当的小幅调整后，也可应用于晚期逆转录产物，以及其他需要检测含有3'-OH末端的DNA的病毒和系统。需注意的重要限制因素包括文库中最终PCR产物的长度范围；特别是，当开放的3'-末端上的接头与上游引物结合位点之间的距离超过约1000 nt时，其测序效率可能较低，可能在文库构建过程中引入误导性的技术偏差（详见讨论部分中的详细说明及调整建议）。
先前报道的用于系统确定核酸链3'末端的技术主要集中在RNA分子，而非DNA分子。一个例子是3' RACE（cDNA末端的快速扩增）7，该方法依赖于mRNA的多聚腺苷酸化。此外，还开发了基于接头连接的策略，使用RNA连接酶，包括RLM-RACE（RNA连接酶介导的RACE）8和LACE（基于连接的cDNA末端扩增）9。需要强调的是，基于连接的扩增方法对接头连接反应本身引入的任何偏倚都非常敏感。例如，连接效率可能因3'端特定核苷酸、序列、分子总长度或局部结构的不同而有所差异。此类连接酶偏好性会导致分子捕获不完全，并在检测结果中产生偏差，这一点已被我们及其他研究者观察到9,10。为了在本方案所述的接头添加步骤中最大限度地减少连接偏倚，我们测试了多种连接策略，结果发现只有使用T4 DNA连接酶与发夹结构的单链DNA接头（如Kwok et al.11所述）的方法能够实现接近定量的连接效率，并且在使用一组特选的对照寡核苷酸进行评估时，未出现显著的连接效率差异6。因此，选择该连接策略是本方案成功的关键特征之一。
迄今为止，在感染细胞中对HIV-1逆转录酶（RT）进程的监测主要通过定量PCR（qPCR）实现，该方法使用特异性引物-探针组合，检测不同长度的逆转录产物，从而分别定量较短或较长的cDNA产物（分别代表早期和晚期逆转录产物）12,13,14。尽管该qPCR方法适用于评估逆转录过程在细胞系统中的内在效率，但其结果分辨率相对较低，且无法获得序列信息。我们提出的新方法基于优化的接头连接、PCR介导的文库构建以及深度测序，填补了这一技术空白，能够以单核苷酸分辨率对HIV-1感染过程中的逆转录进行定量监测。
我们已在一项研究中展示了该方法的实用性，该研究区分了两种关于HIV-1限制因子APOBEC3G（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G）干扰病毒逆转录产物生成能力的假说模型6。

<table><tbody><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>吉布科</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>吉布科</td><td>15150-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>吉布科</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell Vios 250i CO₂ 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51030966</td><td></td></tr><tr><td>层流罩 - CAS BioMAT2</td><td>Wolflabs</td><td>CAS001-C2R-1800</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&amp;trade; Express (1x)，稳定型胰蛋白酶替代酶</td><td>吉布科</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM&amp;reg;（最低必需培养基）</td><td>吉布科</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 感染性分子克隆（pNL4-3）</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目</td><td>114</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）- 分子量：25000</td><td>PolySciences 公司</td><td>23966-2</td><td>溶解至 1 mg/mL 并调节 pH 至 7</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-free DNase</td><td>普洛麦格</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Triple Red 有限公司</td><td>FPE404025</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>康宁</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1x）</td><td>吉布科</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Sorval</td><td>WX Ultra 系列</td><td>Th-641 转子</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 抗原 ELISA 试剂盒</td><td>珀金埃尔默</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS 细胞</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目</td><td>776</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基</td><td>吉布科</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>CoStar&amp;reg; 细胞培养处理多孔板</td><td>康宁</td><td>CLS3513-50EA</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机：Heraus&amp;trade; Multifuge&amp;trade; X3 FR</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004536</td><td></td></tr><tr><td>TX-1000 摆动桶转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75003017</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机：5424R</td><td>艾本德</td><td>5404000060</td><td></td></tr><tr><td>总 DNA 提取试剂盒（DNeasy 血液与组织试剂盒）</td><td>凯杰</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶 H₂O</td><td>安比昂</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart 缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室（DpnI 酶配套组分）</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 限制性内切酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 引物寡核苷酸</td><td>MWG Eurofins</td><td>N/A</td><td>HPSF 纯化</td></tr><tr><td>TaqMan PCR 通用预混液</td><td>赛默飞</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Eppendorf&amp;reg; 管</td><td>艾本德</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&amp;trade; 气溶胶过滤吸头，1000 &amp;mu;L</td><td>费希尔科技</td><td>TF-000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&amp;trade; 气溶胶过滤吸头，200 &amp;mu;L</td><td>费希尔科技</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&amp;trade; 气溶胶过滤吸头，20 &amp;mu;L</td><td>费希尔科技</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&amp;trade; 气溶胶过滤吸头，10 &amp;mu;L</td><td>费希尔科技</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 清洁工作台</td><td>LabCaire</td><td>型号 PCR-62</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;2 磁力架</td><td>赛默飞</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性微球（Streptavidin MagneSphere&amp;reg;）</td><td>普洛麦格</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>37582</td><td></td></tr><tr><td>滚轴混合仪，Revolver&amp;trade; 360&amp;deg;</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>费希尔科技</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>西格玛</td><td>H1758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物</td><td>Electran（VWR）</td><td>443885J</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>西格玛</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Block&amp;reg; 模拟加热块</td><td>Techne</td><td>UY-36620-13</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管及拱形盖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB0266</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>艾本德</td><td>Mastercycler&amp;reg; 系列</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>40% 聚乙二醇溶液（PEG）溶于 H₂O，分子量：8000</td><td>西格玛</td><td>P1458-25ML</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱溶液，5 M</td><td>西格玛</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液 II（含甲酰胺缓冲液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>预制 6% TBE 尿素凝胶</td><td>英潍捷基</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Mini 细胞电泳系统</td><td>英潍捷基，Novex</td><td>XCell SureLock&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA 溶液（10x）</td><td>费希尔科技</td><td>10031223</td><td></td></tr><tr><td>21 G × 1 1/2 针头</td><td>VWR</td><td>613-2022</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸染料（10000x）</td><td>生命科技</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader DR46B 凝胶成像仪</td><td>费希尔科技</td><td>NC9800797</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>默克</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>SDS 溶液 20%（w/v）</td><td>伯乐</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>离心管滤器</td><td>Appleton Woods</td><td>BC591</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维滤膜 GF/D，10 mm</td><td>Whatman（VWR）</td><td>512-0427</td><td></td></tr><tr><td>多聚腺苷酸（polyA）RNA</td><td>西格玛</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>糖原，分子生物学级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（2-丙醇）</td><td>费希尔科技</td><td>15809665</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，分子生物学级</td><td>费希尔科技</td><td>10041814</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime&amp;trade; Supermix I（DNA 聚合酶预混液）</td><td>生命科技</td><td>12342-010</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&amp;reg; Illumina 多重引物（Index Primer Set 1 和 2）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E7335S；E7500S</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation D1000 Screentape 高灵敏度</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation D1000 试剂</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>2200 Tapestation — 自动化凝胶电泳系统</td><td>安捷伦科技</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;reg; AMPure&amp;reg; XP 磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;trade; dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>英潍捷基</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;trade; 2.0 荧光计</td><td>英潍捷基</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Topo&amp;trade; TA 克隆试剂盒</td><td>英潍捷基</td><td>450071</td><td></td></tr><tr><td>测序平台：MiSeq 系统</td><td>因美纳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验管理器（样本表软件）</td><td>因美纳</td><td>注：使用 TruSeq LT 作为模板</td><td></td></tr><tr><td>Miseq&amp;trade; 试剂盒 V3（150 个循环）</td><td>因美纳</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>测序中心：BaseSpace</td><td>因美纳</td><td>https://basespace.illumina.com</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;连接酶 A：耐热 5&amp;rsquo; App DNA/RNA 连接酶&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;NEB&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;M0319S&lt;/em&gt;</td><td>本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;连接酶 B：T4 RNA 连接酶 1&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;NEB&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;M0204&lt;/em&gt;</td><td>本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;连接酶 C：CircLigase&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;Epicentre&lt;/em&gt;</td><td>&lt;em&gt;CL4111K&lt;/em&gt;</td><td>本实验方案未使用，但在优化过程中进行了测试，结果在讨论部分中描述。</td></tr></tbody></table>

确定感染细胞中hiv-1逆转录过程中新生单链病毒dna的3'-末端及其序列

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

在病毒复制过程中监测核酸中间产物，可深入了解抗病毒化合物及宿主细胞蛋白对病毒DNA合成的影响及其作用机制。本文针对现有技术在基于细胞、高覆盖度和高分辨率方面检测逆转录病毒逆转录中间产物的不足，提出一种能够在病毒感染的生理环境下精确定义此类中间产物的检测方法。该方法可在单核苷酸分辨率水平捕获HIV-1感染细胞中新生成的互补DNA（cDNA）分子的3'-末端。本实验方案包括全细胞DNA的提取、病毒DNA的靶向富集 通过 杂交捕获、接头连接、凝胶纯化进行片段大小分选、PCR扩增、深度测序及数据分析。其中关键步骤是对接头分子与开放的3'-DNA末端进行高效且无偏倚的连接。本方法可用于确定给定样本中每种特定长度的逆转录产物的丰度，同时提供有关逆转录产物内部序列变异的信息，从而揭示潜在的突变。总体而言，只要模板序列已知，该检测方法适用于任何与DNA 3'-延伸相关的问题研究。

本文所述技术已应用于一项更广泛的研究，旨在探讨抗逆转录病毒人源蛋白 APOBEC3G (A3G) 抑制 HIV-1 逆转录的机制6。图 3 展示了在感染了 vif 缺陷型 HIV-1 的 CEM-SS T 细胞样本中，应用该方案于存在或不存在 A3G 条件下获得的代表性结果。图 3a 绘制了每个样本在过滤掉所有具有相同 6 nt 条形码和相同长度的 PCR 重复序列（由提供的分析软件执行）后获得的总唯一读数。A3G 水平的增加降低了总读数，这反映了 A3G 对逆转录酶介导的 cDNA 合成的抑制作用，此前已通过 qPCR 进行描述和测量6,13,21,22。在图 3b 中，显示了前 182 个核苷酸内每个可能长度的分子比例。对于不存在 A3G 的 HIV-1 感染，最丰富的物种是主要的 180 核苷酸强终止分子本身，同时在较短长度范围（23 至 40 核苷酸）内也有部分读数积累（上图，蓝色直方图）。添加 A3G 改变了这一分布，检测到在少数几个非常特异且可重复的位置上，较短的截短 cDNA 分子急剧增加（中图和下图）。由于 A3G 是一种胞苷脱氨酶，当 A3G 存在于感染性病毒颗粒中时，cDNA 中会发生胞嘧啶向尿嘧啶（识别为 C 到 T）的突变21,23,24。利用获得的测序信息，将 C 到 T 突变的百分比绘制在同一图表上（红色虚线）。需要注意的是，突变谱图来源于所有唯一读数的合并，每个核苷酸的覆盖度会有所不同。然而，如果需要，可以将序列信息关联回每个分子，并与特定的 3' 末端相关联。所提供的数据取自 Pollpeter et al.6，并且已证明突变谱图与 cDNA 长度谱图之间的相关性是由于细胞 DNA 修复机制对脱氨基 cDNA 的检测和切割所致。
通过处理一组已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸混合物，可轻松制备3'-末端作图方法的阳性对照。该对照在步骤3.3.2的接头连接阶段加入，建议将其包含在所有多重文库中。来自对照样本的数据应显示所有寡核苷酸均处于预期的输入比例，且背景读数极低。图4展示了由17条化学合成的寡核苷酸组成的阳性对照结果（序列见表2），这些寡核苷酸以等摩尔比例混合。如预期所示，所有分子的丰度接近相等，仅有微小差异（上图）。在-sss DNA序列中大多数未被寡核苷酸覆盖的位置读数为零，但我们观察到少量比实际对照寡核苷酸短1或2个核苷酸的次要产物。我们尚未深入研究这些次要产物，但推测其可能代表购入的寡核苷酸储备液中存在的降解或不完全合成产物（寡核苷酸订购时为HPLC纯化级别，供应商标明纯度&gt; 80%）。下图显示了另一轮文库测序中的对照样本结果，其中17条寡核苷酸之间的变异略大，并与整体长度相关，即较长的对照分子检测效率高于较短分子。这可能是由于PCR扩增或MiSeq测序过程中簇生成存在轻微偏好性所致，后者具有最佳插入片段大小范围，当文库插入片段长度分布较宽时可能更为明显。一种基本的校正方法是应用基于斜率的归一化因子，该斜率反映与分子长度相关的偏差趋势（粉红色线）。相关计算已包含在分析程序中（见实验方案第8.3步）。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg" /> 
图 1:&#160;HIV-1 逆转录起始步骤示意图。 该过程始于tRNA(Lys,3)（橙色）与病毒基因组RNA（gRNA）中的引物结合位点（PBS）退火（步骤1），从而启动并延伸病毒cDNA（蓝色，步骤2）。&#160;与此同时，逆转录酶（RT）的RNaseH活性降解模板RNA（步骤3）。逆转录过程中的第一个完整中间产物是负链强终止（(-)sss）cDNA，当RT催化的聚合反应到达gRNA重复（R）区域的5'末端时，该中间产物即形成（步骤3）。(-)sss中间产物通过其互补序列与基因组RNA模板3'端的长末端重复序列（LTR）R区退火，转移至模板的3'末端，随后继续进行DNA聚合（步骤4）。在本方法中，通过测定新生病毒cDNA（蓝色）的精确长度来确定逆转录的进程。PPT，多聚嘌呤序列；U5，5'独特序列；U3，3'独特序列。本图转载自先前发表的研究6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg" /> 
图2：接头连接与PCR扩增策略的工作流程概要及示意图。 (a) 用于确定感染细胞中HIV-1逆转录本3'-末端的所述技术的主要步骤流程图。该图改编自先前发表的文献6(b) 衔接子连接与PCR扩增策略示意图。在先前步骤中已纯化的、长度各异的新生cDNA分子，使用T4 DNA连接酶连接至一条单链DNA衔接子。该发夹形衔接子（命名为 &#34;全基因组测序 + MiSeq&#34;，参见 表1设计灵感来源于Kwok 等.11接头携带一个随机的6 nt条形码序列，可通过碱基配对促进连接反应，同时作为唯一读段的标识符。接头的3'末端带有Spacer（SpC3），以防止自连。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将连接产物与过量接头分离。将凝胶中的核酸染色后，在接头上方至加样孔区域等分为三个大小相同的凝胶片段切下，操作方式同前25洗脱、沉淀并重悬后，使用与接头已知序列互补的引物（引物1，多重寡核苷酸试剂盒，参见 材料清单以及一个携带tRNA后紧接的HIV-1 5'-LTR序列前22个核苷酸的引物（引物2，MP1.0 + 22HIV）。所选引物的5'端包含适用于所选测序平台的接头序列（P5和P7），以及用于区分同一文库中不同样本的索引序列。图中指示了测序读段引物的起始位置。蓝色框表示用于确定被捕获分子原始3'末端的目标区域。该图改编自先前发表的研究6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg" /> 
图 3：代表性结果。 (a) 使用所述方案处理的代表性样本的总读数计数。这包括所有被鉴定为 HIV-1 分子独特读数的序列，其 3' 末端位于负链 cDNA 的前 635 个核苷酸内（直至 PPT，参见图 1）。感染不携带 A3G 的 HIV-1 可获得最高的读数数量，而 A3G 会抑制 cDNA 合成，从而降低总读数计数。未感染的细胞作为阴性对照，而一组合成寡核苷酸则作为阳性对照。b) 蓝色直方图显示了 HIV-1NL4.3 序列（x 轴）第 23 至 182 个核苷酸位置之间（全长 -sss cDNA 为 180 至 182 个核苷酸）每种长度 cDNA 的相对丰度（比例尺位于左侧 y 轴）。cDNA 的相对丰度计算为在 -sss cDNA 序列特定核苷酸处终止的序列绝对数量除以所有长度小于或等于 182 个核苷酸的读数总和。红色虚线显示的是在相应位置携带 C 到 T/U 突变的读数百分比（比例尺位于右侧 y-轴）。图 3b 转载自先前发表的一篇文献6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的更大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg" /> 
图4：对照样品的代表性结果。 图中显示了两个包含等摩尔量的17种不同长度合成寡核苷酸混合物的分析谱图。这些寡核苷酸的序列来源于HIV-1NL4.3 ，设计时覆盖了多种长度，并确保3'-端核苷酸包含全部4种碱基（见表2）。上方图谱显示的是来自图3a的阳性对照样品结果，未检测到对分子长度或开放3'-末端的显著偏好性。下方图谱显示的是另一次文库测序运行的结果，该次运行在测序中产生了轻微的长度偏好性。在此情况下，建议应用一个归一化校正因子，该因子来源于代表片段大小偏倚的斜率（以粉红色标示）。本图改编自先前发表的研究6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">引物名称</td>
			<td>长度（nt）</td>
			<td colspan="12">序列</td>
			<td colspan="2">用途</td>
			<td colspan="2">制造商（纯化方式）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">full Kwok + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5’-PHO-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3’</td>
			<td colspan="2">接头</td>
			<td colspan="2">IDT DNA technologies (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2xBiotin SS bait</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5’-biotin-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-biotin-3’</td>
			<td colspan="2">杂交捕获</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Biotin 1-16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5’-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3’</td>
			<td colspan="2">杂交捕获</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Biotin tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5’-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3’</td>
			<td colspan="2">杂交捕获</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3’</td>
			<td colspan="2">PCR 扩增</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中使用的寡核苷酸，包括其长度、序列及修饰方式。该表格改编自先前发表的研究6。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表格的&#160;Excel文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">引物名称</td>
			<td>长度（nt）</td>
			<td colspan="12">序列</td>
			<td colspan="2">制造商（纯化方式）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con long C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con long G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con long T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con long A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con mid C</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con mid G (a)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con mid G (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con mid A&#160;</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con mid T</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con short A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con short T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con short G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP con short C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP Con 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5’-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HTP Con 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5’-ctgctagagattttccacactg&#160;actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3’</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用作阳性对照样本的17种合成对照寡核苷酸列表。 前13种寡核苷酸根据其长度[长片段（116至120 nt）、中片段（69至85 nt）、短片段（33至41 nt）]及其3'-末端进行选择。本表改编自先前的出版物6。&#160;&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">请点击此处以下载该表格的&#160;excel文件。</a>

本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。

确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

在病毒复制过程中监测核酸中间产物可深入了解抗病毒化合物的作用效果及其作用机制。

这种用于分析逆转录的新方法可以让我们深入了解逆转录病毒学领域。例如，我们可以了解细胞限制因子发挥作用的具体机制，或抗逆转录病毒药物如何抑制 HIV-1 DNA 合成。该技术的主要优势在于，它不仅能提供新生逆转录产物序列的信息，还能以单核苷酸分辨率精确定位其 3' 端 DNA 末端的位置。通过杂交捕获法从 HIV1 感染细胞的总 DNA 中富集 HIV1 互补 DNA，该操作应在 PCR 工作站中进行。通过移液将每份样本 100 µL 磁性链霉亲和素珠加入同一个微量离心管中，配制磁珠主混合液，并将该管置于适用于微量离心管的磁力架上。待磁珠向管壁的磁铁一侧沉降后，吸除储存缓冲液，将管子从磁力架上取下，并用 500 µL 结合洗涤缓冲液（Bind/Wash buffer，简称 BW 缓冲液）重悬磁珠。将离心管放回磁力架上，等待磁珠迁移至管壁一侧后，吸除上清液。从磁力架上取下离心管，加入500 µL的酪蛋白溶液，重新悬浮磁珠，并在室温下孵育10分钟。孵育10分钟后，用BW缓冲液洗涤磁珠。将离心管放回磁力架上，移除上清液，并将磁珠重悬于500 µL BW缓冲液中。每个样本加入50皮摩尔的捕获型生物素化寡核苷酸。在室温下于翻转混匀仪中孵育30分钟。接下来，将离心管放回磁力架上，弃去上清液，从磁力架上取下离心管，加入500 µL的1× TEN缓冲液，重悬磁珠。第二次洗涤后，每份样品用10 µL的1× TEN缓冲液重悬带有固定化寡核苷酸的磁珠。每份样品标记一个微量离心管，加入10 µL磁珠悬液、170 µL DNA和90 µL 3× TEN缓冲液。在92°C的干式加热块中孵育2分钟，以使DNA变性。将试管转移至另一设定为52°C的干式加热块中，孵育1小时。在此孵育期间，每10分钟颠倒试管一次，以混匀内容物。当一小时的孵育完成后，用500 µL的1× ten缓冲液洗涤磁珠一次，并将磁珠重悬于35 µL无核酸酶的水中。在去除任何液体前，将离心管置于磁力架上约三分钟，确保磁珠充分沉降。为洗脱，将离心管置于92 °C的干式加热块中孵育两分钟。然后，依次将离心管迅速转移至磁力架上。待磁珠吸附至管壁一侧后，将含有HIV1 DNA的上清液转移至新的离心管中。开始此操作前，用无核酸酶的水将冻干的接头重新溶解至100 µM浓度，并涡旋振荡混匀。每个样本外加一个对照样本，加入0.45 µL的10x T4 DNA连接酶缓冲液、4 µL接头和0.05 µL无核酸酶水。在92°C加热2分钟，然后在PCR仪中缓慢冷却至16°C。此过程可使接头形成发夹结构。该实验步骤的关键在于将适配子分子高效且无偏倚地连接至开放的3'端DNA末端。使用T4 DNA连接酶，将不同长度的纯化新生cDNA分子连接至发夹结构的单链DNA接头。该接头包含一段随机的六核苷酸条形码序列，既可配对促进连接反应，又可作为唯一读段的识别标识。3'末端接头带有间隔序列，以防止自连。为配制终体积为60微升的连接反应体系，向每个PCR管中加入以下组分：6微升10×T4 DNA连接酶缓冲液、24微升40% PEG、6微升5摩尔甜菜碱、4.5微升接头、1.2微升T4 DNA连接酶以及18.3微升DNA。充分混匀反应体系后，在PCR仪中于16摄氏度孵育过夜。连接接头后的第二天，向每个连接反应体系中加入含有DNA上样缓冲液的三十微升甲酰胺，用移液器吹打混匀。在PCR仪中94°C加热两分钟，然后立即置于冰上。下一步是准备进行变性凝胶电泳。将一块预先制备的6% TBE变性尿素聚丙烯酰胺凝胶放入合适的凝胶电泳槽中，并加入1× TBE电泳缓冲液。预电泳20分钟。随后，使用注射器和21号针头用运行缓冲液冲洗凝胶加样孔。然后将同一份样品每孔加入30 µL，分别加入三个孔中。建议每个凝胶只跑一份样品，以避免交叉污染。电泳20分钟。在凝胶电泳进行的同时，为每个样品准备三个0.5毫升的微量离心管，使用21号注射器针头在管底刺孔。将每个处理好的小管插入2毫升的微量离心管中，并标记样品名称及“低”、“中”或“高”。当深蓝色染料前沿迁移至凝胶中部时，停止电泳并取出凝胶盒。打开胶盒，用剃刀将凝胶垂直切割，完整切下包含三个加样孔的胶条。将胶条放入含有1× TBE缓冲液和5 µL氰化物核酸染料的容器中，孵育3至5分钟。确保染色充分，以便于清晰识别出稍后需要切除的游离接头的顶端。接下来，使用去离子蒸馏水彻底清洁蓝光透射仪的表面。然后将凝胶条从染色容器中取出，放置在透光板上。打开光源盒，通过橙色滤光片观察染色的核酸。此处显示的是染色凝胶上具有代表性的连接DNA样品。接头通常过载，呈大团状，而连接的HIV1 DNA则在其上方呈条带状迁移。红色线条指示了切割凝胶的位置，以去除游离的接头，并将样品均分为三个部分。使用新的剃刀刀片，如果凝胶边缘存在未加样区域，则将其侧边切除。接着，在接头稍上方进行切割，以去除接头及下方的凝胶部分。最后，切去凝胶最顶端部分，包括约一毫米的加样孔区域，该区域通常含有较高分子量 DNA 的强而尖锐的信号。将剩余含有样品的凝胶部分水平均分为三段：低、中、高分子量区域。然后，将三个凝胶片段各自切成 2 × 2 毫米大小的碎块，并转移至已准备好的 0.5 毫升微量离心管中。开盖以最高速度离心 1 分钟。通过小孔将凝胶碎块挤入 2 毫升离心管中，以制成凝胶浆状物。如果零点五毫升离心管底部仍有凝胶颗粒残留，可用针头将其手动转移至二毫升离心管中。在每个微量离心管的凝胶碎片中加入一毫升尿素凝胶提取缓冲液，开始DNA提取步骤。将离心管置于室温下，使用翻转混匀仪旋转混匀，至少三小时。准备滤膜柱。使用一套洁净的镊子，将一个小型圆形玻璃纤维滤膜加入每个带有醋酸纤维素膜滤器的离心柱中，以防止膜堵塞。用倒置的移液管头将滤膜放置到位。将含有凝胶碎片和提取缓冲液的2毫升离心管在微量离心机中短暂离心，然后将700 µL上清液转移至已准备好的过滤柱中。将过滤柱在微量离心机中以最高速度离心1分钟。随后，将滤过液转移至新的2毫升微量离心管中。用剩余的上清液重新加载层析柱。尽量从提取物浆液中获取尽可能多的液体，即使包含凝胶碎片也无需担心。再次离心。合并相同提取样品的穿流部分，并按照文中的实验方案进行后续操作。该方案应用于在有或无抗逆转录病毒人源蛋白 A3G 的情况下，感染了 Vif 缺陷型 HIV-1 的 CEMS-ST 细胞样品。各样品获得的唯一序列读长总数的图示表明，A3G 水平的升高会减少总读长数量。反映了A3G对逆转录酶介导的cDNA合成的抑制作用。在接下来的三个图中，前182个核苷酸内每个可能长度的分子所占比例以蓝色直方图显示。加入A3G后，在少数几个特定且可重复的位置，较短的截短cDNA分子显著增加。虚线红线显示了在相应位置携带 C 到 T 突变的读段所占的百分比。可通过处理一组已知序列、长度和浓度的合成寡核苷酸混合物来生成阳性对照。所有分子的丰度应接近相等，仅有微小差异。如果文库测序运行在测序过程中产生轻微的长度偏差，建议应用一个由代表大小偏差斜率推导出的标准化因子。该方法可轻松适用于其他系统，在这些系统中，确定DNA分子的3'末端将有助于深入了解核酸代谢相关领域。请务必注意，操作HIV可能具有极高危险性，某些实验只能在指定的安全实验室中进行。

determining-3-termini-sequences-nascent-single-stranded-viral-dna

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

hiv-1 反向转录过程中鼻部单链病毒 dna 分子的 3 '-特米尼和序列的测定

HIV嗜性可根据病毒包膜的V3区推断。使用巢式RT-PCR对V3区进行三重PCR扩增，随后进行测序，并利用生物信息学软件进行分析。若样本中存在一个或多个序列的g2P评分较低，则被归类为非R5病毒。...

基于V3区群体测序进行HIV-1嗜性基因型推断

对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1...

对标准临床检测方法无法检出病毒载量的HIV感染者进行HIV-1 RNA的扩增与定量

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

逆转录酶活性作为类病毒颗粒产生的标志物

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

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测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

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利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

了解用于HIV-1逆转录研究的深度测序方法，通过杂交捕获和接头连接技术精确绘制新生cDNA的3'-末端。该技术为病毒复制机制研究提供了强大工具。

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