hiv-1 反向转录过程中鼻部单链病毒 dna 分子的 3 '-特米尼和序列的测定

这种分析逆转录的新方法可以告诉我们关于逆转录病毒学领域的新事物。例如，我们可以了解细胞限制因子如何起作用的细节，或者抗逆转录病毒药物如何抑制HIV1 DNA合成。这项技术的主要优点是，不仅提供了有关纳纳宁反向Tran Scrips序列的信息，而且它允许以单核紧密分辨率绘制其精确的3个主DNA术语。

HIV1免费DNA的扩充来自HIV1感染细胞的DNA批发，通过混合捕获完成，应在PCR工作站中进行。准备磁链球菌珠的主混合，通过管道将每个样品的一百微升珠头放入单个微型离心管中，将管放在适用于微型离心管的磁铁上。磁珠朝管的磁侧安顿下来后，取出存储缓冲液，从磁铁上取出管子，并在五百微升的压箱洗涤或 BW 缓冲液中重新悬浮珠子。

将管子放回磁铁上，等待磁珠迁移到磁铁，然后取出上一液。从磁铁上取下管子，加入五百微升的卡明溶液，重新悬浮珠子，并在室温下孵育十分钟。十分钟后，用BW缓冲液清洗珠子。

将管子放回磁铁上，取出上流液，在五百微升的BW缓冲液中重新悬浮珠子。每个样品添加每个捕获的生物基化寡核苷酸的五十个皮莫。在室温下孵育，同时在结束搅拌机上摇摆30分钟。

接下来，将管子返回磁铁，取出上流板，从磁铁上取下管子，加入五百微升的1倍十缓冲液，然后重新悬浮珠子。第二次洗涤后，用固定化的寡核苷酸将珠子重新悬浮在十微升中，每个样品1倍10缓冲液。对于每个样品，标签一个微分管，并添加10微升珠悬浮液，170微升DNA，和90微升3x1缓冲液。

在92摄氏度的干热块中孵育两分钟，以解育DNA。将管子移动到不同的干热块，该热块设置为 52 摄氏度，并孵育一小时。在此孵育期间，每十分钟一次，反转管子进行混合。

一小时的孵育完成后，用五百微升的十倍缓冲液洗一次珠子，再悬浮在三十五微升的核酸酶自由水中。在取出任何液体之前，将管子留在磁铁上约三分钟后，确保磁珠沉淀良好。为了在干燥的热块中孵育管子，在92摄氏度下孵育两分钟。

然后，快速将管子移动到磁铁上，一次一个管子。一旦珠子被绑定到管的一侧，将含有HIV1DNA的上一液转移到一个新鲜的管子上。要开始此过程，请将冻干适配器重新悬浮在无核酸酶无素水中的一百微摩尔，并旋转管。

每个样本，加上一个控制样本，结合零点四五微升的10x T4 DNA连结酶缓冲液，四个微升适配器，和点零五微升的核酸酶自由水。加热到92摄氏度两分钟，然后在PCR机中慢慢冷却到16摄氏度。这将允许适配器形成发针结构。

这个过程的关键步骤是有效和公正的结合适应分子打开3总理DNA基尼。不同长度的纯化新生cDNA分子使用T4 DNA连体与发夹单绞合DNA适配器连接。适配器具有随机的六核苷酸条形码序列，允许解析以方便结扎，同时用作唯一读取的标识符。

3 至 10 月 1 日适配器携带一个空间，以防止自结扎。要建立60微升最终体积结扎反应，在每个PCR管中加入以下:6微升10x T4 DNA连接酶缓冲液，24微升40%PEG，6微升5摩尔贝塔，4点5微升适配器，1点2微升T4DNA连接酶，18点DNA微升。混合反应后，在PCR机中孵育，温度为16摄氏度。

在适配器结扎后的第二天，在三十微升的甲酰胺含有DNA凝胶加载缓冲液到每个结扎反应和混合良好的管道标题。在94摄氏度的PCR机中加热两分钟，然后立即加冰。下一步是准备变性凝胶电泳。

将预铸6%TBE变性尿素聚丙烯酰胺凝胶放在适当的凝胶罐中，并加入1xTBE运行缓冲液。预运行凝胶二十分钟。接下来，使用注射器和二十一针，用运行缓冲液洗净凝胶口袋。

然后将同一样品的井中每个孔的三十微升装入三口井中。建议每个凝胶只运行一个样品，以避免交叉污染。跑二十分钟。

当凝胶运行时，使用21个量表注射器针将孔戳到底部，每个样品准备三个零点五毫升微离心管。将每个准备好的管子插入两毫升微型离心管中，并贴上样品名称加低、中或高标签。当深蓝色染料正面大约在凝胶的一半，停止电泳并取出凝胶盒。

撬开盒式磁带，用剃刀垂直切割凝胶。慷慨地用三口装有的样品来切除带子。将凝胶条加入一个容器中，加入1x TBE和5微升氰酸染色的容器，孵育3至5分钟。

确保染色足够，以便轻松识别稍后要移除的免费适配器的顶部。接下来，用蒸馏的去电离水彻底清洁蓝光转光器的表面。然后从染色容器中拿出凝胶片，放在灯箱上。

打开灯箱，通过橙色过滤器检查染色的核酸。此处显示了染色凝胶上具有代表性的连结DNA样本。适配器通常显示为过载，并运行作为一个大斑点与连接的HIV1 DNA运行以上作为条纹。

红线表示凝胶要切割的位点，以去除自由适配器，并将样品分成三个均匀的部分。使用新的剃须刀刀片，如果仍有未加载样品的区域，则切开凝胶的两侧。接下来，在适配器的上方切割以去除适配器和下部凝胶部件。

最后，切开凝胶的顶部，包括大约一毫米的凝胶口袋，通常有一个尖锐的强烈信号，更高的分子量DNA。将剩余的含有样品的凝胶片水平分成三个均匀的块。低、中、高分子量区域。

然后，将三个凝胶片段各切成两片两毫米，然后将它们转移到准备好的零点五毫升微离心管中。以最高速度旋转，打开盖子一分钟。将凝胶片通过孔挤压到两毫升管中，以形成凝胶泥浆。

如果任何凝胶颗粒仍留在零点五毫升管的底部，请用针头手动将它们转移到两毫升管中。在每个微离心管中的凝胶泥浆中加入一毫升尿素凝胶萃取缓冲液，开始DNA提取过程。在室温下用端在端混合器端旋转管至少三个小时。

准备筛选器列。使用一套干净的钳子，将一个小的圆形玻璃纤维过滤器添加到每个离心柱中，使用醋酸纤维素膜过滤器，防止膜堵塞。将过滤器与倒置的管头尖端放在一起。

在微离心中用凝胶泥浆和萃取缓冲液短暂旋转两个毫升管，然后将七百微升的上清液转移到准备好的过滤柱上。以最高速度将滤芯柱以最高速度离心一分钟。然后将流量转移到新的两毫升微离心管。

用剩余的上线重新加载列。尽量从萃取泥浆中获取尽可能多的液体，如果含有凝胶片，不要担心。再次旋转。

合并流通过相同的提取样本，然后按照文本协议中所述继续。在缺乏抗逆转录病毒人类蛋白A3G的情况下，从感染Vif缺乏HIV-1的CEMS-ST细胞的样本中采用了此种协议。从每个样本获得的唯一读取总数图表明，A3G 水平的增加减少了总读取数。

反映A3G对逆转录酶的抑制作用中化cdna合成。在这接下来的三个图中，前一百八十二个核苷酸中每个可能长度的分子的分数以蓝色直方图显示。添加 A3G 的成本在一些非常特定的可重复位置的较短截断的 cdna 分子的显著增加。

虚线红线，显示在相应位置携带 C 到 T 突变的读取百分比。通过处理一组具有知道序列、长度和浓度的合成寡核苷酸，可以产生正对。所有分子应以接近相等的丰度出现，只有很小的变化。

如果库运行产生次要长度偏差，在排序中，建议应用从表示大小偏置的斜率派生的规范化因子。这个过程可以很容易地适应其他系统，其中确定DNA分子的三个主要端点将增加对核酸代谢的有一些关键见解。请不要忘记，使用艾滋病毒可能是极其危险的，有些感染只应在指定的安全实验室进行。