低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

因此，该方法有助于解答巨噬细胞生物学领域的关键问题，例如如何在蛋白质水平上表征不同环境下巨噬细胞的活化状态。该技术的主要优势在于，它能够利用无标记定量方法，获得人巨噬细胞中多种蛋白质的差异表达情况。本次实验操作将由我实验室的Marie Malier和Magali Court进行演示。

首先，将15毫升密度梯度细胞分离液加入两个50毫升离心管中，使溶液在接收LRSC前升至室温。这一点至关重要，因为密度受温度影响。将LRSC倒入一个50毫升离心管中。

加入1×PBS至50毫升并混匀。然后，非常缓慢地将25毫升混合液加至15毫升已平衡的密度梯度溶液上方。此步骤中注意避免混合两相。

必须将血液加入密度梯度溶液中，且不能扰动该相。将两根离心管在700 G条件下离心25分钟，不得中断。密度梯度离心结束后，从底部到顶部的各层依次为红细胞和粒细胞（形成沉淀）、密度梯度溶液相、单个核细胞层以及稀释的血浆。

用移液器穿过血浆层，但不要吸取血浆。然后，将外周血单个核细胞（PBMC）层收集到一个新的50毫升离心管中。加入最多50毫升的1×PBS对PBMC进行洗涤，随后在300 ×g下离心10分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于40毫升巨噬细胞培养基中。

将PBMCs置于Malassez计数板中计数后，转移实验所需数量的PBMCs至离心管中。以300 × g离心10分钟。吸除上清液，并按每1000万个PBMCs加入80 µL分选缓冲液的比例重悬细胞沉淀。随后，按每1000万个PBMCs加入20 µL CD14磁珠的比例加入CD14微珠。

充分混匀，在4摄氏度下避光孵育15分钟，并持续振荡。孵育结束后，每1000万个PBMCs加入1毫升分选缓冲液进行洗涤，然后同前法离心。随后吸除上清液，将沉淀物重新悬浮于每1亿个PBMCs加入500微升分选缓冲液中。

现在，将色谱柱置于分离器的磁场中。用三毫升分选缓冲液冲洗色谱柱以进行预处理。将细胞悬液加到色谱柱上。

然后收集流出液，其中含有未标记的细胞，必要时用于后续染色。用三毫升分选缓冲液洗涤柱子三次。注意不要让柱子变干。

然后，将收集管置于柱下并从分离器上取下。洗涤后，用移液器向柱中加入 5 毫升分选缓冲液。立即用力将活塞推入柱中，快速洗脱磁标记的细胞。

最后，在接种单核细胞并按照文本方案进行巨噬细胞极化之前，使用新的层析柱重复上述步骤。将单核细胞和巨噬细胞维持在氧浓度可控的环境中，以进行低氧条件下的分析。实验过程中应使用低氧工作站，以确保细胞始终处于设定的氧分压条件下。

在低氧分压条件下操作时，重要的是在工作站内配制所有培养基和洗涤缓冲液，并等待足够时间以使液体达到正确的氧分压。在适配的通风罩内用裂解缓冲液进行细胞裂解。每个样品上样量为相当于 300,000 个细胞的蛋白量，上样至 4–12% bis-tris 丙烯酰胺凝胶。

通过控制电泳迁移时间，使每个蛋白质样品分离成如图所示的六条凝胶条带。按照文本方案中的描述进行固定和染色后，用洁净的手术刀切下蛋白质条带。将每条切下的条带切成小块，然后放入500 µL离心管中。

现在，将凝胶切片在 200 微升 25 毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液中于 37 摄氏度下洗涤三次，每次 20 分钟，每次洗涤后弃去碳酸氢铵溶液。随后用 25 毫摩尔/升碳酸氢铵和乙腈混合液洗涤一次。接着，加入 200 微升 100% 乙腈对凝胶小块进行脱水处理，持续 10 分钟。

将每块凝胶与10毫摩尔DTT和25毫摩尔碳酸氢铵在56摄氏度下孵育45分钟。然后弃去DTT溶液，将凝胶块与55毫摩尔碘乙酰胺溶于25毫摩尔碳酸氢铵中，在室温下避光孵育35分钟。为终止烷基化反应，弃去使用过的溶液，并将每块凝胶与200微升含10毫摩尔DTT的25毫摩尔碳酸氢铵溶液在室温下孵育10分钟。

用 200 微升 25 毫摩尔的碳酸氢铵洗涤凝胶条。然后加入 200 微升 100%乙腈脱水 10 分钟。根据生产商说明书，用胰蛋白酶/Lys-C 混合物在 37 摄氏度下对蛋白质进行过夜消化。

在低吸附离心管中加入50 µL 50%乙腈，孵育15分钟，从胶块中提取肽段。随后加入50 µL 5%甲酸，孵育15分钟，再加入50 µL 100%乙腈，孵育15分钟。在低吸附离心管中收集并干燥每一份组分，以减少肽段吸附和样品损失。

将样本储存于 -80 摄氏度，直至按照文中的实验方案进行后续分析。图中显示的是通过磁珠分选 CD14 阳性单核细胞后，经流式细胞术评估的代表性纯度。分化后的人巨噬细胞相差显微图像显示，在培养 9 天后，两种不同极化状态下的细胞形态具有异质性。

展示了使用银染SDS-PAGE凝胶进行胶内酶解的一个示例。对细胞裂解后获得的蛋白质以及溶液中酶解后的蛋白质进行分析，结果显示裂解过程中无明显降解，且酶解效率良好。此处展示的是在质谱图中质荷比为597.29、电荷为+2的肽段所产生的碰撞诱导解离谱图的一个示例。

从该谱图中确定了相应的序列。分析后的最终结果是一张热图，通过差异表达的蛋白质对所有极化状态进行层次聚类。分析揭示了一组在3%氧气条件下所有极化状态中均过表达的蛋白质簇。

在进行该实验操作时，需首先明确将对新样本采用何种分馏方式，以便相应地调整实验方案。本研究所采用的蛋白质组学方法，是对近年来在巨噬细胞生物学极化研究领域中所使用的基因组学方法的有力补充。该技术建立后，为免疫学领域的研究人员探索人类及其他哺乳动物免疫细胞的不同活化状态提供了新的途径。

请注意，使用DTT可能存在危险，因此进行此操作时需要在合适的通风橱中进行。