低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

我们提出了一个协议, 以获得蛋白质组的特征的人类巨噬细胞, 并应用于确定低氧环境对巨噬细胞极化的影响。

因此，该方法有助于回答巨噬细胞生物学领域的关键问题，例如如何在蛋白质水平上描述不同环境下的活化状态。该技术的主要优点是，它提供了利用无标签定量方法获取人类巨噬细胞中许多蛋白质不同表达的机会。演示程序将是玛丽·马利耶和马加利法院从我的实验室。

首先，在两个50毫升离心管中加入15毫升密度梯度细胞分离溶液，使溶液在接收LRSC之前可以加热到室温。这一点至关重要，因为密度取决于温度。将 LRSC 清空到 50 毫升离心管中。

加入 1x PBS 至 50 毫升并混合。然后，非常缓慢地，在平衡密度梯度溶液的 15 毫升上添加 25 毫升的混合。注意不要在此步骤中混合阶段。

血液必须添加到密度梯度溶液上，而不受此阶段的任何干扰。在700 G下将两个离心管离心25分钟，无中断。在密度梯度离心结束时，从下到上层是红细胞和粒细胞，形成颗粒、密度梯度溶液相、PBMC 层和稀释血浆。

使用移液器，通过等离子相，无需吸气。然后，将PBMC层收集到新的50毫升离心管中。将高达 50 毫升 1x PBS 的 PBS 加入 PBMC，作为洗涤装置，并在 300 G 下离心 10 分钟。吸升液，并在 40 毫升巨噬细胞介质中重新悬浮颗粒。

在马拉塞兹腔室中将 PBMC 放在后，将进行实验所需的 PBMC 量转移到离心管中。在300G下将细胞离心10分钟，吸制上流液，每1000万PBMC分拣缓冲液的80微升中重新悬浮颗粒。然后，每 1000 万 PBMC 添加 20 微升 CD14 微珠。

混合好，在4摄氏度的不断搅拌下孵育15分钟。孵育后，每1000万PBMC添加1毫升分拣缓冲液作为洗涤步骤，并像以前一样离心。然后，吸升液，每1亿PBMC的500微升分拣缓冲液中重新悬浮颗粒。

现在，在分离器的磁场中放置一个列。使用三毫升的分拣缓冲器冲洗列来准备列。将单元格悬浮应用到列上。

然后收集流通过包含未标记的细胞，以便随后染色（如有必要）。用三毫升的分拣缓冲液清洗柱子三次。小心不要擦干你的列。

然后，在列下放置一个收集管，并将其从分隔符中卸下。洗涤后，移液器将五毫升的分拣缓冲液放入柱中。通过将柱塞牢固地推入柱体，立即冲洗出磁性标记的细胞。

最后，在电镀单核和执行文本协议中描述的巨噬细胞极化之前，用新列重复这些步骤。在氧气控制的环境中保持单核细胞和巨噬细胞，以进行缺氧状况分析。在实验过程中，使用缺氧工作站将细胞保持在所需的氧气部分压力下。

在低氧压力下工作时，在站下准备所有介质和洗涤缓冲液非常重要，并充分等待以获得液体中正确的部分压力。在经过调整的发动机罩下在缓冲器中执行细胞解解。将蛋白质当量为30万个细胞，每个样品在4-12%双三丙烯酰胺凝胶上。

控制电泳迁移的持续时间，使每个蛋白质样本分裂成六个凝胶带，如下所示。修复和染色后，如文本协议所述，用干净的手术刀切除蛋白质带。将每个切除带切成500微升管之前，先将每个切入带子切成骰子。

现在，在200微升25毫摩尔碳酸氢盐中洗三次凝胶片，在37摄氏度下洗涤20分钟，在每一步之间丢弃碳酸氢铵。遵循这一点与25毫摩尔碳酸氢铵和醋酸酯洗一洗。然后，用200微升100%乙酰三酯脱水凝胶片10分钟。

在56摄氏度下，用10毫摩尔DTT和25毫摩尔碳酸氢铵孵育每块45分钟。然后，丢弃DTT，在室温下在黑暗中用55毫摩尔碘多乙酰胺孵育凝胶片，在25毫摩尔碳酸氢铵中孵育35分钟。要停止烷基化，请丢弃用过的溶液，在室温下用200微升10毫摩尔DTT孵育10毫摩尔DTT，在室温下孵化10分钟。

用200微升25毫摩尔碳酸氢铵清洗凝胶片。然后，用200微升100%乙酰三酯脱水10分钟。根据制造商的说明，在37摄氏度下用三辛/Lys-C混合体在37摄氏度下隔夜消化蛋白质。

在低吸收管中加入50微升50%乙酰三叶酸，从凝胶片中提取产生的肽15分钟。加入50微升5%甲酸15分钟后，加入50微升100%乙酰三叶酸15分钟。在低吸收管中拉干每个分数，以限制多肽的吸收和样品损失。

将样品存放在 80 摄氏度，直到进一步分析，如文本协议中详细说明。此处显示的是流式细胞学在选择 CD14 正单核细胞后由流式细胞测量评估的代表性纯度。分化人类巨噬细胞的相位对比成像显示，经过九天的培养，两种不同极化获得的形态的异质性。

显示了使用银染色 SDS 页面凝胶的凝胶外消化示例。从细胞解解和溶液内消化后对蛋白质的评估表明，在分解过程中没有降解，消化效率也高。此处显示的是一个碰撞引起的分离光谱，该肽在MS光谱上的质量-电荷比为597.29，电荷为正2。

在此频谱中，确定了相应的序列。分析后的最后结果为使用分效应蛋白质表示所有极化状态的分层聚类的热图。分析显示，在3%氧条件下，所有极化中，一组蛋白质过度表达。

在尝试此过程时，重要的是要记住，您必须首先决定您将对新样本执行哪种分馏，以便相应地调整协议。使用此工作的蛋白质组学方法是对微噬细胞生物学极化研究领域近年来使用的基因组方法的补充。该技术开发后，为免疫学领域的研究人员探索人类和其他哺乳动物免疫细胞激活的各种状态铺平了道路。

不要忘记，使用 DTT 可能会很危险，因此您需要在经过调整的发动机罩下工作才能执行此过程。